乳腺良恶性肿瘤端粒酶的表达以及与p16、C-erbB-2的比较
作者：李建平 谢平 吴兵
单位：李建平(无锡市第一人民医院 214002)； 谢平(无锡市第一人民医院 214002)； 吴兵(无锡市第一人民医院 214002)
关键词：端粒酶；p16蛋白；C-erbB-2蛋白；乳腺癌
乳腺良恶性肿瘤端粒酶的表达以及与p16 摘 要：目的 探讨乳房恶性肿瘤组织中端粒酶的表达,端粒酶与肿瘤病理行为及其它癌基因和抑癌基因的关系。方法 应用端粒重复扩增方法(TRAP)对50例乳房良恶性肿瘤组织、配对癌旁组织及非癌组织进行端粒酶活性测定、p16缺失分析及C-erbB-2蛋白表达的检测,结合临床病理指标进行分析。结果 乳腺癌中端粒酶活性表达20/25。在乳腺癌中p16基因缺失、C-erbB-2蛋白阳性表达同时,端粒酶活性表达9/10～17/19。结论 端粒酶活性和肿瘤的关系密切,可作为乳腺癌诊断与预后判断的辅助指标。
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Study of expression and active mechanism of telomerase
LI Jiangping,XIE Ping,WU Bing,et al
(Wuxi First People′s Hospital,Wuxi 214002)
Abstract：Objective To study telomerase expression in breast malignant and benign tumors,the relationship between telomerase and pathologic behavior,oncogene or antioncogene.Methods The telomerase activity was determined with telomerase repeat amplification protocol in carcinoma,para-cancerous and non-cancer tissues in 50 patients with malignant or benign tumors.Combined with pathologic parameters,P16 deficit and C-erbB-2 protein expression were analyzed.Results The expression telomerase activity in breast cancer was 20/25.p16 gene deficit,positive expression of C-erbB-2 and telomerase activity were 9/10～17/19.Conclusion The results suggested that there is a significant relationship between telomerase activity and tumor,and it can be used as diagnostic and prognostic indicator in breast cancer.
, 百拇医药
Key words：Telomerase p16 gene C-erbB-2 protein Breast cancer▲
人们已经认识到癌变机理的某些分子机制,如癌基因活化学说、抑癌基因失活学说等,近年来对端粒、端粒酶的研究证明,端粒酶的激活和端粒的稳定是维持人类肿瘤无限增殖的重要因素,这已成为近年来肿瘤及生命科学研究的又一热点。本研究应用端粒重复扩增法(TRAP),检测人类乳腺肿瘤的端粒酶活性表达,并探讨与其它癌基因、抑癌基因的相互关系,这将有助于我们对肿瘤在分子水平的认识。
材料与方法
一、组织标本来源
50例经临床及病理确诊的乳腺良、恶性肿瘤患者主要来自于无锡市第一人民医院及其他无锡市三级医院。患者均为女性,年龄22～75岁。其中病理切片诊断为恶性肿瘤的患者25例,良性肿瘤者25例。收集上述经手术切除的新鲜肿瘤组织及配对癌旁组织(即距恶性肿瘤边缘1.5 cm以上)、非癌组织(即距良性肿瘤边缘1.5 cm 以上,且经病理诊断为正常组织,该组作为正常对照组)标本进行端粒酶活性定量测定,并对恶性肿瘤标本同时进行抑癌基因p16缺失分析及C-erbB-2癌基因蛋白表达的检测。全部标本另取一份送病理检查。
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二、端粒酶活性检测
使用端粒酶PCR-ELISA药盒(德国Boehringer Mannheim公司生产)检测端粒酶活性。主要步骤为(1)将离体后的新鲜标本约0.1 g剪碎后加入裂解液50 ml,充分混匀。离心后吸取上清液-80℃保存待检。(2)使用PCR扩增仪(Perkin Elmer 9 600),首先25℃30秒使引物TS延伸,90℃5分钟灭活端粒酶活性,接着按94℃30秒变性,50℃30秒退火,72℃90秒延伸,循环30次。上述步骤即为端粒重复放大的程序(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)[1]。(3)取PCR扩增产物5 μl经变性并与特异性的探针杂交后在微孔板上与抗地高辛-过氧化物酶、TMB底物等共同孵育后其结果用酶标检测仪(Bio-Rad550)测定波长450 nm及参考波长630nm处的吸光度,并根据A值＝A450-A630计算结果,此即为端粒酶PCR产物的定量分析。在实验中同时设立阳性及阴性对照。
, 百拇医药
三、p16基因缺失分析
1.取新鲜的乳房恶性肿瘤组织标本约50 μg充分剪碎,离心后沉淀中加入100 μ1 DNA提取液混匀,沸水浴10分钟,1 200 rpm离心后,取去上清液保存于-40℃待检。
2.PCR反应中,p16基因的外显子1及外显子2的引物由中山医科大学达安基因诊断中心提供。PCR反应条件为94℃3分钟预变性,然后按94℃45秒→72℃60秒共做35个循环,最后置72℃ 5分钟。每次实验均设有用正常模板做的正常对照。
3.PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳于紫外检测仪上观察。与正常对照比较,若在280bp或244bp处未出现橙黄色条带,则说明存在有p16基因外显子1或外显子2的缺失。
四、C-erbB-2癌基因蛋白表达的检测
所有乳房恶性肿瘤标本均经10%福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。兔抗C-erbB-2癌基因蛋白多克隆抗体及S-P法免疫试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司,操作方法参照试剂盒说明进行。C-erbB-2阳性为棕黄色,主要定位于细胞膜,阳性细胞数>10%的标本被判断为C-erbB-2阳性。
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五、统计学处理
各组端粒酶活性表达吸光度数据采用方差分析或t检验。
结 果
一、乳房良恶性肿瘤组织中端粒酶活性表达
采用TRAP方法对良、恶性乳房肿瘤组织及癌旁、正常对照组织中的端粒酶活性进行了分析,结果见表1。
表1 乳房良、恶性肿瘤中端粒酶的活性表达△(
±s,n＝25)
恶性肿瘤
良性肿瘤
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癌旁组织
正常对照
端粒酶阳性数
20
1
0
0
端粒酶活性
0.5946*
0.0423
0.0214
0.0114
(A值)
, 百拇医药
±0.3193
±0.0378
±0.0342
±0.0108
△吸光度；A值>0.2,即为阳性；*与其它各组相比较：P<0.01
二、乳腺癌端粒酶表达与各因素的关系
乳房恶性肿瘤组织的病理分期、淋巴结转移、p16基因缺失及C-erbB-2蛋白表达情况与组织中端粒酶活性表达的关系见表2。
表2 乳腺癌端粒酶表达与各因素的关系(±s)
, 百拇医药
例数
端粒酶
阳性数
端粒酶活性
(A值)
P值
乳腺恶性肿瘤分期
25
20
0.5946±0.3193
Ⅰ期
7
4
, 百拇医药
0.4130±0.5211
Ⅱ～Ⅲ期
16
14
0.5910±0.5001
>0.05
淋巴结转移
(+)
15
14
0.8123±0.4518
<0.05
, 百拇医药 (-)
10
5
0.4853±0.3978
抑癌基因p16
外显子缺失
(+)
10
9
0.8905±0.4946
<0.01
(-)
15
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10
0.4213±0.3857
原癌基因
C-erbB-2蛋白表达
(+)
19
17
0.7143±0.4472
<0.05
(-)
6
3
0.3987±0.4728
, 百拇医药
注：乳癌组中端粒酶活性表达,同时存在p16缺失及C-erbB-2蛋白过度表达,与对照组比较有显著差异(P<0.05～0.01)。 讨 论
1978年,Blackburn等[2]首先从嗜热四膜虫中分离出端粒,之后许多学者又分析检测了几十种低等真核生物的端粒,证实不同物种的端粒重复序列存在差异,但最常见的是在DNA链上5′～3′长度为5～8富含G碱基的序列。1988年Moyzis等[3]克隆了人类细胞的端粒,证实了人类细胞所有染色体的两端都带有(TTAGGG)n的重复序列,由于端粒酶在恶性肿瘤中是有活性而在良性肿瘤及正常组织中失活。因此,端粒酶活性检测有望在肿瘤的诊断、指导治疗方案及判断预后方面提供帮助。目前此方面的研究已成为肿瘤及生命科学的又一热点[4～8]。
本研究采用TRAP方法对50例乳腺良恶性肿瘤的端粒酶活性进行检测,结果发现：端粒酶表达在恶性肿瘤与良性肿瘤及正常对照有显著性差异(P<0.01)。恶性肿瘤组织中端粒酶表达与其它各组对照有显著性差异(P<0.01)。表明端粒酶活性检测在乳腺癌的诊断中可能具有重要价值,乳腺癌伴淋巴结转移14/15粒酶活性表达可能与肿瘤恶性程度有关。从肿瘤TNM分期来看,Ⅰ期乳癌阳性率4/7,Ⅱ～Ⅲ期乳癌阳性率14/16,统计学处理无显著性差异,可能和例数少有关,但从绝对数上看,TNM分期愈高,阳性率愈高,由此推测端粒酶活性表达可能与肿瘤恶性程度及病程有关。因此,端粒酶活性检测可作为判断预后的标志。
, 百拇医药
本研究还发现恶性肿瘤组中,p16基因缺失,端粒酶活性达9/10阳性；C-erbB-2蛋白阳性表达,端粒酶活性表达17/19,与对照组比较有显著性差异(P<0.05～0.01),说明在癌变形成及端粒酶激活的分子机制中端粒酶活性调控与其它癌基因过度表达及抑癌基因的失活有密切关系,因此亦可作为乳腺癌的标记物,帮助判断预后及指导辅助治疗。■
参考文献：
[1]Kim NW,Pintyszek MA,Prowse KK,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,256：2011-2016.
[2]Blackburn EH,Gall JG.A tandemly repeated sequence at termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena.J Mol Biol,1978,120：33-53.
, 百拇医药
[3]Moyzis RK,Buckingham JM,Cram LS, et al.A highly conserved repetitive DNA sequence (TTAGGG)n present at the telomeres of human chromosomes.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85：6622-6626.
[4]Greider CW,Blackburn EH.Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.Cell,1985,43：405-413.
[5]Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.Cell,1989,59：521-529.
, 百拇医药
[6]Shay JW,Wright WE,Werbin H.Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization.Biochim Biophys Acta,1991,1072：1-7.
[7]Rhyu MS.Telomeres,telomerase,and immortality.J Nati Cancer Inst,1995,87：884-894.
[8]Feng j,Funk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomerase.Science,1995,269：1236-1241.
收稿日期：1999-08-02
修稿日期：1999-09-29, 百拇医药
单位：李建平(无锡市第一人民医院 214002)； 谢平(无锡市第一人民医院 214002)； 吴兵(无锡市第一人民医院 214002)
关键词：端粒酶；p16蛋白；C-erbB-2蛋白；乳腺癌
乳腺良恶性肿瘤端粒酶的表达以及与p16 摘 要：目的 探讨乳房恶性肿瘤组织中端粒酶的表达,端粒酶与肿瘤病理行为及其它癌基因和抑癌基因的关系。方法 应用端粒重复扩增方法(TRAP)对50例乳房良恶性肿瘤组织、配对癌旁组织及非癌组织进行端粒酶活性测定、p16缺失分析及C-erbB-2蛋白表达的检测,结合临床病理指标进行分析。结果 乳腺癌中端粒酶活性表达20/25。在乳腺癌中p16基因缺失、C-erbB-2蛋白阳性表达同时,端粒酶活性表达9/10～17/19。结论 端粒酶活性和肿瘤的关系密切,可作为乳腺癌诊断与预后判断的辅助指标。
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Study of expression and active mechanism of telomerase
LI Jiangping,XIE Ping,WU Bing,et al
(Wuxi First People′s Hospital,Wuxi 214002)
Abstract：Objective To study telomerase expression in breast malignant and benign tumors,the relationship between telomerase and pathologic behavior,oncogene or antioncogene.Methods The telomerase activity was determined with telomerase repeat amplification protocol in carcinoma,para-cancerous and non-cancer tissues in 50 patients with malignant or benign tumors.Combined with pathologic parameters,P16 deficit and C-erbB-2 protein expression were analyzed.Results The expression telomerase activity in breast cancer was 20/25.p16 gene deficit,positive expression of C-erbB-2 and telomerase activity were 9/10～17/19.Conclusion The results suggested that there is a significant relationship between telomerase activity and tumor,and it can be used as diagnostic and prognostic indicator in breast cancer.
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Key words：Telomerase p16 gene C-erbB-2 protein Breast cancer▲
人们已经认识到癌变机理的某些分子机制,如癌基因活化学说、抑癌基因失活学说等,近年来对端粒、端粒酶的研究证明,端粒酶的激活和端粒的稳定是维持人类肿瘤无限增殖的重要因素,这已成为近年来肿瘤及生命科学研究的又一热点。本研究应用端粒重复扩增法(TRAP),检测人类乳腺肿瘤的端粒酶活性表达,并探讨与其它癌基因、抑癌基因的相互关系,这将有助于我们对肿瘤在分子水平的认识。
材料与方法
一、组织标本来源
50例经临床及病理确诊的乳腺良、恶性肿瘤患者主要来自于无锡市第一人民医院及其他无锡市三级医院。患者均为女性,年龄22～75岁。其中病理切片诊断为恶性肿瘤的患者25例,良性肿瘤者25例。收集上述经手术切除的新鲜肿瘤组织及配对癌旁组织(即距恶性肿瘤边缘1.5 cm以上)、非癌组织(即距良性肿瘤边缘1.5 cm 以上,且经病理诊断为正常组织,该组作为正常对照组)标本进行端粒酶活性定量测定,并对恶性肿瘤标本同时进行抑癌基因p16缺失分析及C-erbB-2癌基因蛋白表达的检测。全部标本另取一份送病理检查。
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二、端粒酶活性检测
使用端粒酶PCR-ELISA药盒(德国Boehringer Mannheim公司生产)检测端粒酶活性。主要步骤为(1)将离体后的新鲜标本约0.1 g剪碎后加入裂解液50 ml,充分混匀。离心后吸取上清液-80℃保存待检。(2)使用PCR扩增仪(Perkin Elmer 9 600),首先25℃30秒使引物TS延伸,90℃5分钟灭活端粒酶活性,接着按94℃30秒变性,50℃30秒退火,72℃90秒延伸,循环30次。上述步骤即为端粒重复放大的程序(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)[1]。(3)取PCR扩增产物5 μl经变性并与特异性的探针杂交后在微孔板上与抗地高辛-过氧化物酶、TMB底物等共同孵育后其结果用酶标检测仪(Bio-Rad550)测定波长450 nm及参考波长630nm处的吸光度,并根据A值＝A450-A630计算结果,此即为端粒酶PCR产物的定量分析。在实验中同时设立阳性及阴性对照。
, 百拇医药
三、p16基因缺失分析
1.取新鲜的乳房恶性肿瘤组织标本约50 μg充分剪碎,离心后沉淀中加入100 μ1 DNA提取液混匀,沸水浴10分钟,1 200 rpm离心后,取去上清液保存于-40℃待检。
2.PCR反应中,p16基因的外显子1及外显子2的引物由中山医科大学达安基因诊断中心提供。PCR反应条件为94℃3分钟预变性,然后按94℃45秒→72℃60秒共做35个循环,最后置72℃ 5分钟。每次实验均设有用正常模板做的正常对照。
3.PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳于紫外检测仪上观察。与正常对照比较,若在280bp或244bp处未出现橙黄色条带,则说明存在有p16基因外显子1或外显子2的缺失。
四、C-erbB-2癌基因蛋白表达的检测
所有乳房恶性肿瘤标本均经10%福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。兔抗C-erbB-2癌基因蛋白多克隆抗体及S-P法免疫试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司,操作方法参照试剂盒说明进行。C-erbB-2阳性为棕黄色,主要定位于细胞膜,阳性细胞数>10%的标本被判断为C-erbB-2阳性。
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五、统计学处理
各组端粒酶活性表达吸光度数据采用方差分析或t检验。
结 果
一、乳房良恶性肿瘤组织中端粒酶活性表达
采用TRAP方法对良、恶性乳房肿瘤组织及癌旁、正常对照组织中的端粒酶活性进行了分析,结果见表1。
表1 乳房良、恶性肿瘤中端粒酶的活性表达△(
±s,n＝25)恶性肿瘤
良性肿瘤
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癌旁组织
正常对照
端粒酶阳性数
20
1
0
0
端粒酶活性
0.5946*
0.0423
0.0214
0.0114
(A值)
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±0.3193
±0.0378
±0.0342
±0.0108
△吸光度；A值>0.2,即为阳性；*与其它各组相比较：P<0.01
二、乳腺癌端粒酶表达与各因素的关系
乳房恶性肿瘤组织的病理分期、淋巴结转移、p16基因缺失及C-erbB-2蛋白表达情况与组织中端粒酶活性表达的关系见表2。
表2 乳腺癌端粒酶表达与各因素的关系(
±s), 百拇医药
例数
端粒酶
阳性数
端粒酶活性
(A值)
P值
乳腺恶性肿瘤分期
25
20
0.5946±0.3193
Ⅰ期
7
4
, 百拇医药
0.4130±0.5211
Ⅱ～Ⅲ期
16
14
0.5910±0.5001
>0.05
淋巴结转移
(+)
15
14
0.8123±0.4518
<0.05
, 百拇医药 (-)
10
5
0.4853±0.3978
抑癌基因p16
外显子缺失
(+)
10
9
0.8905±0.4946
<0.01
(-)
15
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10
0.4213±0.3857
原癌基因
C-erbB-2蛋白表达
(+)
19
17
0.7143±0.4472
<0.05
(-)
6
3
0.3987±0.4728
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注：乳癌组中端粒酶活性表达,同时存在p16缺失及C-erbB-2蛋白过度表达,与对照组比较有显著差异(P<0.05～0.01)。 讨 论
1978年,Blackburn等[2]首先从嗜热四膜虫中分离出端粒,之后许多学者又分析检测了几十种低等真核生物的端粒,证实不同物种的端粒重复序列存在差异,但最常见的是在DNA链上5′～3′长度为5～8富含G碱基的序列。1988年Moyzis等[3]克隆了人类细胞的端粒,证实了人类细胞所有染色体的两端都带有(TTAGGG)n的重复序列,由于端粒酶在恶性肿瘤中是有活性而在良性肿瘤及正常组织中失活。因此,端粒酶活性检测有望在肿瘤的诊断、指导治疗方案及判断预后方面提供帮助。目前此方面的研究已成为肿瘤及生命科学的又一热点[4～8]。
本研究采用TRAP方法对50例乳腺良恶性肿瘤的端粒酶活性进行检测,结果发现：端粒酶表达在恶性肿瘤与良性肿瘤及正常对照有显著性差异(P<0.01)。恶性肿瘤组织中端粒酶表达与其它各组对照有显著性差异(P<0.01)。表明端粒酶活性检测在乳腺癌的诊断中可能具有重要价值,乳腺癌伴淋巴结转移14/15粒酶活性表达可能与肿瘤恶性程度有关。从肿瘤TNM分期来看,Ⅰ期乳癌阳性率4/7,Ⅱ～Ⅲ期乳癌阳性率14/16,统计学处理无显著性差异,可能和例数少有关,但从绝对数上看,TNM分期愈高,阳性率愈高,由此推测端粒酶活性表达可能与肿瘤恶性程度及病程有关。因此,端粒酶活性检测可作为判断预后的标志。
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本研究还发现恶性肿瘤组中,p16基因缺失,端粒酶活性达9/10阳性；C-erbB-2蛋白阳性表达,端粒酶活性表达17/19,与对照组比较有显著性差异(P<0.05～0.01),说明在癌变形成及端粒酶激活的分子机制中端粒酶活性调控与其它癌基因过度表达及抑癌基因的失活有密切关系,因此亦可作为乳腺癌的标记物,帮助判断预后及指导辅助治疗。■
参考文献：
[1]Kim NW,Pintyszek MA,Prowse KK,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,256：2011-2016.
[2]Blackburn EH,Gall JG.A tandemly repeated sequence at termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena.J Mol Biol,1978,120：33-53.
, 百拇医药
[3]Moyzis RK,Buckingham JM,Cram LS, et al.A highly conserved repetitive DNA sequence (TTAGGG)n present at the telomeres of human chromosomes.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85：6622-6626.
[4]Greider CW,Blackburn EH.Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.Cell,1985,43：405-413.
[5]Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.Cell,1989,59：521-529.
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[6]Shay JW,Wright WE,Werbin H.Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization.Biochim Biophys Acta,1991,1072：1-7.
[7]Rhyu MS.Telomeres,telomerase,and immortality.J Nati Cancer Inst,1995,87：884-894.
[8]Feng j,Funk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomerase.Science,1995,269：1236-1241.
收稿日期：1999-08-02
修稿日期：1999-09-29, 百拇医药