氧化修饰低密度脂蛋白对血管内皮细胞一氧化氮合成的影响
作者：杜怡峰 孙圣刚 童萼塘 申黎青
单位：杜怡峰(青岛大学医学院附属医院神经内科，青岛 266003)；孙圣刚 童萼塘(同济医科大学附属协和医院神经内科)；申黎青(青岛大学医学院附属医院神经内科，青岛 266003)
关键词：氧化修饰低密度脂蛋白；内皮细胞；一氧化氮；动脉粥样硬化
中国老年学杂志000227摘 要 目的 探讨氧化修饰低密度脂蛋白(OX-LDL)对血管内皮细胞合成一氧化氮(NO)的影响，以阐明OX-LDL在动脉粥样硬化(AS)发生中的作用。方法 在内皮细胞培养基中分别加入0、50、100、150 μg/ml的低密度脂蛋白(LDL)和OX-LDL，37 ℃下温育24 h，然后采用镉柱还原比色法检测条件培养基中NO的含量，采用化学发光法检测内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)的活性。结果 与LDL组和对照组比较，OX-LDL组明显减少内皮细胞NO产生量和抑制NOS活性。结论 OX-LDL能够抑制内皮细胞合成NO。
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一氧化氮(NO)是一种内源性舒张因子，主要由血管内皮细胞产生，它不仅参与调节血管张力，而且还对血小板聚集、单核-巨噬细胞浸润以及血管平滑肌细胞增殖等动脉粥样硬化(AS)形成的各个环节都有明显的抑制作用〔1～3〕。近年的研究表明，氧化修饰低密度脂蛋白(OX-LDL)在AS形成中起着重要作用〔4〕，但其致AS的主要机制尚不完全清楚。我们以培养的血管内皮细胞(VEC)为模型，观察OX-LDL对VEC一氧化氮合酶(NOS)活性及NO产生量的影响，旨在探讨OX-LDL致AS的作用机制。
1 材料和方法
1.1 细胞培养 ECV-304人脐静脉内皮细胞株(武汉大学中国动植物细胞保藏中心提供)经0.25%胰蛋白酶消化后，用含有15%新生小牛血清的DMEM培养基(GIBCO，USA)制成细胞悬液，接种在培养瓶内，置5%CO2培养箱中37 ℃培养，每2 d更换培养液一次。生长融合的细胞经0.25%胰蛋白酶消化分离细胞，进行传代培养。
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1.2 低密度脂蛋白的分离与氧化修饰 用超速离心法从正常人外周血中分离低密度脂蛋白(LDL)，蛋白含量按Lowry法检测〔5，6〕。
将LDL提取液分为二份，一份加EDTA(终浓度200 mmol/L)保护，4 ℃放置，为非修饰的LDL。另一份加入终浓度为10 μmol/l的CuSO4，置37 ℃保温24 h，使之氧化成OX-LDL组，在0.9%NaCl冰箱保存，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳观察电泳迁移率〔7〕。
1.3 实验分组及标本采集 取生长融合的内皮细胞，按传代法制备细胞悬液，分别接种于8个 中号培养皿中，细胞密度为2×104/cm2，用DMEM完全培养液，置37 ℃5%CO2培养箱内培养，待细胞呈亚融合状态时，倾去培养液，用PBS洗涤细胞后，换用含5%新生小牛血清的培养液，分LDL组和OX-LDL组，每组分别加入不同浓度的LDL和OX-LDL，终浓度分别为0、50、100、150 μg脂蛋白/ml培养液。两组继续培养24 h后，首先收集培养皿中培养液，然后按常规胰蛋白酶消化收集内皮细胞，PBS调细胞浓度为106个/ml，待测。重复实验三次。
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1.4 各指标测定
1.4.1 NO测定〔8〕 采用镉柱还原比色法，以NO代谢产物NO-3/NO-2含量反映上清液NO含量。NO氧化生成NO-3和NO-2，NO-3经镉柱还原为NO-2，NO-2与Griess试剂反应生成粉红色化合物，然后进行比色、计算结果。收取条件培养液，1 000 r/min离心10 min，取各上清，以3体积的待测样品和1体积的Griess试剂混合，在540 nm波长处测OD值，样品NO-2浓度从已知浓度亚硝酸钠标准曲线上比较得出。
1.4.2 NOS活性测定〔9〕 采用化学发光法，取细胞悬液200 μl和酶反应液(含1 mmol/l NADPH，1 mmol/L二硫苏糖醇，1.25 mmol/L CaCl2，10 μg/ml CaM，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L L-精氨酸等)300 μl于发光管中混匀，37 ℃温浴15 min后，将发光管置于LB1251型发光仪测试室内，然后从发光仪加样孔注入400 μl发光启动剂，记录6 s累计发光值。根据样品所测得的发光值，从NO发光标准曲线上查出所相当的NO浓度，然后根据样品量及样品中的蛋白质含量及酶触反应时间计算出NOS活性。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示，组间差异进行t检验。
2 结 果
2.1 OX-LDL聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 经氧化修饰后的LDL因所含电荷增多，电泳迁移率将明显增大。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示OX-LDL泳动距离比LDL大(图1)。表明本实验所用的LDL和OX-LDL均符合要求。
2.2 不同浓度LDL和OX-LDL对内皮细胞NO产生量的影响 见表1。与对照组(0 μg/ml)相比，LDL组和OX-LDL组NO产生量均有减少，经统计学处理，OX-LDL组与对照组有显著性差异，而LDL组NO产生量虽有下降，但与对照组比较未见显著差异(P>0.05)。此外，与同一浓度的LDL组相比，OX-LDL组NO产生量亦显著下降(P<0.05)。
, 百拇医药
图1 天然和氧化修饰LDL聚丙烯酰胺凝胶电泳
表1 LDL和OX-LDL对内皮细胞NO产生的影响 LDL与OX-LDL浓度
(μg/ml)
NO(μmol/L)
LDL
OX-LDL
0
8.27±0.78
8.38±0.48
50
8613±0.87
, 百拇医药
5.98±1.011)3)
100
7.26±1.44
4.54±0.672)3)
150
6.87±0.91
4.11±0.872)3)
与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与LDL组比较：3)P<0.05
2.3 不同浓度LDL和OX-LDL对内皮细胞NOS活性的影响 见表2。经LDL和OX-LDL处理后的内皮细胞NOS活性均有降低，与对照组(0 μg/ml)比较，OX-LDL组NOS活性明显降低(P<0.05)，并且随着剂量的增加而活性逐渐下降；LDL组虽有降低，但与对照组之间未见显著性差异(P>0.05)。比较同一浓度的LDL和OX-LDL对内皮细胞NOS活性的影响。发现OX-LDL组NOS活性显著低于LDL组。表2 LDL和OX-LDL对内皮细胞NOS活性的影响 LDL与OX-LDL浓度
, 百拇医药
(μg/ml)
NOS(nmol NO/106cells*h)
LDL
OX-LDL
0
92.8±7.8
88.6±9.0
50
84.6±12.2
53.3±8.41)2)
100
, 百拇医药 78.5±9.6
45.5±7.01)3)
150
76.7±11.8
38.2±5.91)3)
与对照组比较：1)P<0.05；与LDL组比较：2)P<0.05，3)P<0.01
3 讨 论
NO是一种新型的生物信息传递体，由L-精氨酸在NOS作用下生成，其半衰期极短，约3～30 s，并且化学性质活泼、不稳定，可迅速与机体内氧及超氧阴离子反应，生成NO-3和NO-2。此外，它还是一种嗜脂性生物，很容易通过细胞生物膜，进入靶细胞与鸟苷酸环化酶中的Fe2+结合使之激活，形成环磷酸鸟苷(cGMP)，发挥生物学效应。近年发现，NO除了调节血管张力外，还具有复杂的生理病理作用，尤其是在AD的发生和发展中起重要作用。大量的实验证据表明，无论是增加NO的合成和释放，还是外源性的NO供体，都对平滑肌细胞的增殖有明显的抑制作用〔3〕，并认为NO是通过增加细胞内cGMP含量从而激活cGMP依赖性蛋白激酶，介导其抗平滑细胞增殖作用的。另外，NO在调节血小板功能中也起着重要作用，刺激内皮细胞合成释放的NO不仅可减少体内血小板的聚集，还可抑制血小板粘附体外培养的内皮细胞；外源性NO供体以及NO合成前体L-精氨酸均能抑制内皮细胞损伤所引起的血小板粘附、聚集及血栓形成〔1〕。NO还是体内白细胞粘附、浸润血管壁的强大抑制剂，不仅内皮细胞合成、释放的NO可抑制血流中白细胞的粘附，外源性的NO也有抑制白细胞的粘附作用〔2，10〕，用NOS抑制剂阻断实验动物的NO合成则可使白细胞粘附增加。
, 百拇医药
近来证实，OX-LDL可抑制离体动脉环和培养的内皮细胞产生NO的功能。这种抑制作用在OX-LDL孵育后1 h开始，并随着OX-LDL的孵育而持续存在〔11〕。我们的结果表明，50、100、150 μg/ml的OX-LDL作用于内皮24 h后能显著减少内皮细胞NO的产生量，且随着剂量的增加抑制作用逐渐增强，而对照组和LDL组的抑制作用则不明显，与文献报道相符；提示OX-LDL对内皮细胞NO产生的抑制作用可能是其致AS的一个重要途径。
本实验还发现，50～150 μg/ml的OX-LDL对培养的内皮细胞NO活性具有明显的抑制作用，与对照组和LDL组比较均具有显著性差异。Liao等〔12〕的研究表明，培养的内皮细胞的OX-LDL孵育后，在0～72 h内NOS mRNA稳态水平呈进行性下降，mRNA半衰期显著缩短，NO活性明显降低，支持本实验结果。因此，我们认为OX-LDL对内皮细胞产生NO的抑制作用，可能与其影响内皮细胞NOS活性有关。 作者简介：杜怡峰，男，37岁，主治医师，博士，从事脑血管疾病研究
, 百拇医药
参考文献
1，Basseneg E.Antiplatelet effects of endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide donors.Eur Heart J，1991；12(Suppl E)：12
2，Lefer AM，Ma XL.Decreased basal nitric oxide release in hypercholesterolemia increase neutrophil adherence to rabbit coronary artery endothelium.Arterioscler Throms，1993；13(6)：771
3，Scott-Burden T，vanhoutte Pm.The endothelium as a regulator of vascular smooth muscle proliferation.Circulation，1993；87(suppl v)：V51
, 百拇医药
4，teinberg D，Parthasarathy S.Carow TE et al.beyond cholesterolmodifications of low-density lipoprotein that increase it's atherogenicity.N Engl J Med，1989；320：915
5，王淳本，宗义强，吴万生 et al.两步超速离心法分离大量血浆极低密度脂蛋白及低密度脂蛋白.同济医科大学学报，1995；24：169
6，Lowry Oh，Rosenbrough NJ,Farr AL et al.Protein meaure with the folin pheno reagent.J Biol Chem，1951；193：265
7，程 娉，周 玖，杨仕林.电泳纯的LDL的快速提取及Cu2+对其氧化修饰的影响.第一军医大学学报，1991；11(4)：292
, 百拇医药
8，Green LC，Wagner DA,Gligowski J.Analysis of nitrate,nitrite and 15N nitrate in biological fluids.Anal Biochem，1982；126：131
9，徐顺清，舒柏华，周宜开 et al.化学发光法测定脑组织中一氧化氮合成酶活性.中国卫生检验杂志，1997；7(3)：131
10，Kubes P，Suzuki M,Granger DN.Nitric oxide:An endogenous modulator of leukocyte adhesion.Proc Natl Acad Sci USA，1991；88(11)：4651
11，Myers PR，Wright TF,Tanner MA et al.The effects of native LDL and oxidized LDL on EDRF bioactivity and nitric oxide production in vascular endothelium.J Lab Clin Med，1994；124：672
12，Liao JK，Shin WS,Lee WY et al.oxidized low-density lipoprotein decreases the expression of endothelial nitric oxide synthase.JBiol Chem，1995；270(1)：319
收稿日期：1999-01-17
修回日期：1999-03-03, 百拇医药
单位：杜怡峰(青岛大学医学院附属医院神经内科，青岛 266003)；孙圣刚 童萼塘(同济医科大学附属协和医院神经内科)；申黎青(青岛大学医学院附属医院神经内科，青岛 266003)
关键词：氧化修饰低密度脂蛋白；内皮细胞；一氧化氮；动脉粥样硬化
中国老年学杂志000227摘 要 目的 探讨氧化修饰低密度脂蛋白(OX-LDL)对血管内皮细胞合成一氧化氮(NO)的影响，以阐明OX-LDL在动脉粥样硬化(AS)发生中的作用。方法 在内皮细胞培养基中分别加入0、50、100、150 μg/ml的低密度脂蛋白(LDL)和OX-LDL，37 ℃下温育24 h，然后采用镉柱还原比色法检测条件培养基中NO的含量，采用化学发光法检测内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)的活性。结果 与LDL组和对照组比较，OX-LDL组明显减少内皮细胞NO产生量和抑制NOS活性。结论 OX-LDL能够抑制内皮细胞合成NO。
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一氧化氮(NO)是一种内源性舒张因子，主要由血管内皮细胞产生，它不仅参与调节血管张力，而且还对血小板聚集、单核-巨噬细胞浸润以及血管平滑肌细胞增殖等动脉粥样硬化(AS)形成的各个环节都有明显的抑制作用〔1～3〕。近年的研究表明，氧化修饰低密度脂蛋白(OX-LDL)在AS形成中起着重要作用〔4〕，但其致AS的主要机制尚不完全清楚。我们以培养的血管内皮细胞(VEC)为模型，观察OX-LDL对VEC一氧化氮合酶(NOS)活性及NO产生量的影响，旨在探讨OX-LDL致AS的作用机制。
1 材料和方法
1.1 细胞培养 ECV-304人脐静脉内皮细胞株(武汉大学中国动植物细胞保藏中心提供)经0.25%胰蛋白酶消化后，用含有15%新生小牛血清的DMEM培养基(GIBCO，USA)制成细胞悬液，接种在培养瓶内，置5%CO2培养箱中37 ℃培养，每2 d更换培养液一次。生长融合的细胞经0.25%胰蛋白酶消化分离细胞，进行传代培养。
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1.2 低密度脂蛋白的分离与氧化修饰 用超速离心法从正常人外周血中分离低密度脂蛋白(LDL)，蛋白含量按Lowry法检测〔5，6〕。
将LDL提取液分为二份，一份加EDTA(终浓度200 mmol/L)保护，4 ℃放置，为非修饰的LDL。另一份加入终浓度为10 μmol/l的CuSO4，置37 ℃保温24 h，使之氧化成OX-LDL组，在0.9%NaCl冰箱保存，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳观察电泳迁移率〔7〕。
1.3 实验分组及标本采集 取生长融合的内皮细胞，按传代法制备细胞悬液，分别接种于8个 中号培养皿中，细胞密度为2×104/cm2，用DMEM完全培养液，置37 ℃5%CO2培养箱内培养，待细胞呈亚融合状态时，倾去培养液，用PBS洗涤细胞后，换用含5%新生小牛血清的培养液，分LDL组和OX-LDL组，每组分别加入不同浓度的LDL和OX-LDL，终浓度分别为0、50、100、150 μg脂蛋白/ml培养液。两组继续培养24 h后，首先收集培养皿中培养液，然后按常规胰蛋白酶消化收集内皮细胞，PBS调细胞浓度为106个/ml，待测。重复实验三次。
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1.4 各指标测定
1.4.1 NO测定〔8〕 采用镉柱还原比色法，以NO代谢产物NO-3/NO-2含量反映上清液NO含量。NO氧化生成NO-3和NO-2，NO-3经镉柱还原为NO-2，NO-2与Griess试剂反应生成粉红色化合物，然后进行比色、计算结果。收取条件培养液，1 000 r/min离心10 min，取各上清，以3体积的待测样品和1体积的Griess试剂混合，在540 nm波长处测OD值，样品NO-2浓度从已知浓度亚硝酸钠标准曲线上比较得出。
1.4.2 NOS活性测定〔9〕 采用化学发光法，取细胞悬液200 μl和酶反应液(含1 mmol/l NADPH，1 mmol/L二硫苏糖醇，1.25 mmol/L CaCl2，10 μg/ml CaM，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L L-精氨酸等)300 μl于发光管中混匀，37 ℃温浴15 min后，将发光管置于LB1251型发光仪测试室内，然后从发光仪加样孔注入400 μl发光启动剂，记录6 s累计发光值。根据样品所测得的发光值，从NO发光标准曲线上查出所相当的NO浓度，然后根据样品量及样品中的蛋白质含量及酶触反应时间计算出NOS活性。
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1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示，组间差异进行t检验。
2 结 果
2.1 OX-LDL聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 经氧化修饰后的LDL因所含电荷增多，电泳迁移率将明显增大。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示OX-LDL泳动距离比LDL大(图1)。表明本实验所用的LDL和OX-LDL均符合要求。
2.2 不同浓度LDL和OX-LDL对内皮细胞NO产生量的影响 见表1。与对照组(0 μg/ml)相比，LDL组和OX-LDL组NO产生量均有减少，经统计学处理，OX-LDL组与对照组有显著性差异，而LDL组NO产生量虽有下降，但与对照组比较未见显著差异(P>0.05)。此外，与同一浓度的LDL组相比，OX-LDL组NO产生量亦显著下降(P<0.05)。
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图1 天然和氧化修饰LDL聚丙烯酰胺凝胶电泳
表1 LDL和OX-LDL对内皮细胞NO产生的影响 LDL与OX-LDL浓度
(μg/ml)
NO(μmol/L)
LDL
OX-LDL
0
8.27±0.78
8.38±0.48
50
8613±0.87
, 百拇医药
5.98±1.011)3)
100
7.26±1.44
4.54±0.672)3)
150
6.87±0.91
4.11±0.872)3)
与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与LDL组比较：3)P<0.05
2.3 不同浓度LDL和OX-LDL对内皮细胞NOS活性的影响 见表2。经LDL和OX-LDL处理后的内皮细胞NOS活性均有降低，与对照组(0 μg/ml)比较，OX-LDL组NOS活性明显降低(P<0.05)，并且随着剂量的增加而活性逐渐下降；LDL组虽有降低，但与对照组之间未见显著性差异(P>0.05)。比较同一浓度的LDL和OX-LDL对内皮细胞NOS活性的影响。发现OX-LDL组NOS活性显著低于LDL组。表2 LDL和OX-LDL对内皮细胞NOS活性的影响 LDL与OX-LDL浓度
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(μg/ml)
NOS(nmol NO/106cells*h)
LDL
OX-LDL
0
92.8±7.8
88.6±9.0
50
84.6±12.2
53.3±8.41)2)
100
, 百拇医药 78.5±9.6
45.5±7.01)3)
150
76.7±11.8
38.2±5.91)3)
与对照组比较：1)P<0.05；与LDL组比较：2)P<0.05，3)P<0.01
3 讨 论
NO是一种新型的生物信息传递体，由L-精氨酸在NOS作用下生成，其半衰期极短，约3～30 s，并且化学性质活泼、不稳定，可迅速与机体内氧及超氧阴离子反应，生成NO-3和NO-2。此外，它还是一种嗜脂性生物，很容易通过细胞生物膜，进入靶细胞与鸟苷酸环化酶中的Fe2+结合使之激活，形成环磷酸鸟苷(cGMP)，发挥生物学效应。近年发现，NO除了调节血管张力外，还具有复杂的生理病理作用，尤其是在AD的发生和发展中起重要作用。大量的实验证据表明，无论是增加NO的合成和释放，还是外源性的NO供体，都对平滑肌细胞的增殖有明显的抑制作用〔3〕，并认为NO是通过增加细胞内cGMP含量从而激活cGMP依赖性蛋白激酶，介导其抗平滑细胞增殖作用的。另外，NO在调节血小板功能中也起着重要作用，刺激内皮细胞合成释放的NO不仅可减少体内血小板的聚集，还可抑制血小板粘附体外培养的内皮细胞；外源性NO供体以及NO合成前体L-精氨酸均能抑制内皮细胞损伤所引起的血小板粘附、聚集及血栓形成〔1〕。NO还是体内白细胞粘附、浸润血管壁的强大抑制剂，不仅内皮细胞合成、释放的NO可抑制血流中白细胞的粘附，外源性的NO也有抑制白细胞的粘附作用〔2，10〕，用NOS抑制剂阻断实验动物的NO合成则可使白细胞粘附增加。
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近来证实，OX-LDL可抑制离体动脉环和培养的内皮细胞产生NO的功能。这种抑制作用在OX-LDL孵育后1 h开始，并随着OX-LDL的孵育而持续存在〔11〕。我们的结果表明，50、100、150 μg/ml的OX-LDL作用于内皮24 h后能显著减少内皮细胞NO的产生量，且随着剂量的增加抑制作用逐渐增强，而对照组和LDL组的抑制作用则不明显，与文献报道相符；提示OX-LDL对内皮细胞NO产生的抑制作用可能是其致AS的一个重要途径。
本实验还发现，50～150 μg/ml的OX-LDL对培养的内皮细胞NO活性具有明显的抑制作用，与对照组和LDL组比较均具有显著性差异。Liao等〔12〕的研究表明，培养的内皮细胞的OX-LDL孵育后，在0～72 h内NOS mRNA稳态水平呈进行性下降，mRNA半衰期显著缩短，NO活性明显降低，支持本实验结果。因此，我们认为OX-LDL对内皮细胞产生NO的抑制作用，可能与其影响内皮细胞NOS活性有关。 作者简介：杜怡峰，男，37岁，主治医师，博士，从事脑血管疾病研究
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参考文献
1，Basseneg E.Antiplatelet effects of endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide donors.Eur Heart J，1991；12(Suppl E)：12
2，Lefer AM，Ma XL.Decreased basal nitric oxide release in hypercholesterolemia increase neutrophil adherence to rabbit coronary artery endothelium.Arterioscler Throms，1993；13(6)：771
3，Scott-Burden T，vanhoutte Pm.The endothelium as a regulator of vascular smooth muscle proliferation.Circulation，1993；87(suppl v)：V51
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4，teinberg D，Parthasarathy S.Carow TE et al.beyond cholesterolmodifications of low-density lipoprotein that increase it's atherogenicity.N Engl J Med，1989；320：915
5，王淳本，宗义强，吴万生 et al.两步超速离心法分离大量血浆极低密度脂蛋白及低密度脂蛋白.同济医科大学学报，1995；24：169
6，Lowry Oh，Rosenbrough NJ,Farr AL et al.Protein meaure with the folin pheno reagent.J Biol Chem，1951；193：265
7，程 娉，周 玖，杨仕林.电泳纯的LDL的快速提取及Cu2+对其氧化修饰的影响.第一军医大学学报，1991；11(4)：292
, 百拇医药
8，Green LC，Wagner DA,Gligowski J.Analysis of nitrate,nitrite and 15N nitrate in biological fluids.Anal Biochem，1982；126：131
9，徐顺清，舒柏华，周宜开 et al.化学发光法测定脑组织中一氧化氮合成酶活性.中国卫生检验杂志，1997；7(3)：131
10，Kubes P，Suzuki M,Granger DN.Nitric oxide:An endogenous modulator of leukocyte adhesion.Proc Natl Acad Sci USA，1991；88(11)：4651
11，Myers PR，Wright TF,Tanner MA et al.The effects of native LDL and oxidized LDL on EDRF bioactivity and nitric oxide production in vascular endothelium.J Lab Clin Med，1994；124：672
12，Liao JK，Shin WS,Lee WY et al.oxidized low-density lipoprotein decreases the expression of endothelial nitric oxide synthase.JBiol Chem，1995；270(1)：319
收稿日期：1999-01-17
修回日期：1999-03-03, 百拇医药