绝经后大鼠骨组织中IL-6、TNFα与骨形态计量的变化
作者：李伟民 傅祖植 蔚芃 杨颖乔
单位：李伟民(咸宁医学院内科，咸宁 437100)；傅祖植(中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科，博士导师)；蔚芃(川北医院学院附属医院骨科)；杨颖乔(咸宁医学院内科，咸宁 437100)
关键词：骨质疏松；绝经后；病因学；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子；骨形态
中国老年学杂志000219摘 要 目的 探讨白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)对绝经后骨质疏松症骨形态计量学的影响。方法 行开腹输卵管峡部结扎后切除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松大鼠模型，检测骨组织培养液中(RPMI1640) IL-6、TNFα活性含量，同步用IBAS计算机全自动图象分析系统对不脱钙组织作形态计量学测量，并与对照组比较。结果 去势后早期(<4 w)即有骨组织中IL-6、TNFα升高(均P<0.05)，并持续在较高水平。随着绝经期的延长(4～22 w)，骨小梁体积(TBV)和平均厚度(MTT)减少，骨吸收表面(RS)增大(P<0.002)。骨组织中IL-6、TNFα和骨吸收指标在绝经后4～22 w升高的程度无显著性。结论 骨微环境中破骨细胞释放一定量的IL-6、TNFα可能与绝经后骨质疏松发生有关，其持续增高可能致骨小梁组织结构变化。
, 百拇医药
The determination of IL-6 and TNF-α contents and histomorphometry of the bones in ovariectomized rats
Li Weimin,Fu Zuzhi,Wei Peng et al
(Hubei Xianning Medical Collgeg,Xianning 437100)
Abstract：Objective To observe the histomorphometry of the bones in postmenopausol osteoporosis(PMOP) with dynamic change of IL-6 and TNF-α.Methods 40 female SD rats were randomly divided into 4 groups,each group contained experimental,ovariectomized(OV) and contract (sham-OV),subgroups.IL-6 and TNF-α in bony culture were measured by ELISA,and bony hisomorphometry was measured with whole automobile imaging analysis system.Results In the early period(≤4 weeks) after amenorrhea,IL-6 and TNF-α began to increas(P<0.05) and bony histomorphometry began to change gradually:RS began to increase(P<0.001),TBV.MTT began to decrease(P<0.01) and remained on stability in a desirable period after amenorrhea(4～22 weeks).FS become active gradually in the 10 weeks.Conclusion In microsurroundings,the bone of the OV rat discharge more IL-6 and TNF-α,which might be related to the birth and growth of PMOP and lead to the change of the shape of the bone.
, http://www.100md.com
Key words Osteoporosis Postmenopausol/etiolgy Interleukin-6 Tumor necrosis factor Bone
绝经后骨质疏松症(PMOP)是妇女在绝经后因骨量丢失，骨微结构退化而致骨折危险性增加的常见的老年性疾病。近年认为白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)等细胞因子与骨吸收、骨小梁破坏有关。但绝经后骨组织中IL-6、TNFα含量究竟有无改变，其与骨形态计量学参数的变化关系怎样，尚未见专门报道。我们以去势大鼠为模型动态检测骨组织中IL-6、TNFα与绝经后骨形态计量学变化，为临床上有关PMOP的防治提供一点有益的线索。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 40只4月龄雌性SD大鼠(二级实验动物，中山医科大学实验动物中心提供)，体重220±15 g，随机分为4组，每组10只，每组中再分为实验组5只和对照组5只。各组动物分笼并采用标准固体饲料(广东省农科所提供)和双蒸水自由摄食喂养，室温25±2 ℃。
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1.2 实验方法 每只鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉。实验组行开腹输卵管峡部结扎后切除双侧卵巢，对照组单纯开腹假去势。术后第4、10、16和22周为实验周。分别于每实验周获取标本前14 d和前4 d各鼠皮下注射1%四环素1 ml双重标记。在各实验周将实验组和对照组各5只麻醉后获取下列2项标本：(1)各取左侧胫骨上端3 g(天平称重)，剔尽软组织，置10%甲醛中固定24 h，再经50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水，每一浓度24 h；将此于丙酮中脱酯24 h，二甲苯中透明24 h，将骨标本置于甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯按比例混合的包埋剂中，后置50～70 ℃ 烤箱2～3 d，待包埋剂变硬后取出。在Lizte切片机上用乌钢片将每标本切出10 μm和7 μm的切片，在载玻片上将切片展开，7 μm切片用二甲苯脱去包埋剂后，用1%甲苯胺蓝染色12 h后，流水冲去染液，自然干燥后，中性树脂封片。(2)无菌分离各鼠右侧胫骨上端3 g，剔净软组织，Hank's液反复冲洗，用骨钳将其分离为1 mm3的碎片。置于每孔3 ml RPMI1640 培养液的12孔培养板，放入37 ℃、100%湿度、5%CO2培养液中48 h，吸取培养液离心后取上清液，装入编号试管-70 ℃保存备测。
, 百拇医药
1.3 观察指标及方法 骨组织培养液IL-6、TNFα浓度检测采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，检测药盒购自深圳晶美公司(Rat IL-6、TNFα，美国Genzyme公司产品)。用EL-312型酶标仪(美国产)测定溶液在450 nm处的吸收率。骨标本的骨组织形态计量学观察，用IBAS计算机全自动图象分析系统(中山医科大学生理学研究图象分析室提供)对不脱钙骨组织切片7 μm在显微镜下，10 μm在荧光显微镜(200×360 nm波长)下，测量计算结果并自动摄像。以胫骨上端骺板的近骨干一侧镜下视野，每张切片要求测量3个不同视野，然后求得：骨小梁体积比(TBV，%)，即骨小梁占骨髓腔总体积的百分比；平均骨小梁厚度(MTT，μm)；骨形成表面(FS，%)，即类骨质表面占骨小梁表面百分比；骨吸收表面(RS，%)，即骨小梁表面的吸收陷凹占骨小梁表面的百分比；四环素标记表面(TLS，%)，即四环素标记表面占骨小梁表面的百分比；骨矿化沉积速率(MAR，μm/d)，即四环素双标记线间距除以2次给药时间；6项指标各个均值。测宽度要求分测视野内最宽最窄各两点，再测一中等厚度处。
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2 结 果
2.1 骨组织培养液中IL-6、TNFα含量的动态观测 见表1。
2.2 骨组织形态计量学参数的观测 与同期对照组比较：TBV、MTT 2项参数明显减低(P<0.01)；RS明显升高(P<0.001)；FS除第4周外，其余各实验周较对照组升高(P<0.001)；而LS、MAR 2项参数在各实验周与对照组比较P<0.05。术后第10周去势组和对照组骨形态改变见图1，图2，图3。
2.3 实验组不同时间各形态计量学参数动态变化 见表2。
表1 骨组织中IL-6、TNFα含量的动态观测(
±s，pg/ml)
IL-6
, 百拇医药
TNFα
实验组
对照组
实验组
对照组
第4周
66.23±23.871)2)
32.82±5.56
520.81±10.162)3)
58.73±23.00
第10周
54.18±12.72
, 百拇医药
36.23±7.37
545.58±12.00
39.80±10.20
第16周
73.54±16.15
40.94±7.58
582.90±11.00
51.84±9.10
第22周
79.74±10.30
41.44±8.17
, 百拇医药 551.79±8.10
68.52±1.80
1)与同周对照组比较P<0.05，2)实验组各实验周比较P>0.05，3)与同周对照组比较P<0.01
时间(W)
图1 各组中IL-水平的变化趋势
图2 第10周对照组镜下骨组织学改变
图3 第10周实验组镜下骨组织学改变
, http://www.100md.com
图3可见胫骨骺板下区，骨小梁大片消失，髓腔中残留棒状或钳扣样骨小梁结构；骨小梁连接断裂，排列疏松。
表2 实验组不同时期各形态计量学参数动态变化(±s)
第4周
第10周
第16周
第22周
FS(%)
0.91±0.28
1.34±0.32
2.05±0.38
, http://www.100md.com
2.29±0.302)
RS(%)
4.25±0.511)
4.92±1.38
5.90±1.27
5.95±1.00
TBV(%)
19.61±11.20
15.69±2.80
15.62±2.80
10.65±0.702)
, 百拇医药
MTT(μm)
98.42±6.30
88.21±2.50
79.10±1.98
70.00±2.102)
TLS(%)
19.07±3.701)
15.03±1.80
14.98±1.70
14.50±4.50
MAR(μm/d)
, 百拇医药
0.94±0.081)
0.90±0.18
0.78±0.14
0.82±0.15
1)与第10、16、22周比较P>0.05，2)与第4、10、16周比较P<0.05
3 讨 论
大鼠由于其骨组织在组织和器官水平对力学反应及对激素的反应与人类相似〔1〕，加之12周龄的大鼠骨再建活动酷似人类髂骨，多数研究者认为卵巢切除后5～7 w即可观察到骨质疏松。我们在实验中观察骨形态计量学参数后发现：大鼠在切除卵巢后第4周，其左胫骨近端骨小梁体积、骨小梁厚度(反应骨结构)均低于对照组(P<0.01)，在术后第10周这种差别更为明显(P<0.001)，提示PMOP在术后第4周业已发生，并持续在较高水平。临床上许多绝经早期的妇女，常常出现全身骨痛，甚至微骨折可能与此有关
, 百拇医药
IL-6、TNFα在绝经后体内的变化究竟怎样，国内外研究显示出不同的结果〔2，3〕，但均未涉及骨组织微环境中IL-6、TNFα的含量。本研究发现，骨组织培养液中IL-6和TNFα浓度均高于同期对照组(P<0.05，P<0.01)，且持续在一定的浓度。4～22各实验周比较P>0.05。提示去势后可能由于雌激素水平下降，对成骨细胞和骨髓基质细胞合成和分泌IL-6、TNFα的抑制作用去除，使骨微环境中IL-6、TNFα含量增加，而这种含量随时间延长而呈增高趋势(但无显著意义)，表明IL-6、TNFα所致的骨吸收是在一定浓度基础上持续进行的。
本研究发现，去势后第4周骨吸收表面显著升高，而骨形成表面至第10周才明显升高(P<0.05)，说明绝经早期虽有成骨作用的开始，但相对骨吸收而言作用比较缓慢。雌激素缺乏所致骨吸收的两个途径是破骨细胞产生过多和静息状态的破骨细胞活化。体外研究提示IL-6、TNFα可能作用于这两个途径来促进雌激素缺乏所致的骨质吸收〔4〕。成骨和破骨过程的解偶联在骨质疏松的发病中起着重要作用，其中过量的IL-6、TNFα的产生很可能是一个较关键的原因。 美国中华医学基金会(CMB)资助课题
, 百拇医药
作者简介：李伟民，男，43岁，副教授，硕士，研究内分泌及骨代谢病
参考文献
1，Chombder TJ.Induction of bone formation in rat tail vertebrae by mechanical loading.Bone Miner，1993；20：107
2，Kania DM，Bindley N,Cheovich M et al.Elevated plasma levels of interleukin-6 in postmenopausal woman do not correlate with bone density.J Am Geriatr Soc，1995；43：236
3，Khosla S，Petorson JM，Egan K.Circulating cytokine levels in osteoporotic and normal woman.J Clin Endocrinol Metab，1994；79：707
4，Kimble RB，Kitazewa R et al.Persistant bone sparing effect interleukin-1 receptor antagonist:A hypothesis on the role of IL-1 in ovariectomy induced bone loss.Calif Tissue Int，1994；55：260
收稿日期：1997-12-31
修回日期：1999-10-30, http://www.100md.com
单位：李伟民(咸宁医学院内科，咸宁 437100)；傅祖植(中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科，博士导师)；蔚芃(川北医院学院附属医院骨科)；杨颖乔(咸宁医学院内科，咸宁 437100)
关键词：骨质疏松；绝经后；病因学；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子；骨形态
中国老年学杂志000219摘 要 目的 探讨白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)对绝经后骨质疏松症骨形态计量学的影响。方法 行开腹输卵管峡部结扎后切除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松大鼠模型，检测骨组织培养液中(RPMI1640) IL-6、TNFα活性含量，同步用IBAS计算机全自动图象分析系统对不脱钙组织作形态计量学测量，并与对照组比较。结果 去势后早期(<4 w)即有骨组织中IL-6、TNFα升高(均P<0.05)，并持续在较高水平。随着绝经期的延长(4～22 w)，骨小梁体积(TBV)和平均厚度(MTT)减少，骨吸收表面(RS)增大(P<0.002)。骨组织中IL-6、TNFα和骨吸收指标在绝经后4～22 w升高的程度无显著性。结论 骨微环境中破骨细胞释放一定量的IL-6、TNFα可能与绝经后骨质疏松发生有关，其持续增高可能致骨小梁组织结构变化。
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The determination of IL-6 and TNF-α contents and histomorphometry of the bones in ovariectomized rats
Li Weimin,Fu Zuzhi,Wei Peng et al
(Hubei Xianning Medical Collgeg,Xianning 437100)
Abstract：Objective To observe the histomorphometry of the bones in postmenopausol osteoporosis(PMOP) with dynamic change of IL-6 and TNF-α.Methods 40 female SD rats were randomly divided into 4 groups,each group contained experimental,ovariectomized(OV) and contract (sham-OV),subgroups.IL-6 and TNF-α in bony culture were measured by ELISA,and bony hisomorphometry was measured with whole automobile imaging analysis system.Results In the early period(≤4 weeks) after amenorrhea,IL-6 and TNF-α began to increas(P<0.05) and bony histomorphometry began to change gradually:RS began to increase(P<0.001),TBV.MTT began to decrease(P<0.01) and remained on stability in a desirable period after amenorrhea(4～22 weeks).FS become active gradually in the 10 weeks.Conclusion In microsurroundings,the bone of the OV rat discharge more IL-6 and TNF-α,which might be related to the birth and growth of PMOP and lead to the change of the shape of the bone.
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Key words Osteoporosis Postmenopausol/etiolgy Interleukin-6 Tumor necrosis factor Bone
绝经后骨质疏松症(PMOP)是妇女在绝经后因骨量丢失，骨微结构退化而致骨折危险性增加的常见的老年性疾病。近年认为白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)等细胞因子与骨吸收、骨小梁破坏有关。但绝经后骨组织中IL-6、TNFα含量究竟有无改变，其与骨形态计量学参数的变化关系怎样，尚未见专门报道。我们以去势大鼠为模型动态检测骨组织中IL-6、TNFα与绝经后骨形态计量学变化，为临床上有关PMOP的防治提供一点有益的线索。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 40只4月龄雌性SD大鼠(二级实验动物，中山医科大学实验动物中心提供)，体重220±15 g，随机分为4组，每组10只，每组中再分为实验组5只和对照组5只。各组动物分笼并采用标准固体饲料(广东省农科所提供)和双蒸水自由摄食喂养，室温25±2 ℃。
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1.2 实验方法 每只鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉。实验组行开腹输卵管峡部结扎后切除双侧卵巢，对照组单纯开腹假去势。术后第4、10、16和22周为实验周。分别于每实验周获取标本前14 d和前4 d各鼠皮下注射1%四环素1 ml双重标记。在各实验周将实验组和对照组各5只麻醉后获取下列2项标本：(1)各取左侧胫骨上端3 g(天平称重)，剔尽软组织，置10%甲醛中固定24 h，再经50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水，每一浓度24 h；将此于丙酮中脱酯24 h，二甲苯中透明24 h，将骨标本置于甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯按比例混合的包埋剂中，后置50～70 ℃ 烤箱2～3 d，待包埋剂变硬后取出。在Lizte切片机上用乌钢片将每标本切出10 μm和7 μm的切片，在载玻片上将切片展开，7 μm切片用二甲苯脱去包埋剂后，用1%甲苯胺蓝染色12 h后，流水冲去染液，自然干燥后，中性树脂封片。(2)无菌分离各鼠右侧胫骨上端3 g，剔净软组织，Hank's液反复冲洗，用骨钳将其分离为1 mm3的碎片。置于每孔3 ml RPMI1640 培养液的12孔培养板，放入37 ℃、100%湿度、5%CO2培养液中48 h，吸取培养液离心后取上清液，装入编号试管-70 ℃保存备测。
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1.3 观察指标及方法 骨组织培养液IL-6、TNFα浓度检测采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，检测药盒购自深圳晶美公司(Rat IL-6、TNFα，美国Genzyme公司产品)。用EL-312型酶标仪(美国产)测定溶液在450 nm处的吸收率。骨标本的骨组织形态计量学观察，用IBAS计算机全自动图象分析系统(中山医科大学生理学研究图象分析室提供)对不脱钙骨组织切片7 μm在显微镜下，10 μm在荧光显微镜(200×360 nm波长)下，测量计算结果并自动摄像。以胫骨上端骺板的近骨干一侧镜下视野，每张切片要求测量3个不同视野，然后求得：骨小梁体积比(TBV，%)，即骨小梁占骨髓腔总体积的百分比；平均骨小梁厚度(MTT，μm)；骨形成表面(FS，%)，即类骨质表面占骨小梁表面百分比；骨吸收表面(RS，%)，即骨小梁表面的吸收陷凹占骨小梁表面的百分比；四环素标记表面(TLS，%)，即四环素标记表面占骨小梁表面的百分比；骨矿化沉积速率(MAR，μm/d)，即四环素双标记线间距除以2次给药时间；6项指标各个均值。测宽度要求分测视野内最宽最窄各两点，再测一中等厚度处。
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2 结 果
2.1 骨组织培养液中IL-6、TNFα含量的动态观测 见表1。
2.2 骨组织形态计量学参数的观测 与同期对照组比较：TBV、MTT 2项参数明显减低(P<0.01)；RS明显升高(P<0.001)；FS除第4周外，其余各实验周较对照组升高(P<0.001)；而LS、MAR 2项参数在各实验周与对照组比较P<0.05。术后第10周去势组和对照组骨形态改变见图1，图2，图3。
2.3 实验组不同时间各形态计量学参数动态变化 见表2。
表1 骨组织中IL-6、TNFα含量的动态观测(
±s，pg/ml)IL-6
, 百拇医药
TNFα
实验组
对照组
实验组
对照组
第4周
66.23±23.871)2)
32.82±5.56
520.81±10.162)3)
58.73±23.00
第10周
54.18±12.72
, 百拇医药
36.23±7.37
545.58±12.00
39.80±10.20
第16周
73.54±16.15
40.94±7.58
582.90±11.00
51.84±9.10
第22周
79.74±10.30
41.44±8.17
, 百拇医药 551.79±8.10
68.52±1.80
1)与同周对照组比较P<0.05，2)实验组各实验周比较P>0.05，3)与同周对照组比较P<0.01
时间(W)
图1 各组中IL-水平的变化趋势
图2 第10周对照组镜下骨组织学改变
图3 第10周实验组镜下骨组织学改变
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图3可见胫骨骺板下区，骨小梁大片消失，髓腔中残留棒状或钳扣样骨小梁结构；骨小梁连接断裂，排列疏松。
表2 实验组不同时期各形态计量学参数动态变化(
±s)第4周
第10周
第16周
第22周
FS(%)
0.91±0.28
1.34±0.32
2.05±0.38
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2.29±0.302)
RS(%)
4.25±0.511)
4.92±1.38
5.90±1.27
5.95±1.00
TBV(%)
19.61±11.20
15.69±2.80
15.62±2.80
10.65±0.702)
, 百拇医药
MTT(μm)
98.42±6.30
88.21±2.50
79.10±1.98
70.00±2.102)
TLS(%)
19.07±3.701)
15.03±1.80
14.98±1.70
14.50±4.50
MAR(μm/d)
, 百拇医药
0.94±0.081)
0.90±0.18
0.78±0.14
0.82±0.15
1)与第10、16、22周比较P>0.05，2)与第4、10、16周比较P<0.05
3 讨 论
大鼠由于其骨组织在组织和器官水平对力学反应及对激素的反应与人类相似〔1〕，加之12周龄的大鼠骨再建活动酷似人类髂骨，多数研究者认为卵巢切除后5～7 w即可观察到骨质疏松。我们在实验中观察骨形态计量学参数后发现：大鼠在切除卵巢后第4周，其左胫骨近端骨小梁体积、骨小梁厚度(反应骨结构)均低于对照组(P<0.01)，在术后第10周这种差别更为明显(P<0.001)，提示PMOP在术后第4周业已发生，并持续在较高水平。临床上许多绝经早期的妇女，常常出现全身骨痛，甚至微骨折可能与此有关
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IL-6、TNFα在绝经后体内的变化究竟怎样，国内外研究显示出不同的结果〔2，3〕，但均未涉及骨组织微环境中IL-6、TNFα的含量。本研究发现，骨组织培养液中IL-6和TNFα浓度均高于同期对照组(P<0.05，P<0.01)，且持续在一定的浓度。4～22各实验周比较P>0.05。提示去势后可能由于雌激素水平下降，对成骨细胞和骨髓基质细胞合成和分泌IL-6、TNFα的抑制作用去除，使骨微环境中IL-6、TNFα含量增加，而这种含量随时间延长而呈增高趋势(但无显著意义)，表明IL-6、TNFα所致的骨吸收是在一定浓度基础上持续进行的。
本研究发现，去势后第4周骨吸收表面显著升高，而骨形成表面至第10周才明显升高(P<0.05)，说明绝经早期虽有成骨作用的开始，但相对骨吸收而言作用比较缓慢。雌激素缺乏所致骨吸收的两个途径是破骨细胞产生过多和静息状态的破骨细胞活化。体外研究提示IL-6、TNFα可能作用于这两个途径来促进雌激素缺乏所致的骨质吸收〔4〕。成骨和破骨过程的解偶联在骨质疏松的发病中起着重要作用，其中过量的IL-6、TNFα的产生很可能是一个较关键的原因。 美国中华医学基金会(CMB)资助课题
, 百拇医药
作者简介：李伟民，男，43岁，副教授，硕士，研究内分泌及骨代谢病
参考文献
1，Chombder TJ.Induction of bone formation in rat tail vertebrae by mechanical loading.Bone Miner，1993；20：107
2，Kania DM，Bindley N,Cheovich M et al.Elevated plasma levels of interleukin-6 in postmenopausal woman do not correlate with bone density.J Am Geriatr Soc，1995；43：236
3，Khosla S，Petorson JM，Egan K.Circulating cytokine levels in osteoporotic and normal woman.J Clin Endocrinol Metab，1994；79：707
4，Kimble RB，Kitazewa R et al.Persistant bone sparing effect interleukin-1 receptor antagonist:A hypothesis on the role of IL-1 in ovariectomy induced bone loss.Calif Tissue Int，1994；55：260
收稿日期：1997-12-31
修回日期：1999-10-30, http://www.100md.com