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编号:10211406
储存损伤对血小板超微结构、磷脂及聚集功能的影响
http://www.100md.com 《重庆医学》 2000年第2期
     作者:成晓玲 林武存 黎汝青 曾杰 任德慧

    单位:第三军医大学附属第一医院输血科 重庆 400038

    关键词:血小板储存损伤 高效液相色谱分析 脂质 超微结构 血 小板聚集

    重庆医学000205摘 要:目的 对保存期间血小板脂质、超微结构 及功能的改变进行观察分析,探讨储存损伤对血小板的影响。方法 20名健康献血者,常规采血,经二次离心获得浓缩血小板,将每单位浓缩血小板分装成两份 ,分别编为甲、乙两组,每组20个样本。甲组于22℃水平振摇保存,分别在3天、5天时取样 检测;乙组采用DMSO作为防冻剂,终浓度为5%,-80℃保存,分别在1月、3月、6月时取样测 定;采血当天的新鲜血小板为对照组。采用高效液相色谱法(HPLC-UV)分析血小板磷脂的变 化,电镜观察血小板超微结构的改变。结果 正常人新鲜血小板中四 种主要磷脂:磷脂酰胆碱(PC),磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰丝氨酸(PS),磷脂酰肌醇(PI) 的 含量依次为PC>PE>PS>PI,各占总磷脂含量的37%,27%,12%,7%左右。血小板在22℃水平振 摇保存3天、5天,磷脂丢失率为5.8%,31.8%;-80℃冷冻保存(防冻剂为DMSO)1~6月,磷脂 丢失率约为33~36%左右,且不随冷冻时间延长而增加。透射电镜观察血小板超微结构,发 现血小板出现激活信号,如由盘状向球形转变,伪足延伸,开放小管系统(OCS)肿胀,储存 颗粒丧失,空泡形成等。血小板聚集实验显示:血小板对聚集剂ADP的反应性下降,提示血 小板功能受损。结论 在储存损伤的发展过程中,血小板脂质丧失与 血小板形态改变和功能损伤有密切关系。
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    The Changes of Lipids,Ultrastructure and Aggregation in Platelet Storage Lesion

    Cheng Xiaoling Lin Wuchen Li Ruqing,et al.

    (Department of Blood Tra nsfusion;Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,P R China)

    Abstract:objective:The purpose of this project was to study the s torage lesion of platelet and to investigate the changes of platelet lipids,ultr a-structure and aggregation.Methods:20 units of platelet were div ided into two groups.One was stored at 22℃ and esamined at 3,5 days poststorage .Another added DMSO(5% terminal concentration)was stored at -80℃ and examined a t 1,3 and 6 months poststorage.The fresh platelet was as control.The platelet li pids were assayed by HPLC.The platelet ultra-structure was investigated by elect ron microscope.Results:The loss rates of platelet lipids at 22℃ were 5.8%~31.8% after 3,5 days respectively.The loss rates of lipids at -80℃ w ere 33%~36% after 6 months storage and did not change anymore thereafter.The ul tra-structure alterations were occurred at 22℃ and -80℃ groups in storage.The morphological alterations were expressed as signs of activation.The piatelet agg regative test sbowed the decrease of reaction to agonist ADP.This result showed the functional alteration of platelet.Conclusion:The functional a lterations of platelet are due to the lipids loss and morphological alterations in platelet preparation and storage.
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    Key Words:Storage lesion of platelet;HPLC;Lipids;Ultra-structure; Platelet aggregation▲

    血小板储存损伤(the Platelet Storage Lesion,PSL)是影响血小板保存的重 要障碍。它可以使血小板输注后体内恢复率下降,生存期缩短,严重影响治疗效果,成为临 床输血亟待解决的难题。鉴于血小板脂质对维持血小板形态结构,发挥止血效能具有重要意 义,同时又具理化性能不稳定的特点,我们调查了保存期间血小板脂质、超微结构及功能的 变化,并就其相关性进行了探讨,旨在预防或减少PSL发生,改善血小板保存质量,提高血 小板输注后体内存活率。

    1 材料与方法

    1.1 样本准备与分组

    1.1.1 样本准备 20位健康献血者,常规采血,采用多血小板血浆法(PRP- PC)经二次离心获得浓缩血小板,血袋为ACD-B三联袋(上海血液中心产品)。
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    1.1.2 分组 将每单位浓缩血小板分装成两份,编为甲、乙两组,每组20 个样本;采血当天的新鲜血小板(第一天)为对照组。甲组于22℃水平振摇保存(XHZ-1 型血 小板恒温振荡保存箱,60次/分,苏州产),分别在2天、3天、4天、5天取样检测,与对照组 比较进行动态观察。乙组用二甲亚砜(DMSO)作为防冻剂(终浓度为5%),-80℃保存,分别在1 月、3月、6月取样测定,与对照组比较进行动态观察,用前在37℃水浴快速溶化。

    1.2 实验方法

    1.2.1 血小板磷脂测定 (1)提取脂质根据 文献报道[1,2],将 血 小板悬液加入塑料试管中,4℃离心,4000g,10分钟,去上层血浆,用冷生理盐水(4℃)将 血小板扣再悬浮,4℃离心,4000g,10分钟,反复三次,直到完全去除血浆。用冷生理盐水 将血小板调至400×109/L,白细胞和红细胞污染数量少于1/4000血小板。将洗涤后的血小 板悬液在冰水浴中匀浆。取3ml血小板匀浆液+2倍的氯仿-甲醇提取液(2:1,v/v),离心去 上清液,收集氯仿液;再加入甲醇-水提取液,离心去上清液;取1ml氯仿液,氮气下吹干, -20℃保存备用[2]。(2)试剂 四种磷脂标准品:磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholin e,PC),磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PE),磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserin e,PS),磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)均为Sigma产品;乙晴、甲醇为HPLC(色谱) 纯级(上海产);其它试剂均为分析纯级。(3)仪器与色谱条件 GILSON系列高效液相色谱仪( 法国产),色谱数据工作站(中科院大连化物所)。色谱柱:μPorasil silica,300mm×4.0mm ,粒径10μm;流动相:乙晴-甲醇-磷酸(90:3:1,v/v);流速:0.8ml/分钟,进样量: 20μl;紫外检测波长203nm;时间25分钟;柱温:室温。色谱数据工作站进行数据处理。
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    1.2.2 血小板超微结构观察 常规电镜样本处理。LKB-V型超薄切片机切 片,切片厚度0.6μm,铅染色,GE2000型电镜观察。

    1.2.3 血小板聚集功能测定 诱导剂:ADP,浓度分别为

    0.2、0. 1、0.05mM;测定5分钟,记录最大聚集率(PAG);仪器:TYXN-91型血液凝集仪(上海产)。

    1.2.4 浓缩血小板悬液pH测定 AVL990型血气分析仪(瑞士产)。

    1.2.5 结果以χ±s表示,进行t检验。

    2 结 果

    2.1 22℃水平振摇保存血小板。

    2.1.1 磷脂的变化 新鲜血小板四种主要磷脂含量依次PC>PE>PS>PI。保存 3天,血小板四种磷脂的总量下降5.8%;保存5天下降31.8%,具有统计学意义(表1)。
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    表1 血小板磷脂PC,PE,PI,PS在储存期间的变化n=20浓度:μg/ml

    PC

    PE

    PS

    PI

    合计

    丢失率(%)

    P值

    22℃

    1天

    35.7±7.9

    21.0±4.2
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    10.1±6.4

    4.6±0.7

    71.4

    0

    3天

    33.9±8.1

    20.3±5.2

    8.6±2.7

    4.5±0.5

    67.3

    5.8*

    >0.05
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    5天

    24.8±4.9

    13.9±3.3

    6.4±2.1

    3.6±0.5

    48.7

    31.8*

    <0.01

    -80℃

    

    1月

    24.6±5.4
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    13.2±4.1

    6.9±3.1

    3.9±1.2

    47.6

    33.3**

    <0.01

    3月

    21.4±3.7

    14.6±3.1

    7.2±2.9

    3.5±1.0

    46.7
, 百拇医药
    34.6**

    <0.01

    6月

    22.5±4.1

    13.6±4.2

    6.2±4.2

    3.2±1.1

    45.5

    36.3**

    <0.01

    *22℃贮存3天、5天之间比较,P<0.05。**-80℃低温贮存1、3、6月之间比较,P>0.05。
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    2.1.2 血小板超微结构变化 透射电镜下观察:新鲜血小板膜光滑,颗粒 清楚,无变形,均匀一致,有少数小泡扩张,可见少量短突(图1)。保存3天,血小板形态完 整,环形小管肿胀扩张,呈半月状,颗粒减少,色变淡,可观察到退变的膜性结构。血小板 微丝,微管,线粒体可见(图2 、图3)。保存5天血小板开放管道系统(OCS)扩张,肿胀明显 ,出现聚集及溶解。t10701.gif (8831 bytes)

    图1.新鲜血小板,膜光滑,颗粒清楚,均匀一致,有少数小泡扩张。×5,000。t10702.gif (9957 bytes)

    图2.22℃保存3天的血小板,形态完整,颗粒减少,空泡增多,OC S扩张,肿胀,呈半月状裂隙。×5,000。t10703.gif (10966 bytes)
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    图3.22℃保存3天的血小板,可见α颗粒与OCS融合的现象,腺粒体可见。×30,000。

    2.1.3 血小板聚集功能改变 随着储存时间延长,血小板对ADP的反应性下 降。22℃保存24小时,血小板PAG下降约50%,保存72小时PAG降至10%以下,即使增加ADP浓 度也不能提高PAG(图6)。t10706.gif (2777 bytes)

    图6.22℃水平振摇保存,血小板聚集率的变化

    2.1.4 血小板pH的变化见表2。

    表2 血小板在22℃保存下pH等指标的变化 (n=8)

    1天
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    3天

    5天

    P值

    pH

    6.97±0.2

    7.02±0.1

    <6.0

    <0.01

    HCO3(mmol/l)

    12.2±0.2

    6.03±1.2

    0.04±0.1
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    <0.01

    PO2(kPa)

    15.5±0.9

    13.4±1.2

    12.7±1.2

    >0.05

    表3 ADP诱导的冻-融后血小板最大聚集率(PAG) (n=8) ADP(mM)

    0.2

    0.1

    0.05

    新鲜血小板

, 百拇医药     92±6.5

    90±8.2

    83±9.0

    冻融后血小板

    10±4.1*

    10±3.4*

    7±2.7*

    重悬血小板**

    18±6.3*

    18±4.5*

    16±2.5*
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    *冻-融后血小板与新鲜血小板比较,P<0.01;重悬血小板与冻融后血小 板比较,P<0.05。**冻-融后用同型FFP重悬的血小板。

    2.2 -80℃冷冻保存血小板

    2.2.1 磷脂的变化 -80℃保存1月、3月、6月,血小板磷脂丢失率分别为 33.3%,34.6%,36.3%,三者之间无显著差异,但与新鲜血小板相比较差异显著,P<0.0 1(表1)。

    2.2.2 血小板超微结构改变 保存1月,冻一融血小板约58%保持完整的形 态结构,颗粒稍有减少,色变淡,线粒体、α-颗粒、致密颗粒、微管均可见(图4)。约42% 的血小板出现基质肿胀,颗粒边集或溢出膜外,部分内部结构消失,膜溶解(图5)。t10701.gif (8831 bytes)
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    图4.-80℃低温保存(5%OMSO)1月,pH7.02,血小板圆盘状形态和内部散在的细胞器依然存在于大部分血小板中。×5,000。t10705.gif (9966 bytes)

    图5.-80℃保存1月后溶解的血小板,开放管道系统(OCS)消失, 部分残余α颗粒靠向浆膜(边集)。×30,000

    2.2.3 血小板聚集功能 表3总结了冻-融血小板对ADP诱导剂的聚集反应。 可见血小板最大聚集率明显下降,用同型新鲜冰冻血浆(FFP)重悬后聚集功能部分恢复。在- 80℃保存1~6月的血小板之间比较,PAG改变不显著。

    3 讨 论

    3.1 储存损伤对血小板脂质的影响 血小板脂质的主要功能是维持血小板 膜结构完整性和磷脂的促凝血活性。未活化的血小板磷脂PI、PS和PE主要暴露于浆膜内侧面 ,血小板活化时PE和PS转向外侧面,为血浆凝血因子FVa和FXa提供了催化表面,形成血小板 3因子(PF3),使凝血酶形成速度大大加快[3]。贮存期间血小板的活化和细胞溶 解使磷脂从血小板膜释放到上清液中。血小板磷脂丧失的机制目前还不完全明确,有可能是 脂质过氧化反应所致。贮存期间血小板内源性抗氧化物(如谷光甘肽)逐渐耗尽,使得氧分子 能够对无保护功能的脂质进行过氧化反应。在脂质过氧化反应中,氧分子加入到脂链的烯烃 双键中反复排列,使一个脂质链形成两个醛分子,最终导致脂链破碎。在这一过程中,膜表 面主要负责脂质功能活性的特异性极性基团丧失,维持血小板生理功能的花生四烯酸前体缺 乏,同时生成破坏生物膜完整性的脂肪酰基醛,使血小板膜脂质双层稳定性下降,磷脂丧失 。血小板磷脂的丢失和血小板聚集功能的改变提示:(1)血小板磷脂丧失与血小板功能下降 有密切的关系;(2)冰冻保存血小板,其损伤主要来自冻一融过程,与保存时间的长短无明显关系。
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    3.2 储存损伤对血小板超微结构的影响 刚制备的新鲜血小板形态发生相对轻微的改变,复温后这些变化是可逆的。血小板在体外受 到刺激后引起α-颗粒通过与OCS融合进行释放(图3)。随保存时间延长,OCS消失,血小板 气球样变,甚至溶解。血小板具有强大的吞噬能力,颗粒中贮存的许多物质并非来自巨核细 胞或血小板自身,而是来自血浆。故推测,输注后血小板α-颗粒可通过细胞摄粒作用得到恢复[4]。然而,在血小板保存期间,细胞膜磷脂 丢失,细胞摄粒作用减弱,不利于血小板输入体内后的恢复和生存。

    3.3 储存对血小板聚集功能和代谢功能的影响

    3.3.1 ADP诱导的血小板聚集反应 22℃保存期间,ADP诱导的血小板最大 聚集率PAG随时间递增而下降(图6)。-80℃保存的血小板,冻融后PAG下降显著(P<0.01) ,加入新鲜血浆可部分改善血小板对ADP的反应性(表3)。其原因可能是,新鲜血浆除了给血 小板提供基本能量外,还对在保存中丧失了的某些成分进行了补充,使血小板反应性部分恢 复[5]。可以认为,PSL具有可逆性,保存血小板输注到体内后,可以在一定程度上 恢复其生理功能。我们发现,有时采用聚集仪测定PAG结果为阴性时,在显微镜下往往可以 看到血小板已3~5个聚集成团,这是由于比浊法不能反映少于5个血小板的聚集体[3] 。推测,这种血小板输到体内后仍能恢复一定的生理功能,发挥止血效能(有待进一步证 实)。
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    3.3.2 血小板代谢情况 22℃保存1~3天,PRP-PC法制备的浓缩血小板,p H维持在7.0左右,第四天下降至6.75,第五天pH<6.0;HCO3-第一天 为23.23mmol/L ,第五天只有

    0.04mmol/L;PO2呈下降趋势。这是由于浓缩血小板以葡萄糖为最 主要燃料 ,而血小板所摄取的葡萄糖80%以上是通过无氧酵解,因而导致大量乳酸产生,引起pH下降 。HCO3-的下降提示血浆缓冲能力被消耗。pH降低导致血小板损伤,可见血小板由 圆盘状变成球形,当pH低于6.0时,新陈代谢衰竭,血小板可发生严重的结构改变和释放反 应,这种改变是不可逆的。

    3.4 血小板脂质丧失与血小板形态、结构及功能改变的关系 在保存期间 ,由于“贮存损伤”的影响,血小板受到非生理性刺激,引起活化,释放颗粒,进而聚集; 脂质被消耗或丢失,导致血小板止血功能下降;乳酸盐积蓄,pH下降,血小板新陈代谢衰竭 ,最终导致血小板膜溶解,内容物溢出。在血小板活化过程中,磷脂PS和PE在脂质膜外侧暴 露,形成PF3。PF3能大大加快凝血酶产生的速度,引起血小板广泛聚集。据报道,保存 5天血小板总PF3活性可增加12倍[4]。这与我们的观察一致。由于在体外提前消 耗,血小板输注后止血作用减弱,血液循环中维持时间缩短,体内复苏率降低。
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    3.5 结论 根据血小板激活、新陈代谢衰竭及衰老的变化,浓缩血小板储 存损伤的发展可能为多因素过程,血小板脂质的丧失与血小板形态改变和功能损伤有密切关 系。随着对贮存血小板生物化学、形态学和功能损伤的研究,人们对储存损伤的机制更为了 解。目前,白膜法(BC-PC)制备浓缩血小板的方法受到推荐。它可使血小板活化程度降到最 低[6]。实验室研究发现,在血小板中加入血小板活化抑制剂前列腺素l(PGE)、茶 碱(Theophylline)[7]和抗氧化剂维生素E能明显延长血小板的储存时间[8] 。另外,储存容器具有良好的透气性,添加醋酸盐人工介质以改善浓缩血小板pH稳定性及 能量供给,适当的保存温度和振摇频率以及减少白细胞污染等,对血小板完善地保存都是必 不可少的。

    参考文献:

    [1]Kawasaki T,Kambayashi J,Mori T,et al.Analysis of platelet phospholipid s by high performance liquid chromatography.Thrombosis Research,1984,36:335
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    [2]王凤君,赵云,谢尔凡,等.高效液相色谱法测定生物样品中磷脂含量.第三军 医大学学报,1996,18(1):67

    [3]阮长耿.血小板-基础与临床.第2版,上海:上海科学技术出版社,1987:20

    [4]Klinger MHF.The storage lesion of platelets:ultrastructural and functi onal aspects.Ann Hematol,1996,73:103

    [5]黎金庆,易永林,王宇,等.血小板冷冻保存的研究.中国输血杂志,1994,7 :7

    [6]Seghatchian JMJ,Krailadsiri p.The platelet storage lesion.Transfusion Medicine Reviews,1997,11(2):130

    [7]Bode AP,Holme S,Heaton WA,et al.Extended storage of platelets in an a rtificial medium with the platelet activation inhibitors prostaglandin E1 and theophylline.Vox Sang,1996,60:105

    [8]Koerner TAW,Cunningham MT,Zhang D-S.The role of membrane lipid in the platelet storage lesion.Blood Cell,1992,18:481, http://www.100md.com