维甲酸对Bel-7402人肝癌细胞的诱导分化作用
作者：彭安 黄炜 黄济群
单位：彭安(深圳市中心医院肿瘤科(深圳市 518000))；黄炜 黄济群(广州医学院肿瘤生化研究室(广州市 510182))
关键词：肝癌；细胞分化；维甲酸；酶学；甲胎蛋白
中国现代医学杂志000208 目的：该研究探讨维甲酸对Bel-7402人肝癌细胞的分化诱导作用，为肝癌的分化治疗提供资料。方法：用维甲酸处理Bel-7402人肝癌细胞，观察细胞增殖、软琼脂集落形成和各项生化指标的变化。结果：10μmol/L维甲酸显著抑制肝癌细胞增殖，并使肝癌细胞软琼脂集落形成率明显减少，使代表肝细胞分化的酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶和碱性磷酸酶比活力明显升高，甲胎蛋白分泌量、γ-谷氨酰转肽酶和醛缩酶比活力明显下降。结论：证明维甲酸是Bel-7402人肝癌细胞有效的分化诱导剂。
分类号 R735.7
, http://www.100md.com
INDUCTION OF DIFFERENTIATION OF CULTURED Bel-7402
HUMAN LIVER CANCER CELLS BY RETINOIDS
Peng An, Huang Wei, Huang Jiqun
(Department of Phymatosis,Central Hospital of Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518000)
Objectives:To investigate the induction effects of retinoids on the differentiation of cultured Bel-7402 Human Liver cancer cells.Methods:We observed the cell proliferation, colony forming test on soft agar,and the changes of each biochemical marker,after having treated Bel-7402 Human Liver cancer cells with retinoids.Result
, 百拇医药
s:10 μmol/L retinoids could inhibit the Bel-7402 proliferation and decrease the colony forming of liver cancer cells on soft agar significantly.So some biochemical markers indicating the proliferation status of liver cancer cells changed significant
ly, including the significant activity increase of ornithine carbamyl transferase (OCT), tyrosine-α-ketoglutaric transaminase (TAT) and alkaline phosphatase (AKP), the significant decrease α-fetoprotein (AFP) secretion, γ-glutamyltranspetidase and aldolase activity.Conclusions:The results suggest that retinoids is an effective differentiation revulsiva of Bel-7402 human liver cancer cells.
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Key Words:Liver Cancer;Cell Differentiation;Retinoids;Enzymology;α-Fetoprotein (AFP)
过去已报道维甲酸能诱导人早幼粒白血病细胞[1]、黑色素瘤细胞[2]等多种恶性细胞分化，但对于诱导人肝癌细胞分化的报道不多，国内仅见上海医科大学艾兆伟等[3]对人肝癌细胞SMMC-7721细胞诱导分化的报道。本研究进一步观察维酸对Bel-7402人肝癌细胞的分化诱导作用，除采用过去应用的细胞增殖、软琼脂集落形成、甲胎蛋白(AFP)分泌量、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)外，还增加了鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)、碱性磷酸酶(ALP)和醛缩酶(ALD)等指标，以便更全面观察维甲酸对人肝癌细胞的分化诱导作用。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 主要试剂
RPMI-1640培养基为GIBCO公司产品，全反式维甲酸为SIGMA公司产品，四氯化碳、二甲亚砜为NACALAI TESQUE公司产品，甲胎蛋白放免试剂盒由中国原子能科学研究院提供。
1.2 方法
Bel-7402人肝癌细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供[4]。接种于含10%小牛血清pH7.4的RPMI-1640培养基中，置37℃密闭培养。
维甲酸溶于二甲亚砜中，最终用培养液稀释至以往研究确定的浓度10μmol/L。对照组培养液中含0.02%DMSO。各组每天设3个平行样品，每瓶接种2×105个细胞，24h后换含受试药物的培养液，每天换液，对照组只换培养液，连续6d。
每天收集实验组和对照组各3瓶， 培养液经4000r/min离心5min后取上清测AFP；收集细胞在含0.5%Triton X-100的ph 7.4 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中超声(106Hz,1min)破碎细胞，4℃ 10000r/min离心5min，取上清测酶活性及蛋白含量。鸟氨酸氨基甲酰转移酶按Ohshita等人[5]方法测定，碱性磷酸酶按Bowers等人[6]方法测定，酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶和醛缩酶活性以及蛋白含量的测定方法见本研究过去发表的论文[7]。
, 百拇医药
软琼脂集落形成试验中琼脂糖用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液配制。24孔培养板底层铺 0.6%琼脂糖0.4ml， 顶层铺0.3%琼脂糖， 并含2000个细胞和受试药物，在37℃5%CO2条件下培养两周，倒置显微镜下用目微尺量度集落大小并计数。
2 结果
10μmol/L维甲酸对细胞增殖有明显抑制作用，第4天以后的抑制率与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。
软琼脂集落形成试验结果维甲酸处理组细胞集落形成率为(2.1±0.97)%，对照组为(5.2±2.83)%，维甲酸处理组显著低于对照组(P<0.05)。
各组AFP分泌量均逐日下降，同一处理天数，维甲酸组AFP分泌量均低于对照组，其中第4,5天显著低于对照组(P<0.05)。
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维甲酸组OCT活性高于对照组，第5天差异非常显著(P<0.01)。
维甲酸组TAT活性逐日上升，第4天起明显高于对照组(P<0.01)。
维甲酸组ALP活性逐日升高，各处理天数均显著高于对照组(P<0.01)。
维甲酸组γ-GT活性逐渐下降,从第2天起显著低于对照组(P<0.05和P<0.01)。
从第1天到第3天，各组细胞ALD活性均上升，第4天开始，维甲酸组ALD的活性逐渐下降，同一处理天数，维甲酸组ALD活性均明显低于对照组，第5天起差异非常显著(P<0.01)。
10μmol/L维甲酸组第4天的各项指标以对照组为100%进行比较，10μmol/L维甲酸抑制Bel-7402细胞增殖、软琼脂集落形成、AFP分泌量、γ-GT和ALD活性，但增高OCT、TAT和ALP活性。
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3 讨论
维甲酸又称视黄酸，是维生素A(视黄醇)的衍生物，维生素A在体内代谢转变产生全反式维甲酸、13-顺维甲酸和9-顺维甲酸等几种异构体，它们与细胞内的维甲酸受体和维甲类X受体结合，受体被激活后与DNA中的维甲酸应答元件(retinoic acid response element,RARE)结合，以时间、剂量依赖的方式调节靶基因的表达，从而调节细胞的正常分化。因此，维甲酸是公认的细胞分化诱导剂。自1980年Honma等人发现全反式维甲酸能诱导人早幼粒白血病细胞分化[1]以来，对维甲酸诱导恶性肿瘤细胞分化引起了高度重视，对人早幼粒白血病的分化治疗已进入了临床阶段，并取得了较好的效果。对人肝癌细胞的分化诱导作用1990年艾兆伟等[3]证明10μmol/L全反式维甲酸能诱导SMMC-7721人肝癌细胞的分化，本研究发现相同剂量的全反式维甲酸处理，显著抑制Bel-7402人肝癌细胞增殖，并使肝癌细胞软琼脂集落形成率明显减少，使代表肝细胞分化的酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶和碱性磷酸酶比活力明显升高，甲胎蛋白分泌量、γ-谷氨酰转肽酶和醛缩酶比活力明显下降，证明全反式维甲酸是Bel-7402人肝癌细胞有效的分化诱导剂。提示维甲酸对人肝癌细胞的诱导分化作用可能具有普遍意义。
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AFP是一各胚胎性蛋白，主要由胚肝产生，在正常成人肝中则无分泌或分泌量甚微，在肝癌中分泌量增高，因此，AFP已被认为是诊断肝癌的标志蛋白。γ-GT在成年鼠肝中活性很低，而在诱癌过程中活性逐渐上升，故γ-GT被认为是肝癌变过程中早期癌前病变的生化标志[8]。另一方面，TAT在正常肝细胞中活性较高而在肝细胞癌变时活性下降，是肝细胞成熟分化的标志之一[9]。上述AFP、γ-GT和TAT三项指标已被用为维甲酸诱导人肝癌细胞分化的观察指标[3]。除此之外，鉴于大鼠肝癌细胞醛缩酶活力明显增高[10]，90年代初，Giani等[11]研究证明，碱性磷酸酶是畸胎瘤细胞的分化标志，同年Fanjul等[12]认为肝型ALP是人胰腺癌Capan-1细胞系的分化标志，考虑到尿素合成是肝细胞特异的功能，尿素合成酶系应该是肝细胞的分化标志，因此，本研究增加OCT、ALP和ALD作为观察人会癌细胞恶性表型逆转的指标。本研究结果表明在诱导肝癌细胞分化过程中OCT、TAT和ALP有一致性的变化，三者均明显升高，说明三者联合应用能更好地观察肝癌细胞的分化。
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参考文献
1 Honma Y,Takenaga K,Ksukabe T,et al.Induction of differentiation of cultured human promyelocytic leukemia cells by retinoids.Biochem Biophys Res Commun, 1980;95:507～512
2 笪冀平，陈乐真，李维华，等.维甲酸诱导恶性黑色素瘤分化的实验研究.中华肿瘤杂志，1992；14(5)；356
3 艾兆伟，查锡良，刘 毅，等.视黄酸对人肝癌细胞浆中某些表型的逆转作用.生物化学与生物物理学报，1990；22(2)：135～140
4 陈瑞铭，朱德厚，叶秀珍，等.人体肝癌体外细胞第BEL-7402的建立及其特征.实验生物学报，1978；11(1)：37～47
, http://www.100md.com
5 Ohshita M,Takeda H,Kamiyama Y,et al.A direct method for the estimation of ornithine carbamoyl transferases activity in serun.Clin Chim Acta,1976;67:145～152
6 Bowers Jr GN,McCorub RB.Tatal alkaline phosphatase activity in human serum.Clin Chem, 1975;21:1988～1995
7 朱文渊，黄 炜，黄济群.丁酸钠对Bel-7402人肝癌细胞几种酶活性的影响.实用癌症杂志，1998；13(3)：187～189
8 Pitot HC,Glauert HP,Hanigan M.The significance of selected biochemical markers in the characterization of putative initiated cell population in rodent liver.Cancer Lett, 1985;29:1～14
, 百拇医药
9 盛宗梅，陈惠黎.H615肝癌和HepA腹水肝癌的酶学比较Ⅱ.酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶的活力及诱导的变化.上海第一医学院学报，1983；10(4)：283～288
10 盛宗梅，陈惠黎.H615肝癌和HepA腹水肝癌的酶学比较Ⅰ.丙酮酸激酶和醛缩酶活力及其同工酶谱的变化.上海第一医学院学报，1983；10(2)：125～131
11 Giani M,Studer M,Carpani G,et al.Retinoic acid induces liver/bone/kindney-type alkaline phosphatase gene expressionin F9 teratocarcinoma cell.Biochem J,1991;274:673～678
12 Fanjul M,Theveniau M,Palecoby C,et al.Expression and characterization of alkaline phosphatases during differentiation of human pancreatic cancer (Capan-1) cells in culture.Biol Cell,1991;73:15～25
收稿日期：1999-02-04, 百拇医药
单位：彭安(深圳市中心医院肿瘤科(深圳市 518000))；黄炜 黄济群(广州医学院肿瘤生化研究室(广州市 510182))
关键词：肝癌；细胞分化；维甲酸；酶学；甲胎蛋白
中国现代医学杂志000208 目的：该研究探讨维甲酸对Bel-7402人肝癌细胞的分化诱导作用，为肝癌的分化治疗提供资料。方法：用维甲酸处理Bel-7402人肝癌细胞，观察细胞增殖、软琼脂集落形成和各项生化指标的变化。结果：10μmol/L维甲酸显著抑制肝癌细胞增殖，并使肝癌细胞软琼脂集落形成率明显减少，使代表肝细胞分化的酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶和碱性磷酸酶比活力明显升高，甲胎蛋白分泌量、γ-谷氨酰转肽酶和醛缩酶比活力明显下降。结论：证明维甲酸是Bel-7402人肝癌细胞有效的分化诱导剂。
分类号 R735.7
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INDUCTION OF DIFFERENTIATION OF CULTURED Bel-7402
HUMAN LIVER CANCER CELLS BY RETINOIDS
Peng An, Huang Wei, Huang Jiqun
(Department of Phymatosis,Central Hospital of Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518000)
Objectives:To investigate the induction effects of retinoids on the differentiation of cultured Bel-7402 Human Liver cancer cells.Methods:We observed the cell proliferation, colony forming test on soft agar,and the changes of each biochemical marker,after having treated Bel-7402 Human Liver cancer cells with retinoids.Result
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s:10 μmol/L retinoids could inhibit the Bel-7402 proliferation and decrease the colony forming of liver cancer cells on soft agar significantly.So some biochemical markers indicating the proliferation status of liver cancer cells changed significant
ly, including the significant activity increase of ornithine carbamyl transferase (OCT), tyrosine-α-ketoglutaric transaminase (TAT) and alkaline phosphatase (AKP), the significant decrease α-fetoprotein (AFP) secretion, γ-glutamyltranspetidase and aldolase activity.Conclusions:The results suggest that retinoids is an effective differentiation revulsiva of Bel-7402 human liver cancer cells.
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Key Words:Liver Cancer;Cell Differentiation;Retinoids;Enzymology;α-Fetoprotein (AFP)
过去已报道维甲酸能诱导人早幼粒白血病细胞[1]、黑色素瘤细胞[2]等多种恶性细胞分化，但对于诱导人肝癌细胞分化的报道不多，国内仅见上海医科大学艾兆伟等[3]对人肝癌细胞SMMC-7721细胞诱导分化的报道。本研究进一步观察维酸对Bel-7402人肝癌细胞的分化诱导作用，除采用过去应用的细胞增殖、软琼脂集落形成、甲胎蛋白(AFP)分泌量、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)外，还增加了鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)、碱性磷酸酶(ALP)和醛缩酶(ALD)等指标，以便更全面观察维甲酸对人肝癌细胞的分化诱导作用。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 主要试剂
RPMI-1640培养基为GIBCO公司产品，全反式维甲酸为SIGMA公司产品，四氯化碳、二甲亚砜为NACALAI TESQUE公司产品，甲胎蛋白放免试剂盒由中国原子能科学研究院提供。
1.2 方法
Bel-7402人肝癌细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供[4]。接种于含10%小牛血清pH7.4的RPMI-1640培养基中，置37℃密闭培养。
维甲酸溶于二甲亚砜中，最终用培养液稀释至以往研究确定的浓度10μmol/L。对照组培养液中含0.02%DMSO。各组每天设3个平行样品，每瓶接种2×105个细胞，24h后换含受试药物的培养液，每天换液，对照组只换培养液，连续6d。
每天收集实验组和对照组各3瓶， 培养液经4000r/min离心5min后取上清测AFP；收集细胞在含0.5%Triton X-100的ph 7.4 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中超声(106Hz,1min)破碎细胞，4℃ 10000r/min离心5min，取上清测酶活性及蛋白含量。鸟氨酸氨基甲酰转移酶按Ohshita等人[5]方法测定，碱性磷酸酶按Bowers等人[6]方法测定，酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶和醛缩酶活性以及蛋白含量的测定方法见本研究过去发表的论文[7]。
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软琼脂集落形成试验中琼脂糖用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液配制。24孔培养板底层铺 0.6%琼脂糖0.4ml， 顶层铺0.3%琼脂糖， 并含2000个细胞和受试药物，在37℃5%CO2条件下培养两周，倒置显微镜下用目微尺量度集落大小并计数。
2 结果
10μmol/L维甲酸对细胞增殖有明显抑制作用，第4天以后的抑制率与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。
软琼脂集落形成试验结果维甲酸处理组细胞集落形成率为(2.1±0.97)%，对照组为(5.2±2.83)%，维甲酸处理组显著低于对照组(P<0.05)。
各组AFP分泌量均逐日下降，同一处理天数，维甲酸组AFP分泌量均低于对照组，其中第4,5天显著低于对照组(P<0.05)。
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维甲酸组OCT活性高于对照组，第5天差异非常显著(P<0.01)。
维甲酸组TAT活性逐日上升，第4天起明显高于对照组(P<0.01)。
维甲酸组ALP活性逐日升高，各处理天数均显著高于对照组(P<0.01)。
维甲酸组γ-GT活性逐渐下降,从第2天起显著低于对照组(P<0.05和P<0.01)。
从第1天到第3天，各组细胞ALD活性均上升，第4天开始，维甲酸组ALD的活性逐渐下降，同一处理天数，维甲酸组ALD活性均明显低于对照组，第5天起差异非常显著(P<0.01)。
10μmol/L维甲酸组第4天的各项指标以对照组为100%进行比较，10μmol/L维甲酸抑制Bel-7402细胞增殖、软琼脂集落形成、AFP分泌量、γ-GT和ALD活性，但增高OCT、TAT和ALP活性。
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3 讨论
维甲酸又称视黄酸，是维生素A(视黄醇)的衍生物，维生素A在体内代谢转变产生全反式维甲酸、13-顺维甲酸和9-顺维甲酸等几种异构体，它们与细胞内的维甲酸受体和维甲类X受体结合，受体被激活后与DNA中的维甲酸应答元件(retinoic acid response element,RARE)结合，以时间、剂量依赖的方式调节靶基因的表达，从而调节细胞的正常分化。因此，维甲酸是公认的细胞分化诱导剂。自1980年Honma等人发现全反式维甲酸能诱导人早幼粒白血病细胞分化[1]以来，对维甲酸诱导恶性肿瘤细胞分化引起了高度重视，对人早幼粒白血病的分化治疗已进入了临床阶段，并取得了较好的效果。对人肝癌细胞的分化诱导作用1990年艾兆伟等[3]证明10μmol/L全反式维甲酸能诱导SMMC-7721人肝癌细胞的分化，本研究发现相同剂量的全反式维甲酸处理，显著抑制Bel-7402人肝癌细胞增殖，并使肝癌细胞软琼脂集落形成率明显减少，使代表肝细胞分化的酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶和碱性磷酸酶比活力明显升高，甲胎蛋白分泌量、γ-谷氨酰转肽酶和醛缩酶比活力明显下降，证明全反式维甲酸是Bel-7402人肝癌细胞有效的分化诱导剂。提示维甲酸对人肝癌细胞的诱导分化作用可能具有普遍意义。
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AFP是一各胚胎性蛋白，主要由胚肝产生，在正常成人肝中则无分泌或分泌量甚微，在肝癌中分泌量增高，因此，AFP已被认为是诊断肝癌的标志蛋白。γ-GT在成年鼠肝中活性很低，而在诱癌过程中活性逐渐上升，故γ-GT被认为是肝癌变过程中早期癌前病变的生化标志[8]。另一方面，TAT在正常肝细胞中活性较高而在肝细胞癌变时活性下降，是肝细胞成熟分化的标志之一[9]。上述AFP、γ-GT和TAT三项指标已被用为维甲酸诱导人肝癌细胞分化的观察指标[3]。除此之外，鉴于大鼠肝癌细胞醛缩酶活力明显增高[10]，90年代初，Giani等[11]研究证明，碱性磷酸酶是畸胎瘤细胞的分化标志，同年Fanjul等[12]认为肝型ALP是人胰腺癌Capan-1细胞系的分化标志，考虑到尿素合成是肝细胞特异的功能，尿素合成酶系应该是肝细胞的分化标志，因此，本研究增加OCT、ALP和ALD作为观察人会癌细胞恶性表型逆转的指标。本研究结果表明在诱导肝癌细胞分化过程中OCT、TAT和ALP有一致性的变化，三者均明显升高，说明三者联合应用能更好地观察肝癌细胞的分化。
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参考文献
1 Honma Y,Takenaga K,Ksukabe T,et al.Induction of differentiation of cultured human promyelocytic leukemia cells by retinoids.Biochem Biophys Res Commun, 1980;95:507～512
2 笪冀平，陈乐真，李维华，等.维甲酸诱导恶性黑色素瘤分化的实验研究.中华肿瘤杂志，1992；14(5)；356
3 艾兆伟，查锡良，刘 毅，等.视黄酸对人肝癌细胞浆中某些表型的逆转作用.生物化学与生物物理学报，1990；22(2)：135～140
4 陈瑞铭，朱德厚，叶秀珍，等.人体肝癌体外细胞第BEL-7402的建立及其特征.实验生物学报，1978；11(1)：37～47
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5 Ohshita M,Takeda H,Kamiyama Y,et al.A direct method for the estimation of ornithine carbamoyl transferases activity in serun.Clin Chim Acta,1976;67:145～152
6 Bowers Jr GN,McCorub RB.Tatal alkaline phosphatase activity in human serum.Clin Chem, 1975;21:1988～1995
7 朱文渊，黄 炜，黄济群.丁酸钠对Bel-7402人肝癌细胞几种酶活性的影响.实用癌症杂志，1998；13(3)：187～189
8 Pitot HC,Glauert HP,Hanigan M.The significance of selected biochemical markers in the characterization of putative initiated cell population in rodent liver.Cancer Lett, 1985;29:1～14
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9 盛宗梅，陈惠黎.H615肝癌和HepA腹水肝癌的酶学比较Ⅱ.酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶的活力及诱导的变化.上海第一医学院学报，1983；10(4)：283～288
10 盛宗梅，陈惠黎.H615肝癌和HepA腹水肝癌的酶学比较Ⅰ.丙酮酸激酶和醛缩酶活力及其同工酶谱的变化.上海第一医学院学报，1983；10(2)：125～131
11 Giani M,Studer M,Carpani G,et al.Retinoic acid induces liver/bone/kindney-type alkaline phosphatase gene expressionin F9 teratocarcinoma cell.Biochem J,1991;274:673～678
12 Fanjul M,Theveniau M,Palecoby C,et al.Expression and characterization of alkaline phosphatases during differentiation of human pancreatic cancer (Capan-1) cells in culture.Biol Cell,1991;73:15～25
收稿日期：1999-02-04, 百拇医药