人脑胶质瘤中增殖细胞核抗原、p53、p21ras及EGFR蛋白的表达
作者：陈礼刚 曾凡俊 李讯 匡永勤 杨立斌 张健民 卢敏
单位：成都军区总医院神经外科(成都 610083)
关键词：神经胶质瘤；基因表达；免疫组化
中国现代医学杂志000207 目的：探讨人脑胶质瘤中多种基因蛋白的异常表达及意义。方法：应用免疫组化技术检测102例手术切除人脑胶质瘤组织标本中增殖细胞核抗原(PCNA)及p53，p21ras及EGFR蛋白的表达。胶质瘤组织PCNA标记指数(PCNALI)为55.6±15.5，p53，p21ras及EGFR蛋白的表达率分别为58.6%，52.3%，42%，均显著高于正常脑组织。PCNALI及EGFR蛋白表达与胶质瘤恶性程度相关(P<0.01)，p53，p21ras及EGFR蛋白的表达与胶质瘤恶性程度无关(P>0.05)。胶质瘤中PCNALI与EGFR蛋白表达无明显相关(P>0.05)，而与p53和p21ras表达相关(P<0.05)。结论：p53，p21ras和EGFR异常表达与胶质瘤的发生发展相关，PCNALI是评估增殖活性的良好指标。
, 百拇医药
分类号 R730.264
THE EXPRESSION OF PCNA, P53, P21Ras AND EGFR PROTEINS
IN HUMAN GLIOMAS
Chen Ligang,Zeng Fanjun,Li Xu, et al.
(Department of Neurosurgery,Chendu General Hospital of PLA,Chendu,Sichuan 610083)
Objectives:To investigate the roles of expression of multiple genetic markers in the development and progress of human gliomas.Methods:The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), P53, P21ras and epidermal growth factor receptor (EGFR) were detected in 102 surgically resected glioma specimens with immunohistochemical techniques.Results:The results showed that the marking index of PCNA L1 in glioma was 55.6±15.5 and the expression rates of P53, P21eas and EGFR proteins were 38.6%, 52.3% and 42.0%, respectively. PCNA L1 and the expression of EGFR were correlated with the degree of the malignancy of gliomas (P<0.05). PCNA L1 was correlated with the expression of P53 and P21ras (P<0.05).Conclusions:These founding suggest that the abnormal expression of P53, P21ras and EGFR were correlated with the development and progress of human glioma, and PCNA can reflect the malignancy degree of glioma to a certain extent.
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Key Words:Glioma;Gene Expression;Immunohistochemistry
作者用ABC免疫组化法在同一张病理切片中对胶质瘤中增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)，p53，p21ras和EGFR蛋白的表达进行分析，探讨这些基因表达与胶质瘤发生发展的关系。
1 材料与方法
1.1 组织标本
收集本院1990～1997年手术切除脑胶质瘤标本的102例，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色并经病理诊断证实胶质瘤无疑(按WBO脑瘤分类)。另取14例正常脑组织为对照。
1.2 试剂与染色方法
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鼠抗人PCNA单克隆抗体为美国ZYMed公司产品，鼠抗人p53(D-1)、p21ras、单克隆抗体为Dako公司产品，EGFR多克隆抗体为美国SANTA CRUZ公司产品，ABC试剂为Sigma公司产品。免疫组化参照文献[1]进行，具体染色步骤，石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇至水；0.3%H2O2-甲醛阻断内源酶；将切片置于0.01mol%LPH6.0棕檬酸缓冲液中，于微波炉Defrost挡修复抗原15min，正常血清封闭，消除非特异性染色；加一抗(PCNA1∶180,p53 1∶40,p21ras 1∶80,EGFR 1∶120) 4℃过夜，再分别加入二抗及ABC复合物，室温反应1.5h，DAB呈色，对照试验：阳性对照，用已知阳性片重复染色；阴性对照，正常脑组织片染色；替代对照，用正常羊血清替代一抗。
1.3 结果判断
参考文献[2～4]和病理科医师一起判断PCNA，p53，p21ras及EGFR阳性细胞。其中PCNA阳性结果采用标记指数(Labeling index,LI)表达，以百分率表示，即随计数1000个细胞中阳性细胞所占的百分比。
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2 结果
胶质瘤组织中PCNALI为55.6±15.5；p53，p21ras和EGFR蛋白阳性表达率分别为58.6%，52.3%和42%，正常脑组织中未发现确切的PCNA，p53，p21ras和EGFR阳性细胞。与文献报告相近[2～4]。
等级相关分析表明，PCNALI，EGFR与胶质瘤的级别呈正相关。
102例胶质瘤中，32例同时检出2和/或3种癌基因蛋白表达，其中同时表达p53和EGFR蛋白者24例，同时表达p53和p21ras蛋白10例，同时表达及EGFR蛋白同时表达EGFR蛋白和p21ras蛋白14例，经配对计数资料χ2检验，以上3种蛋白无显著相关性(P>0.05)。
3 讨论
癌基因和抑癌基因突变与表达是胶质瘤的研究热点之一，但其结果和意义有争议[3，4]。本研究发现，胶质瘤中既存在抑癌基因p53的失活，又存在癌基因p21ras激活，也存在PCNA及EGFR的表达异常。而且近1/3病例同时存在2种以上癌基因蛋白的表达，提示多种基因异常的逐渐累积可能与胶质瘤发生发展密切相关。
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PCNA是存在于细胞核内的酸性蛋白，目前已将它视为S期细胞的标志物，用于细胞增殖动力学研究[5]。作者的研究发现，脑胶质瘤细胞增殖活性显著高于正常脑组织，并且与胶质瘤恶性程度密切相关。本研究还发现p53和p21ras蛋白染色阳性组PCNALI显著高于染色阴性组(在p53，p21ras阳性的胶质瘤中，PCNA高表达率分别为(66.8±14.5)和(66.0±22.5)，显著高于阴性病例表达)，提示p53和p21ras蛋白的表达与细胞增殖密切相关。
EGFR基因扩增作为胶质瘤最常见的遗传学异常之一[6]，我们的研究也显示了其高表达率，且与恶性程度有关，与Pigott等[6]报道相似。作者研究还发现，EGFR表达与PCNA无明显相关，说明EGFR不是主要的促有丝分裂因子。但鉴于其表达与胶质瘤发生过程的密切相关性，一方面可以以基因工程手段封闭EGFR的mRNA表达，从而阻止胶质瘤的恶性进展，这可能有助于胶质瘤的治疗。
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同步检测胶质瘤p53，p21ras和EGFR蛋白表达研究，目前鲜见报道[1～6]。本研究发现部分病例同时存在2种或3种上述蛋白表达，但经统计提示，三者表达并无显著相关性，说明三者的表达异常是相互独立的改变，各自通过不同途径在胶质瘤的发生发展中起作用。
参考文献
1 Haerslev T,Jacobsen GK.Microwave processing for immunohistochemical demonstration of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue.Apmis,1994;102(5):395
2 Vigliani MC,Chio A,Pezzulo T,et al.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA) in low grade astrocytomas:its prognostic significant.Tumori,1994;80:295
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3 Van Meyll DJ,Ramsay DA,casson AG,et al.p53 mutation,expression,and DNA ploidy in evolving gliomas:evidence for two pathways of progression.J Natl Cancer Inst,1994;86:1011
4 Mashigama S,Murakami Y,Yoshimoto T,et al.Detection of p53 gene mutation in human brain tumors by single strand conformation analysis of polymerase chain reaction produce.Oncogene,1991;6:1313
5 Kolodzieijcgzyk P,Yao TT,Oya M,et al.long term follow-up study of patients with gastric adenomas with malignant transformation.Cancer,1994;74(11):2896
6 Pigott TT,Robson DK,Palmer J,et al.Expression of epidermal growth ractor receptor in human glioblastom multiforme,Br J Neurosurg,1993;7:261
收稿日期：1998-12-31, 百拇医药
单位：成都军区总医院神经外科(成都 610083)
关键词：神经胶质瘤；基因表达；免疫组化
中国现代医学杂志000207 目的：探讨人脑胶质瘤中多种基因蛋白的异常表达及意义。方法：应用免疫组化技术检测102例手术切除人脑胶质瘤组织标本中增殖细胞核抗原(PCNA)及p53，p21ras及EGFR蛋白的表达。胶质瘤组织PCNA标记指数(PCNALI)为55.6±15.5，p53，p21ras及EGFR蛋白的表达率分别为58.6%，52.3%，42%，均显著高于正常脑组织。PCNALI及EGFR蛋白表达与胶质瘤恶性程度相关(P<0.01)，p53，p21ras及EGFR蛋白的表达与胶质瘤恶性程度无关(P>0.05)。胶质瘤中PCNALI与EGFR蛋白表达无明显相关(P>0.05)，而与p53和p21ras表达相关(P<0.05)。结论：p53，p21ras和EGFR异常表达与胶质瘤的发生发展相关，PCNALI是评估增殖活性的良好指标。
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分类号 R730.264
THE EXPRESSION OF PCNA, P53, P21Ras AND EGFR PROTEINS
IN HUMAN GLIOMAS
Chen Ligang,Zeng Fanjun,Li Xu, et al.
(Department of Neurosurgery,Chendu General Hospital of PLA,Chendu,Sichuan 610083)
Objectives:To investigate the roles of expression of multiple genetic markers in the development and progress of human gliomas.Methods:The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), P53, P21ras and epidermal growth factor receptor (EGFR) were detected in 102 surgically resected glioma specimens with immunohistochemical techniques.Results:The results showed that the marking index of PCNA L1 in glioma was 55.6±15.5 and the expression rates of P53, P21eas and EGFR proteins were 38.6%, 52.3% and 42.0%, respectively. PCNA L1 and the expression of EGFR were correlated with the degree of the malignancy of gliomas (P<0.05). PCNA L1 was correlated with the expression of P53 and P21ras (P<0.05).Conclusions:These founding suggest that the abnormal expression of P53, P21ras and EGFR were correlated with the development and progress of human glioma, and PCNA can reflect the malignancy degree of glioma to a certain extent.
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Key Words:Glioma;Gene Expression;Immunohistochemistry
作者用ABC免疫组化法在同一张病理切片中对胶质瘤中增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)，p53，p21ras和EGFR蛋白的表达进行分析，探讨这些基因表达与胶质瘤发生发展的关系。
1 材料与方法
1.1 组织标本
收集本院1990～1997年手术切除脑胶质瘤标本的102例，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色并经病理诊断证实胶质瘤无疑(按WBO脑瘤分类)。另取14例正常脑组织为对照。
1.2 试剂与染色方法
, 百拇医药
鼠抗人PCNA单克隆抗体为美国ZYMed公司产品，鼠抗人p53(D-1)、p21ras、单克隆抗体为Dako公司产品，EGFR多克隆抗体为美国SANTA CRUZ公司产品，ABC试剂为Sigma公司产品。免疫组化参照文献[1]进行，具体染色步骤，石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇至水；0.3%H2O2-甲醛阻断内源酶；将切片置于0.01mol%LPH6.0棕檬酸缓冲液中，于微波炉Defrost挡修复抗原15min，正常血清封闭，消除非特异性染色；加一抗(PCNA1∶180,p53 1∶40,p21ras 1∶80,EGFR 1∶120) 4℃过夜，再分别加入二抗及ABC复合物，室温反应1.5h，DAB呈色，对照试验：阳性对照，用已知阳性片重复染色；阴性对照，正常脑组织片染色；替代对照，用正常羊血清替代一抗。
1.3 结果判断
参考文献[2～4]和病理科医师一起判断PCNA，p53，p21ras及EGFR阳性细胞。其中PCNA阳性结果采用标记指数(Labeling index,LI)表达，以百分率表示，即随计数1000个细胞中阳性细胞所占的百分比。
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2 结果
胶质瘤组织中PCNALI为55.6±15.5；p53，p21ras和EGFR蛋白阳性表达率分别为58.6%，52.3%和42%，正常脑组织中未发现确切的PCNA，p53，p21ras和EGFR阳性细胞。与文献报告相近[2～4]。
等级相关分析表明，PCNALI，EGFR与胶质瘤的级别呈正相关。
102例胶质瘤中，32例同时检出2和/或3种癌基因蛋白表达，其中同时表达p53和EGFR蛋白者24例，同时表达p53和p21ras蛋白10例，同时表达及EGFR蛋白同时表达EGFR蛋白和p21ras蛋白14例，经配对计数资料χ2检验，以上3种蛋白无显著相关性(P>0.05)。
3 讨论
癌基因和抑癌基因突变与表达是胶质瘤的研究热点之一，但其结果和意义有争议[3，4]。本研究发现，胶质瘤中既存在抑癌基因p53的失活，又存在癌基因p21ras激活，也存在PCNA及EGFR的表达异常。而且近1/3病例同时存在2种以上癌基因蛋白的表达，提示多种基因异常的逐渐累积可能与胶质瘤发生发展密切相关。
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PCNA是存在于细胞核内的酸性蛋白，目前已将它视为S期细胞的标志物，用于细胞增殖动力学研究[5]。作者的研究发现，脑胶质瘤细胞增殖活性显著高于正常脑组织，并且与胶质瘤恶性程度密切相关。本研究还发现p53和p21ras蛋白染色阳性组PCNALI显著高于染色阴性组(在p53，p21ras阳性的胶质瘤中，PCNA高表达率分别为(66.8±14.5)和(66.0±22.5)，显著高于阴性病例表达)，提示p53和p21ras蛋白的表达与细胞增殖密切相关。
EGFR基因扩增作为胶质瘤最常见的遗传学异常之一[6]，我们的研究也显示了其高表达率，且与恶性程度有关，与Pigott等[6]报道相似。作者研究还发现，EGFR表达与PCNA无明显相关，说明EGFR不是主要的促有丝分裂因子。但鉴于其表达与胶质瘤发生过程的密切相关性，一方面可以以基因工程手段封闭EGFR的mRNA表达，从而阻止胶质瘤的恶性进展，这可能有助于胶质瘤的治疗。
, 百拇医药
同步检测胶质瘤p53，p21ras和EGFR蛋白表达研究，目前鲜见报道[1～6]。本研究发现部分病例同时存在2种或3种上述蛋白表达，但经统计提示，三者表达并无显著相关性，说明三者的表达异常是相互独立的改变，各自通过不同途径在胶质瘤的发生发展中起作用。
参考文献
1 Haerslev T,Jacobsen GK.Microwave processing for immunohistochemical demonstration of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue.Apmis,1994;102(5):395
2 Vigliani MC,Chio A,Pezzulo T,et al.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA) in low grade astrocytomas:its prognostic significant.Tumori,1994;80:295
, 百拇医药
3 Van Meyll DJ,Ramsay DA,casson AG,et al.p53 mutation,expression,and DNA ploidy in evolving gliomas:evidence for two pathways of progression.J Natl Cancer Inst,1994;86:1011
4 Mashigama S,Murakami Y,Yoshimoto T,et al.Detection of p53 gene mutation in human brain tumors by single strand conformation analysis of polymerase chain reaction produce.Oncogene,1991;6:1313
5 Kolodzieijcgzyk P,Yao TT,Oya M,et al.long term follow-up study of patients with gastric adenomas with malignant transformation.Cancer,1994;74(11):2896
6 Pigott TT,Robson DK,Palmer J,et al.Expression of epidermal growth ractor receptor in human glioblastom multiforme,Br J Neurosurg,1993;7:261
收稿日期：1998-12-31, 百拇医药