基因DNA双链四色荧光单道测序的实验研究
作者：顾其华 李玲芝 况艳春 李修荣 叶爱慧 舒畅 曾滢
单位：顾其华 李玲芝 况艳春 李修荣 叶爱慧(湖南省怀化市第一人民医院(418000))；舒畅(湖南医科大学附属湘雅医院)
关键词：基因；荧光标记；毛细管电泳；测序
中国现代医学杂志000234 分类号 R5
作者采用四色荧光单道法对PCR产物双链直接测序，通过改进操作方法，获得成功。
1 材料与方法
1.1 材料
手术留标本或纤维支气管镜钳取病变或可疑病变组织，用生理盐水于4℃保存，同时送病检对照。
, 百拇医药
310型DNA测序仪，2400型PCR仪为美国PE公司产，微量高速离心机为北京六一仪器厂产，电泳仪由湖南仪器厂产，末端标记试剂盒、测序胶、分析缓冲液、模板分散剂由美国PE公司进口，TaqDNA聚合酶、10X扩增缓冲液由加拿大Sangon公司进口，电泳级琼脂糖由中国科学院上海药物所产，引物由中国科学院上海细胞所合成，其它试剂采用国产分析纯试剂配制而成。
1.2 方法
DNA提取：取活检组织，用无菌生理盐水洗净，剪碎，玻璃棒匀浆，用含EDTA及SDS的消化缓冲液-蛋白酶K的消化液于55℃水浴中消化2h，再用苯酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，TE溶解DNA，紫外光下鉴定DNA质量。
目的基因扩增及产物回收：引物序列：引物1，5’GTGTTGTCTCCTAGGTTGGCTCTGACTG3’，引物2，5’GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT-GCT3’。取基因组DNA 1μg,引物各25pmol,dN-TP,10xBuffer，MgCl等各适量及HO，配制5μl反应体系，进行扩增反应：96℃预变性7min，94℃下加入TaqDNA聚合酶，94℃变性30s,55℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次，最后72℃ 7min充分延伸。将扩增产物用琼糖凝胶电泳，在紫外光下切下产物，加热使凝胶溶解，再用苯酚氯仿抽提，酒精沉淀，洗涤，TE溶解。
, 百拇医药
序列测定：与扩增用一对引物，分别从两头开始测序，取扩增的双链板200ng，引物5pmol，四色荧光标记试剂盒8μl,HO适量，配制2μl反应体系，做测序反应：96℃预变性20s，96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4s，循环25次。标记产物用酒精沉淀纯化，待沉淀干燥后加入模板抑制剂(TSR)25μl溶解，混匀，95℃变性2min后置于冰上迅速冷却，再上310遗传分析仪测序，读序。
2 结果
用这种方法对PCR产物双链测序结果很理想，信号清晰，均匀，本底低，一次测序可达600bp。与单链模板自动测序比较更简便实用，其优势由附表可见。
附表 dsDNA与ssDNA模板自动测序比较
DNA提取
模板制备
, http://www.100md.com
模板收集
所用时间
(d)
成本费
(元)
dsDNA
苯酚-氯仿抽提
一次扩增
一次收集
3
400
ssDNA
苯酚-氯仿抽提
, 百拇医药
二次扩增
二次收集
4
500
3 讨论
对于DNA测序，模板的质量是关键，由于双链与单链性质上的差异，测序反应的效率不同，对双链模板的质量要求更高[1，2]。用QIAquick spin纯化柱回收的模板中含有一定量的非特异性产物及短片段DNA，且回收量较少。非特异性DNA片段的存在影响测序反应效率，用这种方法纯化的单链模板测序，结果显示本底较高，但仍可读序。用这种方法纯化的双链模板测序则导致实验失败。将PCR产物双链进行普通琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下切下产物带，加热熔解，苯酚-氯仿抽提，酒精沉淀。保证了模板的质量，也除去了EB等杂质。再对模板及引物的用量做适当调整，测序反应前加96℃ 20s预变性。模板纯化采用低熔点胶也可，但低熔点胶需进口且昂贵。经如上改进后，测序结果极佳，且操作简便，实验材料易取得，是一种易推广的好方法。用dsDNA进行测序还具有一个优势[3]：即模板的制备，dsDNA则是由基因组DNA经一次扩增的产物，ssDNA则是由基因组DNA经一次扩增的产物，前者更接近基因组DNA，结果更接近实际情况(尽管扩增时碱基错配的概率很小)。
, 百拇医药
综上所述，用dsDNA直接测序方法简捷，省时省资，结果可信，在分子生物研究领域和临床基因诊断中有重大实用价值，有推广价值。
参考文献
1 Sanger FS,Niklen and coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc Natl Acad Sci,1977;74:5463
2 Mullis KF,Faloons S,Scharf R,et al.Specific engymafic amplification of DNA in vitro:The polymerase chain reaction.Cold spring Harbor Quant Biol,1986;51:263
3 Chen EY,and Seeberg PH.Supercoil seqnencing:Afast and simple method for seqnencing plasmid DNA.1985;4:165
(收稿日期：1999-06-10), http://www.100md.com
单位：顾其华 李玲芝 况艳春 李修荣 叶爱慧(湖南省怀化市第一人民医院(418000))；舒畅(湖南医科大学附属湘雅医院)
关键词：基因；荧光标记；毛细管电泳；测序
中国现代医学杂志000234 分类号 R5
作者采用四色荧光单道法对PCR产物双链直接测序，通过改进操作方法，获得成功。
1 材料与方法
1.1 材料
手术留标本或纤维支气管镜钳取病变或可疑病变组织，用生理盐水于4℃保存，同时送病检对照。
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310型DNA测序仪，2400型PCR仪为美国PE公司产，微量高速离心机为北京六一仪器厂产，电泳仪由湖南仪器厂产，末端标记试剂盒、测序胶、分析缓冲液、模板分散剂由美国PE公司进口，TaqDNA聚合酶、10X扩增缓冲液由加拿大Sangon公司进口，电泳级琼脂糖由中国科学院上海药物所产，引物由中国科学院上海细胞所合成，其它试剂采用国产分析纯试剂配制而成。
1.2 方法
DNA提取：取活检组织，用无菌生理盐水洗净，剪碎，玻璃棒匀浆，用含EDTA及SDS的消化缓冲液-蛋白酶K的消化液于55℃水浴中消化2h，再用苯酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，TE溶解DNA，紫外光下鉴定DNA质量。
目的基因扩增及产物回收：引物序列：引物1，5’GTGTTGTCTCCTAGGTTGGCTCTGACTG3’，引物2，5’GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT-GCT3’。取基因组DNA 1μg,引物各25pmol,dN-TP,10xBuffer，MgCl等各适量及HO，配制5μl反应体系，进行扩增反应：96℃预变性7min，94℃下加入TaqDNA聚合酶，94℃变性30s,55℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次，最后72℃ 7min充分延伸。将扩增产物用琼糖凝胶电泳，在紫外光下切下产物，加热使凝胶溶解，再用苯酚氯仿抽提，酒精沉淀，洗涤，TE溶解。
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序列测定：与扩增用一对引物，分别从两头开始测序，取扩增的双链板200ng，引物5pmol，四色荧光标记试剂盒8μl,HO适量，配制2μl反应体系，做测序反应：96℃预变性20s，96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4s，循环25次。标记产物用酒精沉淀纯化，待沉淀干燥后加入模板抑制剂(TSR)25μl溶解，混匀，95℃变性2min后置于冰上迅速冷却，再上310遗传分析仪测序，读序。
2 结果
用这种方法对PCR产物双链测序结果很理想，信号清晰，均匀，本底低，一次测序可达600bp。与单链模板自动测序比较更简便实用，其优势由附表可见。
附表 dsDNA与ssDNA模板自动测序比较
DNA提取
模板制备
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模板收集
所用时间
(d)
成本费
(元)
dsDNA
苯酚-氯仿抽提
一次扩增
一次收集
3
400
ssDNA
苯酚-氯仿抽提
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二次扩增
二次收集
4
500
3 讨论
对于DNA测序，模板的质量是关键，由于双链与单链性质上的差异，测序反应的效率不同，对双链模板的质量要求更高[1，2]。用QIAquick spin纯化柱回收的模板中含有一定量的非特异性产物及短片段DNA，且回收量较少。非特异性DNA片段的存在影响测序反应效率，用这种方法纯化的单链模板测序，结果显示本底较高，但仍可读序。用这种方法纯化的双链模板测序则导致实验失败。将PCR产物双链进行普通琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下切下产物带，加热熔解，苯酚-氯仿抽提，酒精沉淀。保证了模板的质量，也除去了EB等杂质。再对模板及引物的用量做适当调整，测序反应前加96℃ 20s预变性。模板纯化采用低熔点胶也可，但低熔点胶需进口且昂贵。经如上改进后，测序结果极佳，且操作简便，实验材料易取得，是一种易推广的好方法。用dsDNA进行测序还具有一个优势[3]：即模板的制备，dsDNA则是由基因组DNA经一次扩增的产物，ssDNA则是由基因组DNA经一次扩增的产物，前者更接近基因组DNA，结果更接近实际情况(尽管扩增时碱基错配的概率很小)。
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综上所述，用dsDNA直接测序方法简捷，省时省资，结果可信，在分子生物研究领域和临床基因诊断中有重大实用价值，有推广价值。
参考文献
1 Sanger FS,Niklen and coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc Natl Acad Sci,1977;74:5463
2 Mullis KF,Faloons S,Scharf R,et al.Specific engymafic amplification of DNA in vitro:The polymerase chain reaction.Cold spring Harbor Quant Biol,1986;51:263
3 Chen EY,and Seeberg PH.Supercoil seqnencing:Afast and simple method for seqnencing plasmid DNA.1985;4:165
(收稿日期：1999-06-10), http://www.100md.com