细胞水化状态对肝细胞膜Na+/K+-ATP酶活性的调节
作者：赵利斌 严福明 刘国栋 郝飞
单位：赵利斌(中国人民解放军第161中心医院(武汉 430010))；严福明(中国人民解放军第161中心医院(武汉 430010))；刘国栋(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心)；郝 飞(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心)
关键词：肝细胞水化状态；Na+；K+-ATP酶
中国现代医学杂志000222 目的：探讨不等渗培养条件下肝细胞水化状态(即容积)改变对肝细胞膜Na+/K+-ATP酶活性的调节作用及对细胞蛋白合成代谢的影响。方法：动态观察不同渗透压培养的鼠肝细胞膜Na+/K+-ATP酶活性、[3H]亮氨酸掺入量及培养上清液中ALT、AST、LDH活性。结果：低渗培养膜酶活性随培养时间延长逐渐降低，高渗组逐渐增高，与等渗组比较差异非常显著(P值分别<0.01)。膜酶活性与[3H]掺入量在低渗组呈非常显著负相关，高渗组呈显著正相关(P<0.001)。同期培养上清液ALT、AST、LDH活性在正常范围内波动。结论：高渗状态可以激活肝细胞膜Na+/K+-ATP酶，低渗状态则呈抑制状态，以此作为引发调节肝细胞蛋白代谢的一种生理性因素。
, 百拇医药
分类号 R329.2
细胞水化状态(即细胞容积)作为一种代谢触发信号民肝细胞功能状态密切相关，对细胞功能的调节及其在生理和疾病状态下的意义也日益引起关注[1～3]，但是有关肝细胞水化状态变化导致细胞代谢改变的机制尚不清楚。本研究旨在观察细胞水化状态变化后，膜Na+/K+-ATP酶活性变化规律，并探讨这一变化规律对细胞蛋白合成代谢的影响。
1 材料与方法
1.1 鼠肝细胞分离
选择雄性Wistar大鼠(180～200g)，用体外肝细胞灌洗法[4]分离提纯鼠肝细胞。证实活性在90%以上预培养20h。换三种渗透压(210mOsm,320mOsm,450mOsm)培养基(作[3H]掺入，培养基中含[3H]740kBq或20μci/ml)。用超微量渗量计核准渗透压，于培养30，60，90和120min检测，等渗(320mOsm)培养组所测指标作对照组。
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1.2 肝细胞容积测定
用F-800全自动血细胞计数仪测定肝细胞容积[5]，以f1表示。
1.3 肝细胞膜提取及膜Na+/K+-ATP酶测定
按任蕴芳等[6]方法提取肝细胞膜并培养后，用Lowry法测定蛋白含量，并用分离介质调蛋白浓度为1mg/ml，反应总体积1ml。分A，B，C三组。用钼蓝比色法测定Na+/K+-ATP酶活性[7]，酶活性单位以nmolPi/mgpr-1.min-1表示。酶活性计算公式：
总ATP酶活性＝B管(膜管)活性-A管(膜空白对照管)活性
, 百拇医药
Mg2+-ATP酶活性＝总ATP酶活性-Mg2+-ATP酶活性
1.4 [3H]亮氨酸掺入
按常规[3H]掺入的每分衰变率(dpm)，换算为fmol/mgpr。
1.5 ALT、AST、LDH活性测定
CX-7全自动生化分析仪测定同期培养上清液中ALT、AST、LDH活性。
2 结果
容积在低渗组最大，高渗组最小，与等渗组比较有非常显著差异(P<0.001)。
等渗组肝细胞Na+/K+-ATP酶活性在92.71～95.00nmolPi/mgpr-1.min-1间波动，低渗组随时间延长逐渐降低，高渗组逐渐升高，培养60～120min与等渗组比较有显著差异。
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培养上清液中ALT、AST、LDH活性变化，培养观察期间上清液中ALT、AST、LDH活性始终在正常临界范围波动。
3 讨论
肝细胞水化状态对肝细胞膜Na+/K+-ATP酶活性影响的研究，尚未见报道。动态测定肝细胞水化状态改变后膜Na+/K+-ATP酶活性发现，与等渗组比较，高渗组膜酶活性随时间延长逐渐增高，低渗组膜酶活性逐渐降低。提示肝细胞水化状态可以影响Na+/K+-ATP酶活性。肝细胞水化状态影响膜Na+/K+-ATP酶活性的机制尚不清楚，可能是由于高渗暴露肝细胞容积于十几分钟发生变化后，其周围Na+迅速向胞内渗漏，使胞内Na+很快集聚，激活了膜Na+/K+-ATP酶，在消耗ATP同时将Na+泵出细胞；反之，低渗暴露肝细胞，水分快速进入细胞，导致稀释性低Na+，膜酶活性受抑制，阻止Na+/K+继续交换，使细胞内环境稳定得以维持。实验表明，肝细胞水化状态改变先于肝细胞膜Na+/K+-ATP酶活性的变化，而膜酶活性改变反过来促使肝细胞水化状态进一步变化。
, 百拇医药
有研究认为，肝细胞水化状态是控制蛋白分解的重要因素，细胞肿胀时抑制蛋白分解并激活合成，而皱缩时则完全相反[1]。本研究结果显示在培养期内(120min),[3H]亮氨酸蛋白掺入活性以等渗组最高。与等渗组比较，低渗组轻度抑制(P>0.05)，而高渗组显著抑制(P<0.001)，与其他学者报道较为接近[8～10]。肝细胞水化状态导致膜Na+/K+-ATP酶活性与蛋白合成变化的关系尚未阐明。将膜酶活性与[3H]亮氨酸蛋白掺入量作相关分析发现，低渗时两者有显著负相关，而高渗时呈显著正相关(P<0.001)，说明高渗时膜Na+/K+-ATP酶激活，消耗细胞内能量，使细胞内蛋白合成受影响，反之低渗时膜酶活性抑制，可能对细胞内蛋白合成有利。进而推测Na+/K+-ATP酶活性增高为一耗能过程，可能与蛋白合成竞争利用能量。此外不排除Na+/K+-ATP膜活性改变通过其他机制，直接或间接地影响细胞内蛋白合成，也不排除因蛋白合成代谢改变反过来对膜酶活性的影响。
, 百拇医药
为证明肝细胞水化状态改变与上述代谢变化的的本质，选择检测同期培养上清液中，反映肝细胞损伤的指标ALT、AST、LDH活性。发现在培养期内，酶活性最高数值始终在正常临界范围波动，这可能与肝细胞肿胀膜通透性增高，酶溢出有关，而非肝细胞病理损伤所致。同时说明不同渗透压培养肝细胞酶活性变化以及蛋白合成激活或抑制与细胞水化状态关联，属生理性改变。这与国外同类研究的结果相一致[1]。肝细胞水化状态作为代谢调节因子，对人体一系列生理代谢的影响尚有待更深入的研究。
参考文献
1 Hussinger D,Schliess F.Cell volume and hepatocellular function.J Hepatol 1995;22:94～100
2 Agius L,Peak M,Beresford G,et al.The role of ion content and cell volume in insulin action.Bichem Soc Trans 1994;22:516～522
, 百拇医药
3 Hussinger D,Roth E,Lang F,et al.Cellular hydration state:an important determinant of protein catabolism in health and disease.Lancet 1993;341:1330～1332
4 王宇明，陈国致，董家鸿，等.分离肝细胞的一种体外灌流法.中华消化杂志，1994；14(3)：175
5 赵利斌，薛 强，郝 飞，等.分离的鼠肝细胞不等渗培养条件下的容积测定.第三军医大学学报，1998；20(2)：180～182
6 孙志贤主编.现代生物化学理论与研究技术.北京：军事医学科学出版社，1995：300～301
7 Unverferth DV,Lee SW,Wallick ET.Human myocardial adenosine triphosphatase activities in health and heart failure.Am Heart J 1988;115:139～146
, 百拇医药
8 Hussinger D,Lang F,Gerok W.Regulation of cell function by the cellular hydration state.Am J physiol 1994;267:E343～355
9 Holen L,Gordon PB,Seglen PO.Inhibition of hepatocytic autophagy by okadaic acid and other protein phosphatase inhibitors.Eur J Biochem 1993;215:113～122
10 Stoll B,Gerok W,Land F,et al.Liver cell volume and protein synthesis.Biochem J 1992;287:217～222
收稿日期：1998-10-29, 百拇医药
单位：赵利斌(中国人民解放军第161中心医院(武汉 430010))；严福明(中国人民解放军第161中心医院(武汉 430010))；刘国栋(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心)；郝 飞(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心)
关键词：肝细胞水化状态；Na+；K+-ATP酶
中国现代医学杂志000222 目的：探讨不等渗培养条件下肝细胞水化状态(即容积)改变对肝细胞膜Na+/K+-ATP酶活性的调节作用及对细胞蛋白合成代谢的影响。方法：动态观察不同渗透压培养的鼠肝细胞膜Na+/K+-ATP酶活性、[3H]亮氨酸掺入量及培养上清液中ALT、AST、LDH活性。结果：低渗培养膜酶活性随培养时间延长逐渐降低，高渗组逐渐增高，与等渗组比较差异非常显著(P值分别<0.01)。膜酶活性与[3H]掺入量在低渗组呈非常显著负相关，高渗组呈显著正相关(P<0.001)。同期培养上清液ALT、AST、LDH活性在正常范围内波动。结论：高渗状态可以激活肝细胞膜Na+/K+-ATP酶，低渗状态则呈抑制状态，以此作为引发调节肝细胞蛋白代谢的一种生理性因素。
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分类号 R329.2
细胞水化状态(即细胞容积)作为一种代谢触发信号民肝细胞功能状态密切相关，对细胞功能的调节及其在生理和疾病状态下的意义也日益引起关注[1～3]，但是有关肝细胞水化状态变化导致细胞代谢改变的机制尚不清楚。本研究旨在观察细胞水化状态变化后，膜Na+/K+-ATP酶活性变化规律，并探讨这一变化规律对细胞蛋白合成代谢的影响。
1 材料与方法
1.1 鼠肝细胞分离
选择雄性Wistar大鼠(180～200g)，用体外肝细胞灌洗法[4]分离提纯鼠肝细胞。证实活性在90%以上预培养20h。换三种渗透压(210mOsm,320mOsm,450mOsm)培养基(作[3H]掺入，培养基中含[3H]740kBq或20μci/ml)。用超微量渗量计核准渗透压，于培养30，60，90和120min检测，等渗(320mOsm)培养组所测指标作对照组。
, http://www.100md.com
1.2 肝细胞容积测定
用F-800全自动血细胞计数仪测定肝细胞容积[5]，以f1表示。
1.3 肝细胞膜提取及膜Na+/K+-ATP酶测定
按任蕴芳等[6]方法提取肝细胞膜并培养后，用Lowry法测定蛋白含量，并用分离介质调蛋白浓度为1mg/ml，反应总体积1ml。分A，B，C三组。用钼蓝比色法测定Na+/K+-ATP酶活性[7]，酶活性单位以nmolPi/mgpr-1.min-1表示。酶活性计算公式：
总ATP酶活性＝B管(膜管)活性-A管(膜空白对照管)活性
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Mg2+-ATP酶活性＝总ATP酶活性-Mg2+-ATP酶活性
1.4 [3H]亮氨酸掺入
按常规[3H]掺入的每分衰变率(dpm)，换算为fmol/mgpr。
1.5 ALT、AST、LDH活性测定
CX-7全自动生化分析仪测定同期培养上清液中ALT、AST、LDH活性。
2 结果
容积在低渗组最大，高渗组最小，与等渗组比较有非常显著差异(P<0.001)。
等渗组肝细胞Na+/K+-ATP酶活性在92.71～95.00nmolPi/mgpr-1.min-1间波动，低渗组随时间延长逐渐降低，高渗组逐渐升高，培养60～120min与等渗组比较有显著差异。
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培养上清液中ALT、AST、LDH活性变化，培养观察期间上清液中ALT、AST、LDH活性始终在正常临界范围波动。
3 讨论
肝细胞水化状态对肝细胞膜Na+/K+-ATP酶活性影响的研究，尚未见报道。动态测定肝细胞水化状态改变后膜Na+/K+-ATP酶活性发现，与等渗组比较，高渗组膜酶活性随时间延长逐渐增高，低渗组膜酶活性逐渐降低。提示肝细胞水化状态可以影响Na+/K+-ATP酶活性。肝细胞水化状态影响膜Na+/K+-ATP酶活性的机制尚不清楚，可能是由于高渗暴露肝细胞容积于十几分钟发生变化后，其周围Na+迅速向胞内渗漏，使胞内Na+很快集聚，激活了膜Na+/K+-ATP酶，在消耗ATP同时将Na+泵出细胞；反之，低渗暴露肝细胞，水分快速进入细胞，导致稀释性低Na+，膜酶活性受抑制，阻止Na+/K+继续交换，使细胞内环境稳定得以维持。实验表明，肝细胞水化状态改变先于肝细胞膜Na+/K+-ATP酶活性的变化，而膜酶活性改变反过来促使肝细胞水化状态进一步变化。
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有研究认为，肝细胞水化状态是控制蛋白分解的重要因素，细胞肿胀时抑制蛋白分解并激活合成，而皱缩时则完全相反[1]。本研究结果显示在培养期内(120min),[3H]亮氨酸蛋白掺入活性以等渗组最高。与等渗组比较，低渗组轻度抑制(P>0.05)，而高渗组显著抑制(P<0.001)，与其他学者报道较为接近[8～10]。肝细胞水化状态导致膜Na+/K+-ATP酶活性与蛋白合成变化的关系尚未阐明。将膜酶活性与[3H]亮氨酸蛋白掺入量作相关分析发现，低渗时两者有显著负相关，而高渗时呈显著正相关(P<0.001)，说明高渗时膜Na+/K+-ATP酶激活，消耗细胞内能量，使细胞内蛋白合成受影响，反之低渗时膜酶活性抑制，可能对细胞内蛋白合成有利。进而推测Na+/K+-ATP酶活性增高为一耗能过程，可能与蛋白合成竞争利用能量。此外不排除Na+/K+-ATP膜活性改变通过其他机制，直接或间接地影响细胞内蛋白合成，也不排除因蛋白合成代谢改变反过来对膜酶活性的影响。
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为证明肝细胞水化状态改变与上述代谢变化的的本质，选择检测同期培养上清液中，反映肝细胞损伤的指标ALT、AST、LDH活性。发现在培养期内，酶活性最高数值始终在正常临界范围波动，这可能与肝细胞肿胀膜通透性增高，酶溢出有关，而非肝细胞病理损伤所致。同时说明不同渗透压培养肝细胞酶活性变化以及蛋白合成激活或抑制与细胞水化状态关联，属生理性改变。这与国外同类研究的结果相一致[1]。肝细胞水化状态作为代谢调节因子，对人体一系列生理代谢的影响尚有待更深入的研究。
参考文献
1 Hussinger D,Schliess F.Cell volume and hepatocellular function.J Hepatol 1995;22:94～100
2 Agius L,Peak M,Beresford G,et al.The role of ion content and cell volume in insulin action.Bichem Soc Trans 1994;22:516～522
, 百拇医药
3 Hussinger D,Roth E,Lang F,et al.Cellular hydration state:an important determinant of protein catabolism in health and disease.Lancet 1993;341:1330～1332
4 王宇明，陈国致，董家鸿，等.分离肝细胞的一种体外灌流法.中华消化杂志，1994；14(3)：175
5 赵利斌，薛 强，郝 飞，等.分离的鼠肝细胞不等渗培养条件下的容积测定.第三军医大学学报，1998；20(2)：180～182
6 孙志贤主编.现代生物化学理论与研究技术.北京：军事医学科学出版社，1995：300～301
7 Unverferth DV,Lee SW,Wallick ET.Human myocardial adenosine triphosphatase activities in health and heart failure.Am Heart J 1988;115:139～146
, 百拇医药
8 Hussinger D,Lang F,Gerok W.Regulation of cell function by the cellular hydration state.Am J physiol 1994;267:E343～355
9 Holen L,Gordon PB,Seglen PO.Inhibition of hepatocytic autophagy by okadaic acid and other protein phosphatase inhibitors.Eur J Biochem 1993;215:113～122
10 Stoll B,Gerok W,Land F,et al.Liver cell volume and protein synthesis.Biochem J 1992;287:217～222
收稿日期：1998-10-29, 百拇医药