凝血酶诱导人胚胎肾系膜细胞增殖和PAI-1表达的研究
作者：何庆南 易著文 陈香美 傅博
单位：何庆南(湖南医科大学第二附属医院儿科 长沙 410011)；易著文(湖南医科大学第二附属医院儿科 长沙 410011)；陈香美(解放军总医院肾科、解放军肾病中心暨重点实验室 北京 100853)；傅博(解放军总医院肾科、解放军肾病中心暨重点实验室 北京 100853)
关键词：凝血酶；纤维蛋白溶解酶原激活抑制剂1；肾小球膜；细胞；培养的；胚胎；人类
湖南医科大学学报000235 [摘要] 目的：探讨凝血酶对人胚胎肾系膜细胞增殖和纤溶 酶原激活物抑制物-1(PAI-1)表达的影响。方法：采用噻唑蓝(MTT)掺入法、Northern杂交 和纤维蛋白平板法分别检测不同浓度凝血酶刺激下人胚胎肾小球系膜细胞增殖、PAI-1 mRN A表达和PAI-1蛋白质活性的变化，并同时用人工水蛭素进行阻断实验。结果：凝血酶呈浓 度依赖性的方式促进人胚胎肾小球系膜细胞增殖、PAI-1 mRNA表达和PAI-1蛋白质活性， 水蛭素能特异地阻断凝血酶的作用。结论：凝血酶可通过促进系膜细胞增殖、PAI-1的表达 和提高其活性而导致肾脏损伤。
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[中图分类号] R364.3 R363.21 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0191-03
Effect of thrombin on cell proliferation and plasminogen activator inhibitor type(PAI-1) expression in human embryonic
glomerular mesangial cells
HE Qing-nan, YI Zhu-wen
(Department of Pediatrics, The Second Affiliated Hospital, Hunan M edical University Changsha 410011)
, 百拇医药
CHEN Xiang-mei, FU Bo
(Department of Nephrology, General Hospital of Chinese PLA Beijing 100 853)
[Abstract] Objective: To explore the effect of thrombin on ce ll proliferation and plasminogen-activator inhibitor Type 1(PAI-1) expression in human embryonic glomerular mesangial cells. Methods: Methyl-tetragolium(MTT) i ncorporation, fibrin plate assay and Northern blotting hybridization were used t o examine the mesangial cells proliferation, protein activity and mRNA expressio n of PAI-1 in cultured human embryonic mesangial cells induced by thrombin, res pectively. Results: Thrombin enhanced glomerular mesangial cell proliferation, P AI-1 protein activity and mRNA expression in a dose-dependent manner, which co uld be blocked by hirudin, a specific inhibitor of thrombin. Conclusion: Thrombi n could enhance mesangial cell proliferation, and up-regulate protein activity and mRNA expression of PAI-1 in cultured human embryonic glomerular mesangial c ells. It may play an important role in the pathogenesis of glomerulosclerosis in duced by thrombin.
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[Key words] thrombin; plasminogen-activator inhibitor 1; g lomerular mesangium; cell,cuttured; embryo; human
凝血-纤溶系统紊乱是导致肾小球炎症过程中出现 纤维蛋白渗出、微血栓形成和细胞外基质积聚的重要原因之一[1，2]。作为参与 肾小球内凝血过程的关键酶，凝血酶在肾脏疾病中的病理生理意义日渐受到人们的重视。目 前发现，凝血酶除了参与活化血小板和凝血外，还具备有丝分裂原生长因子样的作用，能刺 激肾脏固有细胞增殖和分泌多种生长因子及细胞因子[3]。纤溶酶原激活物抑制物 1( plasminogen activator inhibitor Type 1,PAI-1)是体内纤溶酶原激活物的特异性抑制因 子，不仅参与肾小球内血栓形成、纤维蛋白溶解等凝血与纤溶过程，而且在细胞粘附、迁移 和细胞外基质(ECM)降解等过程中也具有重要作用[4]。为了探讨凝血酶与系膜细 胞PAI-1表达和活性之间的关系，进一步阐明凝血酶导致肾小球损伤的作用机制，笔者观察 了凝血酶对人胚胎肾系膜细胞增殖和PAI-1表达的影响，以及水蛭素对凝血酶效应的阻止作用。
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1 材料与方法
1.1 材料 Ⅴ型胶原酶、α凝血酶、小牛血清白蛋白购自Sigma公司；RNA TrizolTM试剂购自Promega公司；RPMI 1640培养基、T4多核苷酸激酶购自Gibco BRL 公司；凝血酶受体拮抗剂水蛭素(hirudin)、PAI-1 cDNA质粒和PAI-1探针由解放军总医院 肾科提供。
1.2 细胞的分离、培养和鉴定[5] 肾脏取自人工流产5至6个月 的胚胎。剥离肾包膜后，用无菌剪刀分离肾皮质，剪碎并轻轻碾压，分别过225μm，106 μm和75μm三层不锈钢筛网，收集肾小球，加入400μg.ml-1Ⅴ型胶原酶3m l 37℃消化15min，离心后用含10%胎牛血清RMPI 1640培养。肾小球系膜细胞的鉴定分别 用抗结蛋白、抗细胞角蛋白、抗Ⅷ因子相关抗原的抗体进行间接免疫荧光染色。染色后在免 疫荧光显微镜下观察，如抗结蛋白阳性，胞浆中可清楚看到中间微丝结构，而抗细胞角蛋白 和抗Ⅷ因子相关抗原为阴性，即证明为肾小球系膜细胞。实验所用细胞为第三至第五代培养 的肾系膜细胞。
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1.3 肾小球系膜细胞增殖实验 将每孔为5×103个系膜细胞接种于96孔 细胞培养板，经含10%胎牛血清RPMI 1640培养48h后，用无血清RPMI 1640同步24h，然 后分别加入每毫升含0，0.25，0.5，1.0，2.0和4.0U不同浓度的凝血酶刺激细胞24h ，最后采用噻唑蓝(methyl-tetrazolium, MTT)掺入法检测细胞增殖情况。
1.4 PAI-1蛋白质活性的测定 采用改良的纤维蛋白平板法[6] 。细胞培养于24孔培养板中，每孔加入2×104个细胞，用含10%胎牛血清RPMI 1640培养48 h，无血清RPMI 1640同步24h后，加入每毫升含0，0.25，0.5，1.0，2.0和4.0U不 同浓度的凝血酶刺激12h，收集培养上清，与一定浓度的u-PA等量混合，25℃反应30mi n后，加入纤维蛋白平板37℃孵育14～16h，检测残留u-PA活性。以已知浓度的u-PA活性 减去残留u-PA活性来表示培养上清PAI-1活性；结果以U.ml-1表示。
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1.5 Northern杂交方法 用每毫升含0，0.5，1.0，2.0U不同浓度的凝 血酶刺激细胞12h，再用RNA TrizolTM提取总RNA，按常规进行变性电泳、转膜、预 杂交、杂交和放射自显影。PAI-1探针取自含人PAI-1全长cDNA质粒，为经EcoRI和BamH I 酶切后的1.13kb片段[7]。Northern blot结果应用图象分析系统进行扫描，同 时以28s作为参照，计算mRNA与28s的比值以校正总RNA上样量。结果代表3次独立的实验 。
1.6 统计学处理 数据用
±s表示，统计方法用标准t检验 。
2 结 果
2.1 凝血酶对系膜细胞增殖的影响 表1示，凝血酶能明显促进肾小球系膜 细胞增殖，并呈剂量依赖关系。
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表1 凝血酶对肾小球系膜细胞增殖的影响( n=8,±s) 组 别
OD570nm值
空白对照
0.163±0.008
0.25U.ml-1凝血酶
0.187±0.010①
0.5U.ml-1凝血酶
0.227±0.009②
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1.0U.ml-1凝血酶
0.232±0.013②
2.0U.ml-1凝血酶
0.296±0.016②
4.0U.ml-1凝血酶
0.297±0.032②
与空白对照组比较：①P<0.05;②P<0.01
2.2 凝血酶对人胚胎肾系膜细胞PAI-1蛋白质活性的影响 不同浓度的凝 血酶刺激系膜细胞12h后的结果显示：空白对照组系膜细胞仅有低水平PAI-1活性[(40± 2 0)U.ml-1]；由低至高不同浓度凝血酶组PAI-1活性分别为(273±60)，(420±73)，(480±47)，(520±47)和(467±67)U.ml-1，均明显高于空白对照组(P<0.01)， 并显示凝血酶升高PAI-1活性呈一定的浓度依赖关系(图1)。
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2.3 凝血酶对人胚胎肾系膜细胞PAI-1 mRNA表达的影响 肾小球系膜细胞 有一定基础水平的PAI-1 mRNA表达，不同浓度的凝血酶(每毫升含0.5，1.0，2.0U)刺激 系膜细胞12h后，PAI-1 mRNA表达明显增加，而凝血酶的特异性拮抗剂水蛭素能拮抗凝血 酶的上述作用(图2)。各组的PAI-1 mRNA与28s显影密度用图象分析系统进行扫描，两者 吸光度的比值结果见表2。各凝血酶组与空白对照组的结果差异显著(P<0.01)，并显示 凝血酶呈剂量依赖性促进PAI-1 mRNA表达。
图1 不同浓度凝血酶对PAI-1 蛋白质活性的影响 ①与空白对照组相比P<0.01(n=6)
Fig. 1 Effect of thrombin on mesangi al cells PAI-1 activity. ①vs control P<0.01. Mesangial cells (5×104 cells/well) incubated for 12 hrs in the different concentrations of thromb in conditions(n=6 in each group)
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图2 不同浓度凝血酶对PAI-1 mRNA表达的影响 1为空白对照组；2，3，4分别为每毫升0.5，1.0，2.0U浓度凝血酶刺激组；5为1.0 U.ml-1凝血酶加2.0U.ml-1水蛭素阻断组；6为2.0U.ml-1水 蛭素组
Fig. 2 Effect of thrombin of PAI-1 mRNA expression in human embryonic glomerular mesangial cells. Lane 1, control group ; lane 2,3,4, 0.5U.ml-1,1.0U.ml-1 and 2.0U.ml-1 throm bin, respectively; lane 5,1.0U.ml-1 thrombin plus 2U.ml-1 hiru din; lane 6,2U.ml-1 hirudin. Results represent three independent experi ments
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表2 不同浓度凝血酶对系膜细胞PAI-1 mRN A表达的影响(n=3,±s) 对照组
不同浓度凝血酶(U.ml-1)
1.0U.ml-1凝血酶加
2.0Uvml-1水蛭素
2.0U.ml-1
水蛭素
0.5
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1.0
2.0
1.66±0.32
2.20±0.68①
2.59±0. 51①
2.81±0.91①
2.10±0.77①
1.65±0.50②
表中数值均为密度扫描后各组的PAI-1 mRNA和28s的光密度值的比值 ①与对照组相比P<0.01；②与1.0U.ml-1凝血酶组相比P<0.01
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3 讨 论
肾小球硬化和肾间质纤维化是肾脏ECM合成与降解失衡导致ECM过度积聚的结果。既往对ECM 合成亢进机制的研究较多，并已发现许多因素如肾小球内高压、高糖、高胆固醇以及IL-1 ，2，6，TGF-β等细胞因子都能诱导肾小球系膜细胞增殖引起ECM合成和分泌增加。近几年 的研究焦点集中在ECM的降解机制上，其中由于在调节ECM降解这一复杂网络中纤溶酶原激活 物/纤溶酶系统占据中心位置而倍受重视；PAI-1则是该系统中引起广泛关注的调节纤维蛋 白溶解和ECM降解的重要物质，是ECM的主要降解物组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶 型纤溶酶原激活物(u-PA)的特异性抑制剂。大量体内外实验均显示，肾脏炎性损伤过程常 伴有PAI-1表达的增强，肾小球内ECM的积聚亦与PAI-1的过表达有关[8，9]， 说明PAI-1在导致肾脏损伤的机制中发挥重要作用。作为参与肾小球内凝血过程的关键酶， 凝血酶除了参与活化血小板和凝血外，还直接引起肾小球固有细胞的多种损伤[10] 。故笔者观察了凝血酶能否通过上调肾系膜细胞PAI-1的表达而进一步加重肾脏的损伤。
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本实验观察到，凝血酶呈浓度依赖关系促进人胚胎肾小球系膜细胞增殖，并同时从蛋白质和 基因水平证实了凝血酶具有促肾脏生长因子样的作用，能够上调系膜细胞PAI-1 mRNA的表 达和PAI-1蛋白质活性。此结果表明凝血酶可通过促进肾小球系膜细胞增殖和PAI-1表达， 从而干扰肾小球内ECM降解，最终导致ECM在肾脏组织中过度积聚，在肾脏疾病病理进展中起 着十分关键的作用。
笔者还同时观察了人工重组水蛭素对凝血酶上调系膜细胞PAI-1 mRNA表达的拮抗作用，结 果表明水蛭素能够显著下调凝血酶介导的肾小球系膜细胞PAI-1 mRNA的表达，也进一步证 实了凝血酶诱导人胚胎肾系膜细胞PAI-1表达增高作用的特异性。
综上所述，凝血酶除了参与活化血小板和凝血外[2]，还具备有丝分裂原生长因子 样的作用，促进肾小球系膜细胞增殖和PAI-1表达。故认为凝血酶能以多种致病机制引起肾 脏损伤。采用水蛭素等进行抗凝治疗，不仅可能防治凝血酶导致的肾小球内凝血和纤维蛋白 沉积，还可拮抗凝血酶介导的ECM合成与降解的失衡。
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参考文献：
[1] Takemura T, Voshiaka K, Akeno N. Glomerular deposition o f cross linked fibrin in human kidney disease[J]. Kidney Int, 1987,32:102-111.
[2] Ono T, Kanatsu K, Doi T, et al. Relationship of intraglomerular coagu lation and platelet aggregation to glomerular sclerosis[J]. Nephron, 1991,58:4 29-436.
[3] Shultz PJ, Knauss TC,Mene P, et al. Mitogenic signals in thrombin in mesangial cells: regulation of phospholipase C and PDGF genes[J]. Am J Physiol , 1989,257:F366-F374.
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[4] Loskutoff DJ. Regulation of PAI-1 gene expression[J]. Fibrinolysis, 19 91,5:197-206.
[5] 陈香美，傅博，叶一舟，等.凝血酶介导肾小球系膜细胞间粘附分子-1表达上调及 水蛭素的阻断作用[J].中华肾脏病杂志，1998，14：211-214.
[6] Jespersen J, Astrup T. A study of fibrin plate assay of fibrinolytic agen ts: optimal condition, reproducibility and precision[J]. Haemostasis, 1983,13: 301-305.
[7] 邓义斌，陈香美，廖洪军，等.人肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物cDNA克隆 和高效表达[J].中国科学C辑，1998，28(2)：179-185.
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[8] Gallicchio M, McFarlane J, Hufnagl P, et al. Stimulation of PAI-1 in rabbit anti-GBM glomerulonephritis[J]. Nephrology, 1998,4:65-74.
[9] Tomooka S, Border WA, Marshall BC, et al. Glomerular matrix accumula tion is linked to inhibition of plasmin protease system[J]. Kidney Int, 1992,4 2:1462-1467.
[10] Grandaliano G, Choudhury GG, Biswas P, et al. Mitogenic signali ng of thrombin in mesangial cells: role of phosphorylation[J]. Am J Physiol, 1 994,267:528-531., http://www.100md.com
单位：何庆南(湖南医科大学第二附属医院儿科 长沙 410011)；易著文(湖南医科大学第二附属医院儿科 长沙 410011)；陈香美(解放军总医院肾科、解放军肾病中心暨重点实验室 北京 100853)；傅博(解放军总医院肾科、解放军肾病中心暨重点实验室 北京 100853)
关键词：凝血酶；纤维蛋白溶解酶原激活抑制剂1；肾小球膜；细胞；培养的；胚胎；人类
湖南医科大学学报000235 [摘要] 目的：探讨凝血酶对人胚胎肾系膜细胞增殖和纤溶 酶原激活物抑制物-1(PAI-1)表达的影响。方法：采用噻唑蓝(MTT)掺入法、Northern杂交 和纤维蛋白平板法分别检测不同浓度凝血酶刺激下人胚胎肾小球系膜细胞增殖、PAI-1 mRN A表达和PAI-1蛋白质活性的变化，并同时用人工水蛭素进行阻断实验。结果：凝血酶呈浓 度依赖性的方式促进人胚胎肾小球系膜细胞增殖、PAI-1 mRNA表达和PAI-1蛋白质活性， 水蛭素能特异地阻断凝血酶的作用。结论：凝血酶可通过促进系膜细胞增殖、PAI-1的表达 和提高其活性而导致肾脏损伤。
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[中图分类号] R364.3 R363.21 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0191-03
Effect of thrombin on cell proliferation and plasminogen activator inhibitor type(PAI-1) expression in human embryonic
glomerular mesangial cells
HE Qing-nan, YI Zhu-wen
(Department of Pediatrics, The Second Affiliated Hospital, Hunan M edical University Changsha 410011)
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CHEN Xiang-mei, FU Bo
(Department of Nephrology, General Hospital of Chinese PLA Beijing 100 853)
[Abstract] Objective: To explore the effect of thrombin on ce ll proliferation and plasminogen-activator inhibitor Type 1(PAI-1) expression in human embryonic glomerular mesangial cells. Methods: Methyl-tetragolium(MTT) i ncorporation, fibrin plate assay and Northern blotting hybridization were used t o examine the mesangial cells proliferation, protein activity and mRNA expressio n of PAI-1 in cultured human embryonic mesangial cells induced by thrombin, res pectively. Results: Thrombin enhanced glomerular mesangial cell proliferation, P AI-1 protein activity and mRNA expression in a dose-dependent manner, which co uld be blocked by hirudin, a specific inhibitor of thrombin. Conclusion: Thrombi n could enhance mesangial cell proliferation, and up-regulate protein activity and mRNA expression of PAI-1 in cultured human embryonic glomerular mesangial c ells. It may play an important role in the pathogenesis of glomerulosclerosis in duced by thrombin.
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[Key words] thrombin; plasminogen-activator inhibitor 1; g lomerular mesangium; cell,cuttured; embryo; human
凝血-纤溶系统紊乱是导致肾小球炎症过程中出现 纤维蛋白渗出、微血栓形成和细胞外基质积聚的重要原因之一[1，2]。作为参与 肾小球内凝血过程的关键酶，凝血酶在肾脏疾病中的病理生理意义日渐受到人们的重视。目 前发现，凝血酶除了参与活化血小板和凝血外，还具备有丝分裂原生长因子样的作用，能刺 激肾脏固有细胞增殖和分泌多种生长因子及细胞因子[3]。纤溶酶原激活物抑制物 1( plasminogen activator inhibitor Type 1,PAI-1)是体内纤溶酶原激活物的特异性抑制因 子，不仅参与肾小球内血栓形成、纤维蛋白溶解等凝血与纤溶过程，而且在细胞粘附、迁移 和细胞外基质(ECM)降解等过程中也具有重要作用[4]。为了探讨凝血酶与系膜细 胞PAI-1表达和活性之间的关系，进一步阐明凝血酶导致肾小球损伤的作用机制，笔者观察 了凝血酶对人胚胎肾系膜细胞增殖和PAI-1表达的影响，以及水蛭素对凝血酶效应的阻止作用。
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1 材料与方法
1.1 材料 Ⅴ型胶原酶、α凝血酶、小牛血清白蛋白购自Sigma公司；RNA TrizolTM试剂购自Promega公司；RPMI 1640培养基、T4多核苷酸激酶购自Gibco BRL 公司；凝血酶受体拮抗剂水蛭素(hirudin)、PAI-1 cDNA质粒和PAI-1探针由解放军总医院 肾科提供。
1.2 细胞的分离、培养和鉴定[5] 肾脏取自人工流产5至6个月 的胚胎。剥离肾包膜后，用无菌剪刀分离肾皮质，剪碎并轻轻碾压，分别过225μm，106 μm和75μm三层不锈钢筛网，收集肾小球，加入400μg.ml-1Ⅴ型胶原酶3m l 37℃消化15min，离心后用含10%胎牛血清RMPI 1640培养。肾小球系膜细胞的鉴定分别 用抗结蛋白、抗细胞角蛋白、抗Ⅷ因子相关抗原的抗体进行间接免疫荧光染色。染色后在免 疫荧光显微镜下观察，如抗结蛋白阳性，胞浆中可清楚看到中间微丝结构，而抗细胞角蛋白 和抗Ⅷ因子相关抗原为阴性，即证明为肾小球系膜细胞。实验所用细胞为第三至第五代培养 的肾系膜细胞。
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1.3 肾小球系膜细胞增殖实验 将每孔为5×103个系膜细胞接种于96孔 细胞培养板，经含10%胎牛血清RPMI 1640培养48h后，用无血清RPMI 1640同步24h，然 后分别加入每毫升含0，0.25，0.5，1.0，2.0和4.0U不同浓度的凝血酶刺激细胞24h ，最后采用噻唑蓝(methyl-tetrazolium, MTT)掺入法检测细胞增殖情况。
1.4 PAI-1蛋白质活性的测定 采用改良的纤维蛋白平板法[6] 。细胞培养于24孔培养板中，每孔加入2×104个细胞，用含10%胎牛血清RPMI 1640培养48 h，无血清RPMI 1640同步24h后，加入每毫升含0，0.25，0.5，1.0，2.0和4.0U不 同浓度的凝血酶刺激12h，收集培养上清，与一定浓度的u-PA等量混合，25℃反应30mi n后，加入纤维蛋白平板37℃孵育14～16h，检测残留u-PA活性。以已知浓度的u-PA活性 减去残留u-PA活性来表示培养上清PAI-1活性；结果以U.ml-1表示。
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1.5 Northern杂交方法 用每毫升含0，0.5，1.0，2.0U不同浓度的凝 血酶刺激细胞12h，再用RNA TrizolTM提取总RNA，按常规进行变性电泳、转膜、预 杂交、杂交和放射自显影。PAI-1探针取自含人PAI-1全长cDNA质粒，为经EcoRI和BamH I 酶切后的1.13kb片段[7]。Northern blot结果应用图象分析系统进行扫描，同 时以28s作为参照，计算mRNA与28s的比值以校正总RNA上样量。结果代表3次独立的实验 。
1.6 统计学处理 数据用
±s表示，统计方法用标准t检验 。2 结 果
2.1 凝血酶对系膜细胞增殖的影响 表1示，凝血酶能明显促进肾小球系膜 细胞增殖，并呈剂量依赖关系。
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表1 凝血酶对肾小球系膜细胞增殖的影响( n=8,
±s) 组 别OD570nm值
空白对照
0.163±0.008
0.25U.ml-1凝血酶
0.187±0.010①
0.5U.ml-1凝血酶
0.227±0.009②
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1.0U.ml-1凝血酶
0.232±0.013②
2.0U.ml-1凝血酶
0.296±0.016②
4.0U.ml-1凝血酶
0.297±0.032②
与空白对照组比较：①P<0.05;②P<0.01
2.2 凝血酶对人胚胎肾系膜细胞PAI-1蛋白质活性的影响 不同浓度的凝 血酶刺激系膜细胞12h后的结果显示：空白对照组系膜细胞仅有低水平PAI-1活性[(40± 2 0)U.ml-1]；由低至高不同浓度凝血酶组PAI-1活性分别为(273±60)，(420±73)，(480±47)，(520±47)和(467±67)U.ml-1，均明显高于空白对照组(P<0.01)， 并显示凝血酶升高PAI-1活性呈一定的浓度依赖关系(图1)。
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2.3 凝血酶对人胚胎肾系膜细胞PAI-1 mRNA表达的影响 肾小球系膜细胞 有一定基础水平的PAI-1 mRNA表达，不同浓度的凝血酶(每毫升含0.5，1.0，2.0U)刺激 系膜细胞12h后，PAI-1 mRNA表达明显增加，而凝血酶的特异性拮抗剂水蛭素能拮抗凝血 酶的上述作用(图2)。各组的PAI-1 mRNA与28s显影密度用图象分析系统进行扫描，两者 吸光度的比值结果见表2。各凝血酶组与空白对照组的结果差异显著(P<0.01)，并显示 凝血酶呈剂量依赖性促进PAI-1 mRNA表达。
图1 不同浓度凝血酶对PAI-1 蛋白质活性的影响 ①与空白对照组相比P<0.01(n=6)
Fig. 1 Effect of thrombin on mesangi al cells PAI-1 activity. ①vs control P<0.01. Mesangial cells (5×104 cells/well) incubated for 12 hrs in the different concentrations of thromb in conditions(n=6 in each group)
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图2 不同浓度凝血酶对PAI-1 mRNA表达的影响 1为空白对照组；2，3，4分别为每毫升0.5，1.0，2.0U浓度凝血酶刺激组；5为1.0 U.ml-1凝血酶加2.0U.ml-1水蛭素阻断组；6为2.0U.ml-1水 蛭素组
Fig. 2 Effect of thrombin of PAI-1 mRNA expression in human embryonic glomerular mesangial cells. Lane 1, control group ; lane 2,3,4, 0.5U.ml-1,1.0U.ml-1 and 2.0U.ml-1 throm bin, respectively; lane 5,1.0U.ml-1 thrombin plus 2U.ml-1 hiru din; lane 6,2U.ml-1 hirudin. Results represent three independent experi ments
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表2 不同浓度凝血酶对系膜细胞PAI-1 mRN A表达的影响(n=3,
±s) 对照组不同浓度凝血酶(U.ml-1)
1.0U.ml-1凝血酶加
2.0Uvml-1水蛭素
2.0U.ml-1
水蛭素
0.5
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1.0
2.0
1.66±0.32
2.20±0.68①
2.59±0. 51①
2.81±0.91①
2.10±0.77①
1.65±0.50②
表中数值均为密度扫描后各组的PAI-1 mRNA和28s的光密度值的比值 ①与对照组相比P<0.01；②与1.0U.ml-1凝血酶组相比P<0.01
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3 讨 论
肾小球硬化和肾间质纤维化是肾脏ECM合成与降解失衡导致ECM过度积聚的结果。既往对ECM 合成亢进机制的研究较多，并已发现许多因素如肾小球内高压、高糖、高胆固醇以及IL-1 ，2，6，TGF-β等细胞因子都能诱导肾小球系膜细胞增殖引起ECM合成和分泌增加。近几年 的研究焦点集中在ECM的降解机制上，其中由于在调节ECM降解这一复杂网络中纤溶酶原激活 物/纤溶酶系统占据中心位置而倍受重视；PAI-1则是该系统中引起广泛关注的调节纤维蛋 白溶解和ECM降解的重要物质，是ECM的主要降解物组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶 型纤溶酶原激活物(u-PA)的特异性抑制剂。大量体内外实验均显示，肾脏炎性损伤过程常 伴有PAI-1表达的增强，肾小球内ECM的积聚亦与PAI-1的过表达有关[8，9]， 说明PAI-1在导致肾脏损伤的机制中发挥重要作用。作为参与肾小球内凝血过程的关键酶， 凝血酶除了参与活化血小板和凝血外，还直接引起肾小球固有细胞的多种损伤[10] 。故笔者观察了凝血酶能否通过上调肾系膜细胞PAI-1的表达而进一步加重肾脏的损伤。
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本实验观察到，凝血酶呈浓度依赖关系促进人胚胎肾小球系膜细胞增殖，并同时从蛋白质和 基因水平证实了凝血酶具有促肾脏生长因子样的作用，能够上调系膜细胞PAI-1 mRNA的表 达和PAI-1蛋白质活性。此结果表明凝血酶可通过促进肾小球系膜细胞增殖和PAI-1表达， 从而干扰肾小球内ECM降解，最终导致ECM在肾脏组织中过度积聚，在肾脏疾病病理进展中起 着十分关键的作用。
笔者还同时观察了人工重组水蛭素对凝血酶上调系膜细胞PAI-1 mRNA表达的拮抗作用，结 果表明水蛭素能够显著下调凝血酶介导的肾小球系膜细胞PAI-1 mRNA的表达，也进一步证 实了凝血酶诱导人胚胎肾系膜细胞PAI-1表达增高作用的特异性。
综上所述，凝血酶除了参与活化血小板和凝血外[2]，还具备有丝分裂原生长因子 样的作用，促进肾小球系膜细胞增殖和PAI-1表达。故认为凝血酶能以多种致病机制引起肾 脏损伤。采用水蛭素等进行抗凝治疗，不仅可能防治凝血酶导致的肾小球内凝血和纤维蛋白 沉积，还可拮抗凝血酶介导的ECM合成与降解的失衡。
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