高压氧与甲基强地松龙对不同系小鼠皮肤移植局部浸润T淋巴细胞及细胞粘附分子表达的影响
作者：于艳秋 王亚杰 高杰 张海鹏 陈学新 郝鸣政
单位：
于艳秋(中国医科大学基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001)；王亚杰(中国医科大学基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001)；张海鹏(中国医科大学基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001)
关键词：高压氧；甲基强地松龙；T淋巴细胞；粘附分子；皮肤移植
中国医科大学学报000207 摘要 目的：观察高压氧与甲基强地松龙对不同系小鼠皮肤移植局部浸润T淋巴细胞亚群及细胞粘附分子表达的影响。方法：C57BL/6小鼠接受BALB/C小鼠皮肤移植后，分别在99.2% O2、0.25 MPa高压氧舱内作用1.5 h/d，并每日腹腔注射0.17%甲基强地松龙0.3 ml,14 d后利用免疫荧光染色技术和图像分析仪测定CD3、CD4、CD8、CD11a、CD18阳性细胞荧光面积。结果：高压氧组、甲基强地松龙组、高压氧与甲基强地松龙联合组可使局部的组织破坏减轻，使CD3、CD4、CD8、CD11a、CD18阳性细胞荧光面积明显低于对照组。其中，高压氧组优于甲基强地松龙组，高压氧与甲基强地松龙联合组明显优于单纯应用高压氧组或甲基强地松龙组(P<0.01)。结论：高压氧与甲基强地松龙可减少移植局部T淋巴细胞及其亚群的浸润及粘附分子的表达，从而抑制了移植排斥反应，且两者联合应用具有协同作用。
, 百拇医药
The Effect of Hyperbaric Oxygen and Methylpred Disolonum on Local Lymphocyte Infiltration
and Expression of Adhesion Molecules in the Heterodermic Graft in Mice
Yu Yanqiu, Wang Yajie, Gao Jie, Zhang Haipeng, Chen Xuexin Hao Mingzheng
(Department of Pathophysiology,College of Basic Medical Sciences,China Medical University,Shenyang，110001)
ABSTRACT Objective:We observed the effect of hyperbaric oxygen(HBO) and methylpred disolonum(MD) in local lymphocyte infiltration and expression of adhesion molecules in the heterodermic graft in mice. Methods:Skin transplantation, donor mice BALB/C, receptor mice C57BL/6 HBO group were treated by 99.2% oxygen with 0.25 MPa for 1.5 hours every day. MD group were treated by MD 25 mg/kg*d-1 by abdomen injection. HBO+MD group were treated with both ways at the two groups. Control group were treated by 0.9% N S.After 14 days,T lymphocyte and CD11a、CD18 in local graft were detected with immunofluoresence techniques and image processing system. Results:All indexes of HBO group, MD group and HBO+MD group were lower than those of control group(P<0.01),the indexes of HBO+MD group are the lowest. Conclusion:HBO and MD have inhibition effect on local lymphocyte infiltration and the expression of adhesion molecules and hence to inhibit immune rejection.
, http://www.100md.com
KEY WORDS hyperbaric oxygen; methylpred disolonum; T lymphocyte; adhesion molecule; skin transplantation
在器官移植中如何抑制排斥反应是关键，常用的抗排斥反应的药物通常具有严重的毒副作用。因此，寻找新的抗排斥反应的药物和措施是目前急待解决的课题之一。我们已证明高压氧可抑制细胞免疫功能，使移植皮片存活时间延长约30%，且具有毒副作用小、抗感染、抗肿瘤、改善局部供氧等药物所不具备的优点[1]。为此，本实验应用高压氧(hyper-baric oxygen,HBO)、甲基强地松龙(methylpred disolonum,MD)及HBO与MD联合应用的方法，观察对移植局部组织T淋巴细胞亚群和粘附分子表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物处理及分组 供鼠BALB/C(H-2d)，受鼠C57BL/6(H-2b)，8～12周，体重20～22 g，本校实验动物部提供。无菌取BALB/C小鼠尾皮，移植于C57BL/6小鼠背部，加压包扎固定，不缝合。术后随机将小鼠分成对照组、HBO组、MD组、HBO+MD组。移植当日将HBO组与HBO+MD组送入实验用高压氧舱中，用99.2%氧气冲洗该舱三次，30 min内使舱内压力升至0.25 MPa，并保持该压力1.5 h，减压30 min后取出，每日1次[2]；MD组与HBO+MD组每日腹腔注射MD 25 mg/kg；对照组每日腹腔注射生理盐水。
, http://www.100md.com
1.2 移植物免疫组织化学染色及检测 移植后14 d取移植皮片，切片经HE染色，镜下观察组织及细胞浸润情况。取冰冻切片分别加FITC标记的抗小鼠CD3、CD4、CD8单克隆抗体，PE标记的抗小鼠细胞粘附分子CD11a、CD18单克隆抗体(Sigma公司)各8 μl，荧光显微镜下观察并照相，图像分析仪(LUZEX F型，日本)进行图像处理，计算每视野下荧光面积。
1.3 数据处理 所测数据均经SAS软件处理，采用t检验进行统计分析。
2 结果
2.1 移植皮片组织学观察 移植皮片14 d后，肉眼可见HBO组、HBO+MD组、MD组移植皮片生长良好，周边无翘起，对照组移植皮片周边有翘起。镜下观察，对照组浸润细胞明显增多，可见成片的浸润细胞团，组织破坏严重，HBO组、HBO+MD组、MD组浸润细胞少于对照组，组织破坏亦轻。
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2.2 移植局部粘附分子表达 各组移植局部浸润细胞CD3、CD4、CD8、CD11a、CD18阳性细胞浸润荧光面积明显低于对照组(P<0.01)，见表1。
表1 各组移植皮片CD3、CD4、CD8、CD11a、CD18阳性细胞浸润荧光面积比较
(×105 μm2，
±s)
Table 1 The comparison of fluorescence area of CD3，CD4，CD8，CD11a，CD18 cell in each skin transplant group
, http://www.100md.com
(×105 μm2，±s) 组 别
n
CD3
CD4
CD8
CD11a
CD18
对照组
, http://www.100md.com 8
2.89±0.47
1.52±0.31
1.02±0.12
1.54±0.09
1.13±0.11
MD组
8
1.97±0.26*
0.87±0.20*
0.61±0.21*
, 百拇医药 0.91±0.11*
0.68±0.18*
HBO组
8
1.31±0.13*＃
0.51±0.13*＃
0.42±0.17*＃
0.56±0.14*＃
0.14±0.13*＃
HBO+MD组
, 百拇医药
8
0.97±0.16*＃Δ
0.37±0.15*＃Δ
0.21±0.06*＃Δ
0.29±0.11*＃Δ
0.23±0.07*＃Δ
注：* 与对照组比较：P<0.01；＃ 与MD组比较：P<0.01；Δ 与HBO组比较：P<0.01
3 讨论
异体皮肤移植的排斥反应常见的临床类型主要以急性排斥反应出现，其发生机制以细胞免疫为主，早期局部出现大量单核细胞(主要是T淋巴细胞)浸润，也有一些中性粒细胞和浆细胞，杀伤并破坏移植物。其中CD8+ T细胞能直接杀伤移植物中的靶细胞，CD4+ T细胞能释放IL-2、TNF、TFN-γ等细胞因子促进局部的T细胞增殖、活化，也促使单核-巨噬细胞局部浸润，增强单核吞噬细胞的吞噬能力，引起超敏反应性炎症，从而使移植物受到排斥。随着细胞粘附分子的深入研究，认为：粘附分子参与细胞的增殖、活化，直至发挥功效的整个过程[3]。其中CD11a、CD18主要分布于淋巴细胞、单核细胞及巨噬细胞、骨髓细胞，可促使淋巴细胞与内皮细胞之间相互作用，由此，引起移植部位淋巴细胞浸润，也可以通过与靶细胞上相应配体ICAM-1结合，能有效地促进T淋巴细胞与靶细胞之间的紧密结合，改变靶细胞膜的通透性，发生不可逆性的细胞溶解反应[4]。本实验HBO与MD可明显降低CD8+、CD4+ T细胞的局部浸润及CD11a、CD18的表达，其中以HBO+MD组效果最好。这一结果与已报道的脾T淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD4CD11a、CD8CD11a、CD4CD18、CD8CD18阳性细胞百分率的结果一致[2]。MD是临床上抗免疫排斥反应的经典药物，在治疗中需长期应用，且可引起较大的副作用[5]。本实验中HBO不但减少移植局部浸润的淋巴细胞数目和CD11a、CD18的表达的效果优于MD，且HBO可改善移植局部的供血供氧状况，同时还看到HBO与MD联合应用有协同作用。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目，39570778
作者单位:高杰(基础医学院解剖学教研室)
陈学新(第一临床学院高压氧科)
郝鸣政(第一临床学院高压氧科)
参考文献
1，Zhang HP,Be S.The effect of hyperbaric oxygen on cellular immunity and the study of its mechanism.Pathophysiology(Amsterdam),1994,1:91-92
2，张海鹏，田伟，邓欣.高压氧对小鼠脾淋巴细胞Thy-1，IL-2R及IL-2反应性的影响.中国病理生理学杂志，1994，10(7，增刊)：760～762
, 百拇医药
3，龙振洲.医学免疫学.第二版，北京：人民卫生出版社，1995，132～137
4，Jackson AM，Alexandroff AB,Lappin MB,et al.Control of leucocyte function-associated antigen-1-dependent cellular conjugation by divalent cations. Immunology,1994,81:120-126
5，郑军华，闵志廉，贺宗理.糖皮质激素与激素抵抗性排异反应.肾脏病与透析肾移植杂志，1994，3(4)：333～335
(1999-03-12收稿), 百拇医药
单位：
于艳秋(中国医科大学基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001)；王亚杰(中国医科大学基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001)；张海鹏(中国医科大学基础医学院病理生理学教研室，沈阳 110001)
关键词：高压氧；甲基强地松龙；T淋巴细胞；粘附分子；皮肤移植
中国医科大学学报000207 摘要 目的：观察高压氧与甲基强地松龙对不同系小鼠皮肤移植局部浸润T淋巴细胞亚群及细胞粘附分子表达的影响。方法：C57BL/6小鼠接受BALB/C小鼠皮肤移植后，分别在99.2% O2、0.25 MPa高压氧舱内作用1.5 h/d，并每日腹腔注射0.17%甲基强地松龙0.3 ml,14 d后利用免疫荧光染色技术和图像分析仪测定CD3、CD4、CD8、CD11a、CD18阳性细胞荧光面积。结果：高压氧组、甲基强地松龙组、高压氧与甲基强地松龙联合组可使局部的组织破坏减轻，使CD3、CD4、CD8、CD11a、CD18阳性细胞荧光面积明显低于对照组。其中，高压氧组优于甲基强地松龙组，高压氧与甲基强地松龙联合组明显优于单纯应用高压氧组或甲基强地松龙组(P<0.01)。结论：高压氧与甲基强地松龙可减少移植局部T淋巴细胞及其亚群的浸润及粘附分子的表达，从而抑制了移植排斥反应，且两者联合应用具有协同作用。
, 百拇医药
The Effect of Hyperbaric Oxygen and Methylpred Disolonum on Local Lymphocyte Infiltration
and Expression of Adhesion Molecules in the Heterodermic Graft in Mice
Yu Yanqiu, Wang Yajie, Gao Jie, Zhang Haipeng, Chen Xuexin Hao Mingzheng
(Department of Pathophysiology,College of Basic Medical Sciences,China Medical University,Shenyang，110001)
ABSTRACT Objective:We observed the effect of hyperbaric oxygen(HBO) and methylpred disolonum(MD) in local lymphocyte infiltration and expression of adhesion molecules in the heterodermic graft in mice. Methods:Skin transplantation, donor mice BALB/C, receptor mice C57BL/6 HBO group were treated by 99.2% oxygen with 0.25 MPa for 1.5 hours every day. MD group were treated by MD 25 mg/kg*d-1 by abdomen injection. HBO+MD group were treated with both ways at the two groups. Control group were treated by 0.9% N S.After 14 days,T lymphocyte and CD11a、CD18 in local graft were detected with immunofluoresence techniques and image processing system. Results:All indexes of HBO group, MD group and HBO+MD group were lower than those of control group(P<0.01),the indexes of HBO+MD group are the lowest. Conclusion:HBO and MD have inhibition effect on local lymphocyte infiltration and the expression of adhesion molecules and hence to inhibit immune rejection.
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KEY WORDS hyperbaric oxygen; methylpred disolonum; T lymphocyte; adhesion molecule; skin transplantation
在器官移植中如何抑制排斥反应是关键，常用的抗排斥反应的药物通常具有严重的毒副作用。因此，寻找新的抗排斥反应的药物和措施是目前急待解决的课题之一。我们已证明高压氧可抑制细胞免疫功能，使移植皮片存活时间延长约30%，且具有毒副作用小、抗感染、抗肿瘤、改善局部供氧等药物所不具备的优点[1]。为此，本实验应用高压氧(hyper-baric oxygen,HBO)、甲基强地松龙(methylpred disolonum,MD)及HBO与MD联合应用的方法，观察对移植局部组织T淋巴细胞亚群和粘附分子表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物处理及分组 供鼠BALB/C(H-2d)，受鼠C57BL/6(H-2b)，8～12周，体重20～22 g，本校实验动物部提供。无菌取BALB/C小鼠尾皮，移植于C57BL/6小鼠背部，加压包扎固定，不缝合。术后随机将小鼠分成对照组、HBO组、MD组、HBO+MD组。移植当日将HBO组与HBO+MD组送入实验用高压氧舱中，用99.2%氧气冲洗该舱三次，30 min内使舱内压力升至0.25 MPa，并保持该压力1.5 h，减压30 min后取出，每日1次[2]；MD组与HBO+MD组每日腹腔注射MD 25 mg/kg；对照组每日腹腔注射生理盐水。
, http://www.100md.com
1.2 移植物免疫组织化学染色及检测 移植后14 d取移植皮片，切片经HE染色，镜下观察组织及细胞浸润情况。取冰冻切片分别加FITC标记的抗小鼠CD3、CD4、CD8单克隆抗体，PE标记的抗小鼠细胞粘附分子CD11a、CD18单克隆抗体(Sigma公司)各8 μl，荧光显微镜下观察并照相，图像分析仪(LUZEX F型，日本)进行图像处理，计算每视野下荧光面积。
1.3 数据处理 所测数据均经SAS软件处理，采用t检验进行统计分析。
2 结果
2.1 移植皮片组织学观察 移植皮片14 d后，肉眼可见HBO组、HBO+MD组、MD组移植皮片生长良好，周边无翘起，对照组移植皮片周边有翘起。镜下观察，对照组浸润细胞明显增多，可见成片的浸润细胞团，组织破坏严重，HBO组、HBO+MD组、MD组浸润细胞少于对照组，组织破坏亦轻。
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2.2 移植局部粘附分子表达 各组移植局部浸润细胞CD3、CD4、CD8、CD11a、CD18阳性细胞浸润荧光面积明显低于对照组(P<0.01)，见表1。
表1 各组移植皮片CD3、CD4、CD8、CD11a、CD18阳性细胞浸润荧光面积比较
(×105 μm2，
±s)Table 1 The comparison of fluorescence area of CD3，CD4，CD8，CD11a，CD18 cell in each skin transplant group
, http://www.100md.com
(×105 μm2，
±s) 组 别n
CD3
CD4
CD8
CD11a
CD18
对照组
, http://www.100md.com 8
2.89±0.47
1.52±0.31
1.02±0.12
1.54±0.09
1.13±0.11
MD组
8
1.97±0.26*
0.87±0.20*
0.61±0.21*
, 百拇医药 0.91±0.11*
0.68±0.18*
HBO组
8
1.31±0.13*＃
0.51±0.13*＃
0.42±0.17*＃
0.56±0.14*＃
0.14±0.13*＃
HBO+MD组
, 百拇医药
8
0.97±0.16*＃Δ
0.37±0.15*＃Δ
0.21±0.06*＃Δ
0.29±0.11*＃Δ
0.23±0.07*＃Δ
注：* 与对照组比较：P<0.01；＃ 与MD组比较：P<0.01；Δ 与HBO组比较：P<0.01
3 讨论
异体皮肤移植的排斥反应常见的临床类型主要以急性排斥反应出现，其发生机制以细胞免疫为主，早期局部出现大量单核细胞(主要是T淋巴细胞)浸润，也有一些中性粒细胞和浆细胞，杀伤并破坏移植物。其中CD8+ T细胞能直接杀伤移植物中的靶细胞，CD4+ T细胞能释放IL-2、TNF、TFN-γ等细胞因子促进局部的T细胞增殖、活化，也促使单核-巨噬细胞局部浸润，增强单核吞噬细胞的吞噬能力，引起超敏反应性炎症，从而使移植物受到排斥。随着细胞粘附分子的深入研究，认为：粘附分子参与细胞的增殖、活化，直至发挥功效的整个过程[3]。其中CD11a、CD18主要分布于淋巴细胞、单核细胞及巨噬细胞、骨髓细胞，可促使淋巴细胞与内皮细胞之间相互作用，由此，引起移植部位淋巴细胞浸润，也可以通过与靶细胞上相应配体ICAM-1结合，能有效地促进T淋巴细胞与靶细胞之间的紧密结合，改变靶细胞膜的通透性，发生不可逆性的细胞溶解反应[4]。本实验HBO与MD可明显降低CD8+、CD4+ T细胞的局部浸润及CD11a、CD18的表达，其中以HBO+MD组效果最好。这一结果与已报道的脾T淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD4CD11a、CD8CD11a、CD4CD18、CD8CD18阳性细胞百分率的结果一致[2]。MD是临床上抗免疫排斥反应的经典药物，在治疗中需长期应用，且可引起较大的副作用[5]。本实验中HBO不但减少移植局部浸润的淋巴细胞数目和CD11a、CD18的表达的效果优于MD，且HBO可改善移植局部的供血供氧状况，同时还看到HBO与MD联合应用有协同作用。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目，39570778
作者单位:高杰(基础医学院解剖学教研室)
陈学新(第一临床学院高压氧科)
郝鸣政(第一临床学院高压氧科)
参考文献
1，Zhang HP,Be S.The effect of hyperbaric oxygen on cellular immunity and the study of its mechanism.Pathophysiology(Amsterdam),1994,1:91-92
2，张海鹏，田伟，邓欣.高压氧对小鼠脾淋巴细胞Thy-1，IL-2R及IL-2反应性的影响.中国病理生理学杂志，1994，10(7，增刊)：760～762
, 百拇医药
3，龙振洲.医学免疫学.第二版，北京：人民卫生出版社，1995，132～137
4，Jackson AM，Alexandroff AB,Lappin MB,et al.Control of leucocyte function-associated antigen-1-dependent cellular conjugation by divalent cations. Immunology,1994,81:120-126
5，郑军华，闵志廉，贺宗理.糖皮质激素与激素抵抗性排异反应.肾脏病与透析肾移植杂志，1994，3(4)：333～335
(1999-03-12收稿), 百拇医药