肺泡巨噬细胞CD11b/CD18及其配体CD54的表达与肺泡炎症的相关性
作者：佟振月 马跃文 侯显明
单位：佟振月(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)；马跃文(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)；侯显明(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)
关键词：肺纤维化；白细胞粘附分子；巨噬细胞；肺泡
中国医科大学学报000201 摘要 目的：通过博莱霉素致大鼠肺纤维化过程中肺泡巨噬细胞表面白细胞粘附分子CD11b,CD18及相应配体CD54表达的动态观察,研究白细胞粘附分子对肺泡炎的触发作用。方法：采用流式细胞仪和免疫组化方法。结果：肺泡巨噬细胞CD11b,CD18的表达在博莱霉素灌注后1 d即开始增高,7～14 d天达高峰,与对照组差异显著(P<0.001),随后略下降,但仍处于高水平表达。而CD54在3 d后表达明显升高,以后呈持续性高水平表达。且7 d时CD11b,CD54的表达与BALF中的肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophage,AM)的数量呈正相关，γ值分别为0.995,0.885。两周后BALF中的肺泡巨噬细胞数量恢复正常,而其表面CD11b,CD18,CD54的表达仍然增强。结论：博莱霉素致大鼠肺纤维化发生机制中CD11b,CD18,CD54表达增强,其在触发肺泡炎症及介导肺纤维化过程中起一定的作用。
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Correlation of the Expression of CD11/CD18 Intercellular Adhesion Molecule and
its Ligand CD54 with Alveolar Inflammation
Tong Zhenyue, Ma Yuewen, Hou Xianming
(Resipiratory Disease Institute, China Medical University, Shenyang，110001)
ABSTRACT Objective:To investigate the tiggering role of CD11/CD18 leukocyte surface adhesion molecule and its ligand CD54 to alveolar inflammation during the course of pulmonary fibrosis induced by Bleomycin on alveolar macrophages (AM) and evaluating the relationship between the expression of CD11b / CD18 and recruitment of alveolar macrophage(AM) in the BALF.Methods:We use immunofluorescence flow cytometry and immunohistochemistry method to determine the expression of CD11b,CD18,CD54 on AM.Results:(1)The expression of CD11/CD18 increased on the first day,peaked on 7-14 th days(P<0.001) and subsequently decreased lightly, but remained at high level compared with those of the control.(2)The imcreased expression of CD54 began on the 3rd day(P<0.01) and maintained at high level.(3)The expression of the CD11b,CD54 was greatly correlated with the number of the AM on 7th days(r=0.995,r=0.885).(4)The expression of CD11b, CD18, CD54 was still very high after 2 weeks,but the number of the AM in BALF had declined to normal level.Conclusion:The increased expression of CD11b,CD18,CD54 on AM in Bleomycin-induced pulmonary fibrosis may play an important role in tiggering alveolar inflammation and in inducing lung interstitial fibrosis.
, 百拇医药
KEY WORDS pulmonary fibrosis; leukocyte adhesion molecule; macrophages,alveolar
肺间质纤维化在发病早期由中性粒细胞,单核细胞和肺泡巨噬细胞活化、释放众多趋化因子(Chemokines)和致炎性细胞因子、致纤维化因子使炎性细胞向炎症的肺区募集、积聚,进而强化、放大炎症反应[1，2]，白细胞粘附分子-β2整合素参与炎症细胞的肺内迁移及活化。β2整合素[3](CD11/CD18)是由α、β亚单位组成的介导细胞间粘附的异构二聚体,是一种细胞表面糖蛋白受体。分别为CD11a/CD18, CD11b/CD18,CD11c/CD18。CD54(免疫球蛋白超家族成员)为其配体之一。其表达增加除参与炎性细胞间的粘附、聚集,尚可激活炎性细胞。
白细胞粘附分子CD11/CD18及配体CD54在肺纤维化机制中的作用目前虽不十分清楚,但通过介导细胞间的粘附及信息传递才能激发细胞活化,释放炎症介质介导肺泡炎及纤维化过程。作者采用BLM大鼠肺纤维化模型,观察不同时期CD11b,CD18,CD54在肺泡巨噬细胞表面的表达,以及与炎性细胞聚集的相关性,探讨白细胞粘附分子在触发肺泡炎及纤维化形成中的作用。
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1 材料与方法
1.1 动物模型的复制及分组
1.1.1 用硫苯妥钠(2 mg/100 g BW)腹腔注射麻醉大鼠,颈部酒精消毒后暴露气管,将抽取含BLMA-5(天津河北制药厂)0.5 mg/100 g BW或生理盐水(0.2～0.3 ml)的1 ml注射器经气管软骨环间隙向心端刺入气管,将大鼠直立后将药液注入气管,旋转动物,使其均匀分布。
1.1.2 分组处理:体重为150～250 g wistar大鼠(中国医大实验动物部) 50只,实验环境驯养1周,随机分两组。1)博莱霉素(BLM)组(25只),气管内注入含BLM盐水 0.2～0.3 ml。2)对照组(25只),气管内注入生理盐水0.2～0.3 ml。两组动物分别于气管内灌注后1、3、 7、14、28 d随机处死5只。
1.2 AM分离,纯化
, 百拇医药
1.2.1 硫苯妥钠麻醉后,开胸,心肺暴露,结扎左主支气管,右肺用37℃无菌生理盐水行支气管肺泡灌洗(BAL 5 ml,10 min),回收液集中于无菌离心管中。离心(500 g,10 min),收集细胞,计数,细胞悬液玻片孵育纯化2 h,PBS冲洗,丙酮4℃固定10 min。-70℃保存备用。
1.2.2 部分细胞悬液用克氏瓶纯化,台盼蓝染色,细胞活性>90%,细胞用于流式细胞仪分析检测。
1.3 试剂来源
一抗见表1。
二抗为生物素标记的马抗小鼠IgG血清(美国Vecter公司),免疫组化ABC试剂盒购自美国Vecter公司。FITC标记羊抗小鼠IgG(美国Jackson进口分装)。
表1 单克隆抗体种类
, 百拇医药
Table 1 Kinds of monoclonal antibodies 单抗名称
抗体类型
特异性
工作浓度
来源
抗CD11b(OX-2)
IgG
单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、NK、B淋巴细胞
1∶100
Serotec公司(英国)
抗CD18(WT.3)
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IgG
单核细胞、粒细胞、淋巴细胞
1∶500
同上
抗CD54(1A29)
IgG
白细胞、上皮细胞、内皮细胞
1∶50
同上
1.4 肺泡巨噬细胞CD11b,CD18,CD54的表达
1.4.1 流式细胞仪检测：纯化AM用PBS(0.05 mol/L,pH 7.4)调整细胞数为0.5×106的细胞悬液(细胞活性>90%),分别加入CD11b,CD18,CD54单抗(工作浓度分别为1∶100,1∶100,1∶50) 5 μl,10 μl,5 μl/ml,0℃反应30 min;PBS洗涤2×5 min;加入FITC标记羊抗鼠二抗(1∶100)10 μl/ml,0℃反应30 min;PBS洗涤3×5 min后行流式细胞仪检测;计数20 000个细胞,以其平均荧光强度为参数分析AM表面抗原表达的变化。以PBS代替一抗为阴性对照。
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1.4.2 免疫组织化学法检测：将贴有细胞的玻片取出,室温干燥,PBS(pH 7.4)冲洗5 min,ABC法免疫组化染色。
结果判定:以胞膜呈棕褐色连续状或灶性颗粒性状分布为阳性。以PBS代替一抗为阴性对照。
1.5 统计分析 用计量资料t检验及相关分析。
2 结果
2.1 BALF中肺泡巨噬细胞总数的动态变化
肺泡巨噬细胞总数于3 d开始升高,7 d达高峰,14 d后逐渐恢复至正常水平。
2.2 肺泡巨噬细胞CD11b,CD18,CD54的表达
2.2.1 流式细胞仪检测结果：CD11b在AM上的表达于BLM灌注72 h明显增高,7～14 d为高峰期,与对照组比较有明显差异(P<0.001)。此后下降,但仍高于对照组(P<0.004)。CD18于3 d升高,但与盐水组比较无差异(P>0.05),7 d达高峰,2周和4周下降,保持高水平表达。CD54于72 h开始升高,明显高于对照组(P<0.05),此后呈进行性高水平表达。见表2。
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表2 BLM组大鼠AM表达CD11b、CD18、CD54的平均荧光强度的
动态变化(灰阶) (
±s)
Table 2 Consecutive change of average immunofluorescence of the CD11b,CD18,CD54 expression on AMs in BLM-induced fibrosis 组别
CD11b
CD18
CD54
NS
38.30±4.65
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39.01±2.89
15.46±3.58
BLM1
47.75±4.71
41.34±11.8
29.35±18.9
BLM3
60.54±12.7
47.94±14.6
42.36±17.1*
BLM7
, http://www.100md.com
93.82±43.75**
87.13±8.06**
69.86±8.47**
BLM14
113.20±16.7**
80.22±22.6**
58.01±9.34**
BLM24
67.48±1.82*
, 百拇医药
55.43±33.6
80.68±17.7**
**P<0.01 *P<0.05(与对照组相比,compared with control)
图1 BLM组AM CD11b阳性着色细胞 ×200
Figure 1 CD11b positive cells on AMs in BLM-induced rats
图2 BLM组AM CD18阳性着色细胞 ×200
Figure 2 CD18 positive cells on AMs in BLM-induced fibrosis
, 百拇医药
图3 BLM组AM CD54阳性着色细胞 ×120
Figure 3 CD54 positive cells on AMs in BLM-induced fibrosis
2.2.2 免疫组化结果：CD11b,CD18,CD54在肺泡巨噬细胞膜表面呈棕褐色连续或灶性颗粒状分布(见图1～3)。参考文献[3]进行统计学分析,光镜(×40)下计数500个细胞中阳性细胞的百分数进行定量分析。CD18在肺泡巨噬细胞的表达较稳定,而CD54,CD11b则较对照组表达增高,3 d即明显升高(P<0.05),1,2,4周均呈持续性表达,与流式细胞仪结果基本一致。
2.2.3 相关分析：通过流式细胞仪结果,我们分析了CD11b,CD18,CD54的阳性表达与3～7 d BALF中AM的数量的关系发现,CD11b、CD54表达增高与AM的数量呈正相关(r=0.9995,P<0.05;r=0.986,P<0.02)。
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3 讨论
本研究应用气管内灌注博莱霉素的方法复制大鼠肺纤维化模型,观察到1～7 d肺泡腔及间隔内中性粒细胞、肺泡巨噬细胞为主的炎性细胞渗出逐渐增多(肺泡炎阶段);14 d后可见肺泡间隔增厚,成纤维细胞增殖;28 d形成稳定的纤维化改变。研究证明,BLM灌注后72 h,CD11/CD18表达增高,7～14 d为高峰值,其阳性表达与肺泡炎期肺泡巨噬细胞总数呈明显正相关。提示CD11/CD18的表达增高可能参与肺泡巨噬细胞的聚集、活化,与早期肺泡炎的发生相关。
炎性细胞的粘附是肺损伤发生的重要环节。β2整合素(CD11/CD18)与配体CD54的结合途径是介导炎性细胞的粘附、聚集于炎症部位的关键,也是免疫炎性细胞包括肺泡巨噬细胞间相互作用的关键。而单核巨噬细胞的聚集能引起PDGF mRNA表达增强,机体内细胞外基质粘附增加,可能促进纤维化的发生和进展[4]。在ARDS的研究中发现,粒细胞高粘附状态与CD11/CD18表达的上调有关,高粘附的粒细胞导致肺微血管损伤,也表明CD11/CD18介导了急性肺损伤的过程[5]。
, 百拇医药
有学者研究[3],在结节病和IPF患者中AM表达CD11/CD18增高,并发现CD11/CD18的过高表达除与AM渗出和聚集有关,还可导致AM呼吸爆发,释放超氧阴离子,损伤肺上皮。CD11b/CD18的表达增加尚能参与各种炎性细胞的活化及信号传导。另外,抗CD18单抗不仅可抑制炎性细胞的聚集,在体外能抑制免疫复合物介导的肺损伤中肺泡巨噬细胞释放超氧自由基及TNF-α,从而能防止吞噬细胞相关的氧自由基依赖性肺损伤[6];抗CD54单抗能通过阻滞白细胞由血管内迁移至肺间质及肺泡腔,可能阻止白细胞与Ⅰ型上皮之间相互作用,有效的改善肺损伤。
Barquin[7]在高氧所致肺纤维化模型中观察到动物暴露于75% O2 48 h肺泡巨噬细胞即有CD11b,CD54高表达,且在第2周和第10周进行性表达增加,提示肺泡巨噬细胞CD11b、CD11c、CD54的表达与肺泡炎及纤维化进程密切相关。本研究也发现,BLM组大鼠2周后CD11b,CD18保持高水平表达,CD54呈持续性增加,而BALF中细胞渗出基本恢复正常,说明其高水平表达在此后纤维化形成及保持中发挥重要作用。
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动物实验发现,抗CD11a及抗CD11b单抗可减轻肺泡炎的形成,抑制肺组织的胶原沉积;抗CD11a能有效地减少小鼠过敏性肺炎中羟脯氨酸的水平,明显减轻肺实质的炎症及损伤[8，9];但BALF中炎性细胞数并未减少。因此推测抗CD11a、抗CD11b减少肺纤维化的形成,能否与细胞活化及释放致纤维化因子的能力下降有关,有待进一步研究。综上所述,肺纤维化过程中CD11b、CD18、CD54持续性高水平表达,在触发肺泡炎和间质纤维化进程中发挥一定的作用。因而有选择地抑制及调节CAMS功能,可望在阻止炎性细胞浸润及炎性反应,逆转肺纤维化过程等方面发挥作用。
国家自然科学基金资助项目，39570332
参考文献
1，Keane MP,Standiford TJ,Strieter RM.Chemokines are important cytokines in the pathogenesis of interstitial lung diseases.Eur Respir J, 1997,10:1199～1202
, 百拇医药
2，陈佰义,姜莉,赵洪文等. 肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞释放TNF-α和PDGF的研究.中华结核和呼吸杂志, 1996,19(4):209～211
3，Schaberg T,Rau M,Stephan H, et al. Increased number of alveolar macrophases expressing surface molecules of the CD11/CD18 family in sarcoidosis and IPF is related to the production of superoxide anions by these cells. Am Rev Respir Dis, 1993,147:1507-1513
4，Shaw RJ. Adhesion dependent increase in human monocyte PDGF(B) mRNA is associated with increases in c-fos,c-jun,EGR2 mRNA.J Cell Biol, 1990,111:2139-2148
, 百拇医药
5，Laurent T, Markert M,Fliedner VV,et al.CD11b/CD18 expression,adhesion,and chemotaxis of granulocyte in adult source. Am J Respir Crit Care Med, 1994,149(6):1534-1538
6，Barton RW,Rothlein R, Ksiazek J, et al.The effect of anti ICAM-1 on phorbol-ester induced rabbit lung inflammation. J Immunol, 1989,143:1278-1282
7，Barquin N,Chou P,Ramos C,et al.Increased expression of intercellular adhesion molecule 1,CD11/CD18 cell surface adhesion glycoproteins and alpha 4 beta 1 integrin in a rat model of chronic intersttial lung fibrosis. Pathobiology,1996,64(4):187-192
, http://www.100md.com
8，Piguet PF,Rosen H,Vesin C,et al. Effective treatment of the pulmonary fibrosis elicited in mice by bleomycin or cilica with antibodies.Am Rev Respir Dis, 1993,147:435-441
9，Denis M, Bisson D. Blockade of leucocyte function-associated antigen(LFA-1) in a murine model of lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol,1994,10(5):481-486
(1999-01-11收稿), 百拇医药
单位：佟振月(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)；马跃文(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)；侯显明(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)
关键词：肺纤维化；白细胞粘附分子；巨噬细胞；肺泡
中国医科大学学报000201 摘要 目的：通过博莱霉素致大鼠肺纤维化过程中肺泡巨噬细胞表面白细胞粘附分子CD11b,CD18及相应配体CD54表达的动态观察,研究白细胞粘附分子对肺泡炎的触发作用。方法：采用流式细胞仪和免疫组化方法。结果：肺泡巨噬细胞CD11b,CD18的表达在博莱霉素灌注后1 d即开始增高,7～14 d天达高峰,与对照组差异显著(P<0.001),随后略下降,但仍处于高水平表达。而CD54在3 d后表达明显升高,以后呈持续性高水平表达。且7 d时CD11b,CD54的表达与BALF中的肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophage,AM)的数量呈正相关，γ值分别为0.995,0.885。两周后BALF中的肺泡巨噬细胞数量恢复正常,而其表面CD11b,CD18,CD54的表达仍然增强。结论：博莱霉素致大鼠肺纤维化发生机制中CD11b,CD18,CD54表达增强,其在触发肺泡炎症及介导肺纤维化过程中起一定的作用。
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Correlation of the Expression of CD11/CD18 Intercellular Adhesion Molecule and
its Ligand CD54 with Alveolar Inflammation
Tong Zhenyue, Ma Yuewen, Hou Xianming
(Resipiratory Disease Institute, China Medical University, Shenyang，110001)
ABSTRACT Objective:To investigate the tiggering role of CD11/CD18 leukocyte surface adhesion molecule and its ligand CD54 to alveolar inflammation during the course of pulmonary fibrosis induced by Bleomycin on alveolar macrophages (AM) and evaluating the relationship between the expression of CD11b / CD18 and recruitment of alveolar macrophage(AM) in the BALF.Methods:We use immunofluorescence flow cytometry and immunohistochemistry method to determine the expression of CD11b,CD18,CD54 on AM.Results:(1)The expression of CD11/CD18 increased on the first day,peaked on 7-14 th days(P<0.001) and subsequently decreased lightly, but remained at high level compared with those of the control.(2)The imcreased expression of CD54 began on the 3rd day(P<0.01) and maintained at high level.(3)The expression of the CD11b,CD54 was greatly correlated with the number of the AM on 7th days(r=0.995,r=0.885).(4)The expression of CD11b, CD18, CD54 was still very high after 2 weeks,but the number of the AM in BALF had declined to normal level.Conclusion:The increased expression of CD11b,CD18,CD54 on AM in Bleomycin-induced pulmonary fibrosis may play an important role in tiggering alveolar inflammation and in inducing lung interstitial fibrosis.
, 百拇医药
KEY WORDS pulmonary fibrosis; leukocyte adhesion molecule; macrophages,alveolar
肺间质纤维化在发病早期由中性粒细胞,单核细胞和肺泡巨噬细胞活化、释放众多趋化因子(Chemokines)和致炎性细胞因子、致纤维化因子使炎性细胞向炎症的肺区募集、积聚,进而强化、放大炎症反应[1，2]，白细胞粘附分子-β2整合素参与炎症细胞的肺内迁移及活化。β2整合素[3](CD11/CD18)是由α、β亚单位组成的介导细胞间粘附的异构二聚体,是一种细胞表面糖蛋白受体。分别为CD11a/CD18, CD11b/CD18,CD11c/CD18。CD54(免疫球蛋白超家族成员)为其配体之一。其表达增加除参与炎性细胞间的粘附、聚集,尚可激活炎性细胞。
白细胞粘附分子CD11/CD18及配体CD54在肺纤维化机制中的作用目前虽不十分清楚,但通过介导细胞间的粘附及信息传递才能激发细胞活化,释放炎症介质介导肺泡炎及纤维化过程。作者采用BLM大鼠肺纤维化模型,观察不同时期CD11b,CD18,CD54在肺泡巨噬细胞表面的表达,以及与炎性细胞聚集的相关性,探讨白细胞粘附分子在触发肺泡炎及纤维化形成中的作用。
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1 材料与方法
1.1 动物模型的复制及分组
1.1.1 用硫苯妥钠(2 mg/100 g BW)腹腔注射麻醉大鼠,颈部酒精消毒后暴露气管,将抽取含BLMA-5(天津河北制药厂)0.5 mg/100 g BW或生理盐水(0.2～0.3 ml)的1 ml注射器经气管软骨环间隙向心端刺入气管,将大鼠直立后将药液注入气管,旋转动物,使其均匀分布。
1.1.2 分组处理:体重为150～250 g wistar大鼠(中国医大实验动物部) 50只,实验环境驯养1周,随机分两组。1)博莱霉素(BLM)组(25只),气管内注入含BLM盐水 0.2～0.3 ml。2)对照组(25只),气管内注入生理盐水0.2～0.3 ml。两组动物分别于气管内灌注后1、3、 7、14、28 d随机处死5只。
1.2 AM分离,纯化
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1.2.1 硫苯妥钠麻醉后,开胸,心肺暴露,结扎左主支气管,右肺用37℃无菌生理盐水行支气管肺泡灌洗(BAL 5 ml,10 min),回收液集中于无菌离心管中。离心(500 g,10 min),收集细胞,计数,细胞悬液玻片孵育纯化2 h,PBS冲洗,丙酮4℃固定10 min。-70℃保存备用。
1.2.2 部分细胞悬液用克氏瓶纯化,台盼蓝染色,细胞活性>90%,细胞用于流式细胞仪分析检测。
1.3 试剂来源
一抗见表1。
二抗为生物素标记的马抗小鼠IgG血清(美国Vecter公司),免疫组化ABC试剂盒购自美国Vecter公司。FITC标记羊抗小鼠IgG(美国Jackson进口分装)。
表1 单克隆抗体种类
, 百拇医药
Table 1 Kinds of monoclonal antibodies 单抗名称
抗体类型
特异性
工作浓度
来源
抗CD11b(OX-2)
IgG
单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、NK、B淋巴细胞
1∶100
Serotec公司(英国)
抗CD18(WT.3)
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IgG
单核细胞、粒细胞、淋巴细胞
1∶500
同上
抗CD54(1A29)
IgG
白细胞、上皮细胞、内皮细胞
1∶50
同上
1.4 肺泡巨噬细胞CD11b,CD18,CD54的表达
1.4.1 流式细胞仪检测：纯化AM用PBS(0.05 mol/L,pH 7.4)调整细胞数为0.5×106的细胞悬液(细胞活性>90%),分别加入CD11b,CD18,CD54单抗(工作浓度分别为1∶100,1∶100,1∶50) 5 μl,10 μl,5 μl/ml,0℃反应30 min;PBS洗涤2×5 min;加入FITC标记羊抗鼠二抗(1∶100)10 μl/ml,0℃反应30 min;PBS洗涤3×5 min后行流式细胞仪检测;计数20 000个细胞,以其平均荧光强度为参数分析AM表面抗原表达的变化。以PBS代替一抗为阴性对照。
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1.4.2 免疫组织化学法检测：将贴有细胞的玻片取出,室温干燥,PBS(pH 7.4)冲洗5 min,ABC法免疫组化染色。
结果判定:以胞膜呈棕褐色连续状或灶性颗粒性状分布为阳性。以PBS代替一抗为阴性对照。
1.5 统计分析 用计量资料t检验及相关分析。
2 结果
2.1 BALF中肺泡巨噬细胞总数的动态变化
肺泡巨噬细胞总数于3 d开始升高,7 d达高峰,14 d后逐渐恢复至正常水平。
2.2 肺泡巨噬细胞CD11b,CD18,CD54的表达
2.2.1 流式细胞仪检测结果：CD11b在AM上的表达于BLM灌注72 h明显增高,7～14 d为高峰期,与对照组比较有明显差异(P<0.001)。此后下降,但仍高于对照组(P<0.004)。CD18于3 d升高,但与盐水组比较无差异(P>0.05),7 d达高峰,2周和4周下降,保持高水平表达。CD54于72 h开始升高,明显高于对照组(P<0.05),此后呈进行性高水平表达。见表2。
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表2 BLM组大鼠AM表达CD11b、CD18、CD54的平均荧光强度的
动态变化(灰阶) (
±s)Table 2 Consecutive change of average immunofluorescence of the CD11b,CD18,CD54 expression on AMs in BLM-induced fibrosis 组别
CD11b
CD18
CD54
NS
38.30±4.65
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39.01±2.89
15.46±3.58
BLM1
47.75±4.71
41.34±11.8
29.35±18.9
BLM3
60.54±12.7
47.94±14.6
42.36±17.1*
BLM7
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93.82±43.75**
87.13±8.06**
69.86±8.47**
BLM14
113.20±16.7**
80.22±22.6**
58.01±9.34**
BLM24
67.48±1.82*
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55.43±33.6
80.68±17.7**
**P<0.01 *P<0.05(与对照组相比,compared with control)
图1 BLM组AM CD11b阳性着色细胞 ×200
Figure 1 CD11b positive cells on AMs in BLM-induced rats
图2 BLM组AM CD18阳性着色细胞 ×200
Figure 2 CD18 positive cells on AMs in BLM-induced fibrosis
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图3 BLM组AM CD54阳性着色细胞 ×120
Figure 3 CD54 positive cells on AMs in BLM-induced fibrosis
2.2.2 免疫组化结果：CD11b,CD18,CD54在肺泡巨噬细胞膜表面呈棕褐色连续或灶性颗粒状分布(见图1～3)。参考文献[3]进行统计学分析,光镜(×40)下计数500个细胞中阳性细胞的百分数进行定量分析。CD18在肺泡巨噬细胞的表达较稳定,而CD54,CD11b则较对照组表达增高,3 d即明显升高(P<0.05),1,2,4周均呈持续性表达,与流式细胞仪结果基本一致。
2.2.3 相关分析：通过流式细胞仪结果,我们分析了CD11b,CD18,CD54的阳性表达与3～7 d BALF中AM的数量的关系发现,CD11b、CD54表达增高与AM的数量呈正相关(r=0.9995,P<0.05;r=0.986,P<0.02)。
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3 讨论
本研究应用气管内灌注博莱霉素的方法复制大鼠肺纤维化模型,观察到1～7 d肺泡腔及间隔内中性粒细胞、肺泡巨噬细胞为主的炎性细胞渗出逐渐增多(肺泡炎阶段);14 d后可见肺泡间隔增厚,成纤维细胞增殖;28 d形成稳定的纤维化改变。研究证明,BLM灌注后72 h,CD11/CD18表达增高,7～14 d为高峰值,其阳性表达与肺泡炎期肺泡巨噬细胞总数呈明显正相关。提示CD11/CD18的表达增高可能参与肺泡巨噬细胞的聚集、活化,与早期肺泡炎的发生相关。
炎性细胞的粘附是肺损伤发生的重要环节。β2整合素(CD11/CD18)与配体CD54的结合途径是介导炎性细胞的粘附、聚集于炎症部位的关键,也是免疫炎性细胞包括肺泡巨噬细胞间相互作用的关键。而单核巨噬细胞的聚集能引起PDGF mRNA表达增强,机体内细胞外基质粘附增加,可能促进纤维化的发生和进展[4]。在ARDS的研究中发现,粒细胞高粘附状态与CD11/CD18表达的上调有关,高粘附的粒细胞导致肺微血管损伤,也表明CD11/CD18介导了急性肺损伤的过程[5]。
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有学者研究[3],在结节病和IPF患者中AM表达CD11/CD18增高,并发现CD11/CD18的过高表达除与AM渗出和聚集有关,还可导致AM呼吸爆发,释放超氧阴离子,损伤肺上皮。CD11b/CD18的表达增加尚能参与各种炎性细胞的活化及信号传导。另外,抗CD18单抗不仅可抑制炎性细胞的聚集,在体外能抑制免疫复合物介导的肺损伤中肺泡巨噬细胞释放超氧自由基及TNF-α,从而能防止吞噬细胞相关的氧自由基依赖性肺损伤[6];抗CD54单抗能通过阻滞白细胞由血管内迁移至肺间质及肺泡腔,可能阻止白细胞与Ⅰ型上皮之间相互作用,有效的改善肺损伤。
Barquin[7]在高氧所致肺纤维化模型中观察到动物暴露于75% O2 48 h肺泡巨噬细胞即有CD11b,CD54高表达,且在第2周和第10周进行性表达增加,提示肺泡巨噬细胞CD11b、CD11c、CD54的表达与肺泡炎及纤维化进程密切相关。本研究也发现,BLM组大鼠2周后CD11b,CD18保持高水平表达,CD54呈持续性增加,而BALF中细胞渗出基本恢复正常,说明其高水平表达在此后纤维化形成及保持中发挥重要作用。
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动物实验发现,抗CD11a及抗CD11b单抗可减轻肺泡炎的形成,抑制肺组织的胶原沉积;抗CD11a能有效地减少小鼠过敏性肺炎中羟脯氨酸的水平,明显减轻肺实质的炎症及损伤[8，9];但BALF中炎性细胞数并未减少。因此推测抗CD11a、抗CD11b减少肺纤维化的形成,能否与细胞活化及释放致纤维化因子的能力下降有关,有待进一步研究。综上所述,肺纤维化过程中CD11b、CD18、CD54持续性高水平表达,在触发肺泡炎和间质纤维化进程中发挥一定的作用。因而有选择地抑制及调节CAMS功能,可望在阻止炎性细胞浸润及炎性反应,逆转肺纤维化过程等方面发挥作用。
国家自然科学基金资助项目，39570332
参考文献
1，Keane MP,Standiford TJ,Strieter RM.Chemokines are important cytokines in the pathogenesis of interstitial lung diseases.Eur Respir J, 1997,10:1199～1202
, 百拇医药
2，陈佰义,姜莉,赵洪文等. 肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞释放TNF-α和PDGF的研究.中华结核和呼吸杂志, 1996,19(4):209～211
3，Schaberg T,Rau M,Stephan H, et al. Increased number of alveolar macrophases expressing surface molecules of the CD11/CD18 family in sarcoidosis and IPF is related to the production of superoxide anions by these cells. Am Rev Respir Dis, 1993,147:1507-1513
4，Shaw RJ. Adhesion dependent increase in human monocyte PDGF(B) mRNA is associated with increases in c-fos,c-jun,EGR2 mRNA.J Cell Biol, 1990,111:2139-2148
, 百拇医药
5，Laurent T, Markert M,Fliedner VV,et al.CD11b/CD18 expression,adhesion,and chemotaxis of granulocyte in adult source. Am J Respir Crit Care Med, 1994,149(6):1534-1538
6，Barton RW,Rothlein R, Ksiazek J, et al.The effect of anti ICAM-1 on phorbol-ester induced rabbit lung inflammation. J Immunol, 1989,143:1278-1282
7，Barquin N,Chou P,Ramos C,et al.Increased expression of intercellular adhesion molecule 1,CD11/CD18 cell surface adhesion glycoproteins and alpha 4 beta 1 integrin in a rat model of chronic intersttial lung fibrosis. Pathobiology,1996,64(4):187-192
, http://www.100md.com
8，Piguet PF,Rosen H,Vesin C,et al. Effective treatment of the pulmonary fibrosis elicited in mice by bleomycin or cilica with antibodies.Am Rev Respir Dis, 1993,147:435-441
9，Denis M, Bisson D. Blockade of leucocyte function-associated antigen(LFA-1) in a murine model of lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol,1994,10(5):481-486
(1999-01-11收稿), 百拇医药