大鼠脑损伤后脑组织腺苷A1受体的放射自显影研究
作者：童武松 卢亦成 江基尧 朱诚 徐尔理
单位：卢亦成(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；江基尧(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；朱诚(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；童武松(解放军第411医院神经外科，上海 200081)；徐尔理(解放军第411医院神经内科)
关键词：脑损伤；受体；腺苷A1
第二军医大学学报000233 分类号：R 651.15 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(2000)02-0194-02▲
腺苷是中枢神经系统中一种重要的内源性保护因子。通过腺苷A1受体介导，可抑制多种兴奋性神经递质释放及神经元的激活，对缺血性脑损伤和颅脑外伤有明显的保护作用[1，2]。本研究采用放射自显影方法，观察大鼠液压脑损伤后大脑皮质、海马、小脑等部位腺苷A1受体密度的变化，探讨腺苷A1受体在脑外伤中的作用机制，为腺苷及其类似物治疗颅脑损伤提供实验依据。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂与器材 3H-环已基腺苷(3H-CHA)：0.74 TBq/mmol，腺苷A1受体配体；腺苷脱氨酶(ADA)；环已基腺苷(CHA)，均为Sigma公司产品。氚片，Kodak公司。大鼠液压脑损伤模型装置。恒冷箱切片机。T90计算机图像分析系统，上海医科大学产品。
1.2 实验动物分组及致伤 雄性SD大鼠24只，随机分为对照组(6只)和实验组(18只)，大鼠经2%戊巴比妥钠(54 mg/kg)腹腔注射麻醉后，动物头部固定于立体定向仪上，于中线切开头皮，剥离骨膜，在前囟和人字缝尖连线中点偏左4 mm处颅骨钻孔，骨窗直径为定型的4.8 mm，暴露硬脑膜。在前囟和人字缝尖附近颅骨外板上固定2枚小螺丝钉，牙托水泥固定打击管后，头皮缝合，次日动物致伤，液压伤打击强度为(152.0±20.3) kPa，致大鼠中度脑损伤。实验组分别于伤后3，6，24 h断头处死(每组各6只)，对照组除不致伤外，余步骤与实验组相同。
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1.3 脑组织切片的制备 大鼠按分组时间开颅取脑，立即在-20℃恒冷箱切片机中存放0.5 h，制成20 μm的冠状切片，融贴在涂有明胶层的载玻片上，-80℃保存待测。
1.4 受体结合 将脑切片用冷风吹干，加含有标记药物3H-CHA和腺苷脱氨酶的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)50～100 μl作特异结合，加含有标记药物3H-CHA、腺苷脱氨酶和CHA的50 mmol/L Tris-HCl作非特异结合。24～26℃孵育90 min，然后在冰冷50 mmol/L Tris-HCl缓冲液内洗涤3次，再用蒸馏水洗去切片上的缓冲液，冷风快速吹干后进行自体放射显影术。
1.5 自显影片的制备 暗室内将孵育的脑切片上覆盖一张氚片，用玻片固定夹紧，两端用橡皮筋绕固，双层黑纸包好，放入干燥剂的黑袋内封口，置入4℃冰箱曝光14周后，暗室中显影(kodak, D-196, 18℃, 3 min)，定影(F-5酸性膜定影液，8 min)，水洗1 h，空气中吹干后得到显示脑切片受体分布的自显影像。
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1.6 测定指标 用T90光导摄像计算机分析系统对自显影像进行受体密度测量，通过计算机测定不同脑区的光密度代表受体密度，非竞争片与竞争片同一结构上密度之差为特异性结合。
1.7 统计学处理 数据以
±s表示，组间采用F检验。
2 结 果
2.1 放射自显影显示大脑皮质、 海马、 小脑分子层3H- CHA结合密度 对照组较高(图1A，B)。 液压脑损伤组大脑皮质、海马、小脑分子层3H-CHA结合密度均下降 (图1C， D， E， F， G， H)。光密度测定结果表明伤侧(左侧)大脑皮质、海马损伤后3 h 3H-CHA的结合密度均显著下降(P<0.01，与对照组比较)，伤后6 h3H-CHA的结合密度下降到最低值(大脑皮质密度减少了78.7%，海马减少了75.2%)，伤后24 h大脑皮质、海马3H-CHA的结合密度开始恢复，但仍明显低于对照组(P<0.01,表1)
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图1 大鼠脑切片放射自显影图像
示3H-CHA结合密度
A，B：对照组；C，D，E，F；G，H：分别是伤后3，6，24 h组。
2.2 脑损伤后右侧大脑皮质、海马3H-CHA结合变化 与左侧相同(表1)。但3H-CHA的结合密度伤后减少量小于左侧(大脑皮质、海马伤后6 h分别减少59.0%和61.8%)。
表1 大鼠脑损伤后大脑皮质、海马3H-CHA的结合密度变化
(n=6,±s) 组别
皮质
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海马
左侧
右侧
左侧
右侧
对照组
462.8±42.2
466.1±28.9
519.2±20.8
526.5±21.2
损伤后
3 h
224.5±23.0**
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321.3±27.1**
278.0±27.2**
307.1±31.8**
6 h
98.4±16.6**
191.0±33.8**
128.6±19.5**
200.9±30.0**
24 h
373.0±32.2**
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413.8±26.9*
421.9±35.2**
447.4±38.5**
*P<0.05,**P<0.01与对照组比较2.3 小脑3H- CHA结合密度的变化 伤前为627.6±28.9，在伤后3 h开始显著下降，伤后6 h降到最低谷为275.3±35.2(减少56.1%)，24 h开始恢复。
3 讨 论
许多实验证实，腺苷A1受体的激活能在突触前抑制兴奋性氨基酸和乙酰胆碱等毒性神经递质释放、抑制神经元Ca2+过度内流[1]；介导NGF mRNA合成和NGF蛋白释放[3]；改善脑细胞代谢，阻止脑损伤后ATP的过度减少，使神经细胞超极化，降低突触后膜神经元兴奋性[4]。采用选择性腺苷A1受体激动剂CHA、CPA、R-PIA、2-氯腺苷等治疗脑缺血、缺氧及脑外伤动物有显著的神经保护作用，而应用腺苷A1受体拮抗剂SPT、8-PT能加重脑损伤动物的神经功能障碍和神经细胞病理损害[2]，说明腺苷A1受体是一种内源性神经保护因子。
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本研究显示大鼠脑内腺苷A1受体密度以皮质、海马、小脑分子层较高，其他部位较低。有学者[5]报道了大鼠腺苷合成酶5′-核苷酸酶的特异性神经元组织化学定位，5′-核苷酸酶在小脑、海马、皮质、胼胝体、齿状回等部位活性最高，与腺苷A1受体的特异性分布有许多相似之处，提示腺苷A1受体邻近腺苷形成部位，有利于发挥腺苷A1受体的最大效应。
本研究发现，大鼠液压脑损伤后3 h，小脑、皮质、海马内腺苷A1受体密度开始下降，伤后6 h降到最低峰，24 h开始恢复，但仍显著低于对照组水平。也有报道动物脑缺血损伤后脑组织腺苷A1受体的密度也下降[6]，这提示了动物创伤性脑损伤和缺血性脑损伤存在某些相似的机制。值得重视的是，兴奋性氨基酸NMDA受体在脑组织的分布与腺苷A1受体分布完全一致[7]，动物脑损伤后兴奋性氨基酸大量释放和NMDA受体的过度激活会加重继发性脑损伤，这可能与脑损伤后腺苷A1受体内源性保护机制受到损害有一定联系。Daval等[6]研究发现动物脑缺血后海马CA1区锥体细胞损害与腺苷A1受体密度减少有关，缺血后早期给予CHA，能显著逆转腺苷A1受体减少，同时对海马细胞有明显的保护作用。以上结果表明脑外伤后早期增加内源性腺苷含量或外源性给予腺苷类似物可能保护并激活腺苷A1受体，从而提供神经保护作用。研究安全有效且能保护并激活A1受体的特异性腺苷类似物，为临床治疗颅脑伤患者提供了一个新思路。
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作者简介：童武松(1967～)，男(汉族)，博士，主治医师
参考文献：
[1]Sweeney MI. Neuroprotective effects of adenosine in cerebral ischemia:Window of opportunity[J]. Neuroscinece Biobehavioral Rev,1997, 21(2):207-217.
[2]Phillis JW. The effects of selective A1 and A2a adenosine receptor antagonists on cerebral ischemic injury in the gerbil[J]. Brain Res, 1995, 705(s1-2): 79-84.
, 百拇医药
[3]Heese K, Fiebich BL, Bauer J， et al. Nerve growth factor(NGF) expression in rat microglia is induced by adenosine A2a-receptors. Neurosci Lett, 1997, 231(4): 83-86.
[4]童武松，梁玉敏. 腺甘及其受体与脑损伤[J]. 国外医学*生理、病理科学与临床分册，1998，18(1)：56-57.
[5]Goodman RR, Snyder SH. Autoradiographic localization of adenosine receptors in rat brain using 3H-cyclohexyladenosine. J Neurosci, 1982, 2(9): 1230-1235.
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[6]Daval JL, von Lubitz DK, Deckert J， et al. Protective effect of cyclohexyladenosine on adenosine A1-receptors, guanine nucleotide and forskolin binding sites following transient brain ischemia: a quantitative autoradioradiographic study[J]. Brain Res, 1989, 491(1): 212-226.
[7]Olney JW, Labruyere J, Wang G， et al. NMDA antagonist neurotoxicity mechanism and prevention. Science, 1991, 254(3):1515-1518.
收稿日期：1999-07-14
修稿日期：1999-11-29, http://www.100md.com
单位：卢亦成(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；江基尧(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；朱诚(第二军医大学长征医院神经外科，上海 200003)；童武松(解放军第411医院神经外科，上海 200081)；徐尔理(解放军第411医院神经内科)
关键词：脑损伤；受体；腺苷A1
第二军医大学学报000233 分类号：R 651.15 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(2000)02-0194-02▲
腺苷是中枢神经系统中一种重要的内源性保护因子。通过腺苷A1受体介导，可抑制多种兴奋性神经递质释放及神经元的激活，对缺血性脑损伤和颅脑外伤有明显的保护作用[1，2]。本研究采用放射自显影方法，观察大鼠液压脑损伤后大脑皮质、海马、小脑等部位腺苷A1受体密度的变化，探讨腺苷A1受体在脑外伤中的作用机制，为腺苷及其类似物治疗颅脑损伤提供实验依据。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂与器材 3H-环已基腺苷(3H-CHA)：0.74 TBq/mmol，腺苷A1受体配体；腺苷脱氨酶(ADA)；环已基腺苷(CHA)，均为Sigma公司产品。氚片，Kodak公司。大鼠液压脑损伤模型装置。恒冷箱切片机。T90计算机图像分析系统，上海医科大学产品。
1.2 实验动物分组及致伤 雄性SD大鼠24只，随机分为对照组(6只)和实验组(18只)，大鼠经2%戊巴比妥钠(54 mg/kg)腹腔注射麻醉后，动物头部固定于立体定向仪上，于中线切开头皮，剥离骨膜，在前囟和人字缝尖连线中点偏左4 mm处颅骨钻孔，骨窗直径为定型的4.8 mm，暴露硬脑膜。在前囟和人字缝尖附近颅骨外板上固定2枚小螺丝钉，牙托水泥固定打击管后，头皮缝合，次日动物致伤，液压伤打击强度为(152.0±20.3) kPa，致大鼠中度脑损伤。实验组分别于伤后3，6，24 h断头处死(每组各6只)，对照组除不致伤外，余步骤与实验组相同。
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1.3 脑组织切片的制备 大鼠按分组时间开颅取脑，立即在-20℃恒冷箱切片机中存放0.5 h，制成20 μm的冠状切片，融贴在涂有明胶层的载玻片上，-80℃保存待测。
1.4 受体结合 将脑切片用冷风吹干，加含有标记药物3H-CHA和腺苷脱氨酶的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)50～100 μl作特异结合，加含有标记药物3H-CHA、腺苷脱氨酶和CHA的50 mmol/L Tris-HCl作非特异结合。24～26℃孵育90 min，然后在冰冷50 mmol/L Tris-HCl缓冲液内洗涤3次，再用蒸馏水洗去切片上的缓冲液，冷风快速吹干后进行自体放射显影术。
1.5 自显影片的制备 暗室内将孵育的脑切片上覆盖一张氚片，用玻片固定夹紧，两端用橡皮筋绕固，双层黑纸包好，放入干燥剂的黑袋内封口，置入4℃冰箱曝光14周后，暗室中显影(kodak, D-196, 18℃, 3 min)，定影(F-5酸性膜定影液，8 min)，水洗1 h，空气中吹干后得到显示脑切片受体分布的自显影像。
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1.6 测定指标 用T90光导摄像计算机分析系统对自显影像进行受体密度测量，通过计算机测定不同脑区的光密度代表受体密度，非竞争片与竞争片同一结构上密度之差为特异性结合。
1.7 统计学处理 数据以
±s表示，组间采用F检验。2 结 果
2.1 放射自显影显示大脑皮质、 海马、 小脑分子层3H- CHA结合密度 对照组较高(图1A，B)。 液压脑损伤组大脑皮质、海马、小脑分子层3H-CHA结合密度均下降 (图1C， D， E， F， G， H)。光密度测定结果表明伤侧(左侧)大脑皮质、海马损伤后3 h 3H-CHA的结合密度均显著下降(P<0.01，与对照组比较)，伤后6 h3H-CHA的结合密度下降到最低值(大脑皮质密度减少了78.7%，海马减少了75.2%)，伤后24 h大脑皮质、海马3H-CHA的结合密度开始恢复，但仍明显低于对照组(P<0.01,表1)
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图1 大鼠脑切片放射自显影图像
示3H-CHA结合密度
A，B：对照组；C，D，E，F；G，H：分别是伤后3，6，24 h组。
2.2 脑损伤后右侧大脑皮质、海马3H-CHA结合变化 与左侧相同(表1)。但3H-CHA的结合密度伤后减少量小于左侧(大脑皮质、海马伤后6 h分别减少59.0%和61.8%)。
表1 大鼠脑损伤后大脑皮质、海马3H-CHA的结合密度变化
(n=6,
±s) 组别皮质
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海马
左侧
右侧
左侧
右侧
对照组
462.8±42.2
466.1±28.9
519.2±20.8
526.5±21.2
损伤后
3 h
224.5±23.0**
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321.3±27.1**
278.0±27.2**
307.1±31.8**
6 h
98.4±16.6**
191.0±33.8**
128.6±19.5**
200.9±30.0**
24 h
373.0±32.2**
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413.8±26.9*
421.9±35.2**
447.4±38.5**
*P<0.05,**P<0.01与对照组比较2.3 小脑3H- CHA结合密度的变化 伤前为627.6±28.9，在伤后3 h开始显著下降，伤后6 h降到最低谷为275.3±35.2(减少56.1%)，24 h开始恢复。
3 讨 论
许多实验证实，腺苷A1受体的激活能在突触前抑制兴奋性氨基酸和乙酰胆碱等毒性神经递质释放、抑制神经元Ca2+过度内流[1]；介导NGF mRNA合成和NGF蛋白释放[3]；改善脑细胞代谢，阻止脑损伤后ATP的过度减少，使神经细胞超极化，降低突触后膜神经元兴奋性[4]。采用选择性腺苷A1受体激动剂CHA、CPA、R-PIA、2-氯腺苷等治疗脑缺血、缺氧及脑外伤动物有显著的神经保护作用，而应用腺苷A1受体拮抗剂SPT、8-PT能加重脑损伤动物的神经功能障碍和神经细胞病理损害[2]，说明腺苷A1受体是一种内源性神经保护因子。
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本研究显示大鼠脑内腺苷A1受体密度以皮质、海马、小脑分子层较高，其他部位较低。有学者[5]报道了大鼠腺苷合成酶5′-核苷酸酶的特异性神经元组织化学定位，5′-核苷酸酶在小脑、海马、皮质、胼胝体、齿状回等部位活性最高，与腺苷A1受体的特异性分布有许多相似之处，提示腺苷A1受体邻近腺苷形成部位，有利于发挥腺苷A1受体的最大效应。
本研究发现，大鼠液压脑损伤后3 h，小脑、皮质、海马内腺苷A1受体密度开始下降，伤后6 h降到最低峰，24 h开始恢复，但仍显著低于对照组水平。也有报道动物脑缺血损伤后脑组织腺苷A1受体的密度也下降[6]，这提示了动物创伤性脑损伤和缺血性脑损伤存在某些相似的机制。值得重视的是，兴奋性氨基酸NMDA受体在脑组织的分布与腺苷A1受体分布完全一致[7]，动物脑损伤后兴奋性氨基酸大量释放和NMDA受体的过度激活会加重继发性脑损伤，这可能与脑损伤后腺苷A1受体内源性保护机制受到损害有一定联系。Daval等[6]研究发现动物脑缺血后海马CA1区锥体细胞损害与腺苷A1受体密度减少有关，缺血后早期给予CHA，能显著逆转腺苷A1受体减少，同时对海马细胞有明显的保护作用。以上结果表明脑外伤后早期增加内源性腺苷含量或外源性给予腺苷类似物可能保护并激活腺苷A1受体，从而提供神经保护作用。研究安全有效且能保护并激活A1受体的特异性腺苷类似物，为临床治疗颅脑伤患者提供了一个新思路。
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作者简介：童武松(1967～)，男(汉族)，博士，主治医师
参考文献：
[1]Sweeney MI. Neuroprotective effects of adenosine in cerebral ischemia:Window of opportunity[J]. Neuroscinece Biobehavioral Rev,1997, 21(2):207-217.
[2]Phillis JW. The effects of selective A1 and A2a adenosine receptor antagonists on cerebral ischemic injury in the gerbil[J]. Brain Res, 1995, 705(s1-2): 79-84.
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[3]Heese K, Fiebich BL, Bauer J， et al. Nerve growth factor(NGF) expression in rat microglia is induced by adenosine A2a-receptors. Neurosci Lett, 1997, 231(4): 83-86.
[4]童武松，梁玉敏. 腺甘及其受体与脑损伤[J]. 国外医学*生理、病理科学与临床分册，1998，18(1)：56-57.
[5]Goodman RR, Snyder SH. Autoradiographic localization of adenosine receptors in rat brain using 3H-cyclohexyladenosine. J Neurosci, 1982, 2(9): 1230-1235.
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[6]Daval JL, von Lubitz DK, Deckert J， et al. Protective effect of cyclohexyladenosine on adenosine A1-receptors, guanine nucleotide and forskolin binding sites following transient brain ischemia: a quantitative autoradioradiographic study[J]. Brain Res, 1989, 491(1): 212-226.
[7]Olney JW, Labruyere J, Wang G， et al. NMDA antagonist neurotoxicity mechanism and prevention. Science, 1991, 254(3):1515-1518.
收稿日期：1999-07-14
修稿日期：1999-11-29, http://www.100md.com