腺病毒介导的脑源性神经营养因子表达对大鼠损伤脊髓轴突的保护作用
作者：沈岳 廖维宏 王国强 李芳 伍亚民 龙在云 李应玉 陈恒胜
单位：沈岳(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)；廖维宏(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)；王国强(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)；李芳(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)
关键词：脊髓损伤；脑源性神经营养因子；腺病毒载体；重力打击模型；基因治疗
第三军医大学学报000214
提要 目的：研究腺病毒介导的脑源性神经营养因子 (BDNF)基因在大鼠损伤脊髓内的表达规律，观察外源性 BDNF对损伤脊髓的作用。方法：利用激光束描记位移 的重力打击装置，制备可靠的定量损伤模型；以直 接注射法将带有BDNF基因表达框的复制缺陷重组腺病 毒载体直接转移至大鼠损伤脊髓，用X-Gal染色检测 基因转移有效性，并观察损伤轴突计量形态学改变 ，损伤脊髓BDNFmRNA表达，BDNF和神经中丝(Neurofilament,NF)免疫组化活性的改变。结果：腺病毒载体直接引入脊髓 可有效地感染脊髓组织和表达报告基因。直接转染 BDNF腺病毒载体可明显减少伤后两周轴突丧失；同时 ，NF免疫反应阳性的轴突较正常增多。结论：实验性腺病毒介导的BDNF基因损伤脊髓转移是可行的。在基 因直接转移局部外源性BDNF过表达对神经具有保护作用，可减少轴突丧失，促进神经元骨架蛋白的修复 。这种双重作用可能在脊髓损伤治疗中有重要的价值。
, 百拇医药
中图法分类号R373.1;R349.32;R651.2 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0146-04
Protective effects of adenovirus-mediated expression of brain-derived neurotrophic factors on spinal axon after spinal cord injury in rats
SHEN Yue, LIAO Wei-hong, WANG Guo-qiang, LI Fang, WU Ya-min,LONG Zhai-yun, LI Ying-yu, CHEN Heng-sheng
(Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
, 百拇医药
Abstract Objective: To investigate the effects of the expression of exogenous brain- derived neurotrophic factors (BDNF) on injured spinal cord following in vivo adenoviral gene transfer to the cord. Methods: The model of quantitative injury was established in rats with the weight-drop apparatus with a laser compression recorder. The replicate-defect recombinant adenoviral vector was transferred into the injured spinal cord through direct injection. The gene transfer was verified with X-Ga1 staining and the changes in morphology of the injured axon were quantitatively determined. Meanwhile, the expression of BDNF mRNA and immunohistochemical reactivity of BDNF and NF in the injured spinal cord were investigated. Results: The spinal cord was infected by injection of the adenoviral vector and expressed the report gene. The loss of axons reduced following the in vivo infection of adenoviral vector carrying exogenous BDNF gene after SCI, while more positive axons in immunohistochemical reaction than that of normal spinal cord were seen. Conclusion: In vivo transfer of adenoviral vector into the foci can provide protection to some extent to injured axons through increasing local expression of exogenous BDNF and facilitate repair of the cytoskeleton in the injured neurons. These effects are important in gene therapy of SCI.- derived neurotrophic factors (BDNF) on injured spinal cord following in vivo adenoviral gene transfer to the cord. Methods: The model of quantitative injury was established in rats with the weight-drop apparatus with a laser compression recorder. The replicate-defect recombinant adenoviral vector was transferred into the injured spinal cord through direct injection. The gene transfer was verified with X-Ga1 staining and the changes in morphology of the injured axon were quantitatively determined. Meanwhile, the expression of BDNF mRNA and immunohistochemical reactivity of BDNF and NF in the injured spinal cord were investigated. Results: The spinal cord was infected by injection of the adenoviral vector and expressed the report gene. The loss of axons reduced following the in vivo infection of adenoviral vector carrying exogenous BDNF gene after SCI, while more positive axons in immunohistochemical reaction than that of normal spinal cord were seen. Conclusion: In vivo transfer of adenoviral vector into the foci can provide protection to some extent to injured axons through increasing local expression of exogenous BDNF and facilitate repair of the cytoskeleton in the injured neurons. These effects are important in gene therapy of SCI.
, http://www.100md.com
Key words spinal cord injury; brain derived neurotrophic factor; adenoviral vector; weight-drop model; gene therapy
神经营养因子家族(Neurotrophins,NTFs)可促进中枢神经系统(Central nervous system,CNS)创伤后神经的修复与再生。 但是NTFs因来源困难、半衰期短、组织含量低、不能 通过血脑屏障，所以常规途径应用疗效较差[1]。脑源 性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factors，BDNF)是神经营 养因子家族的代表之一，正常情况下在脊髓中很难 检测到表达[2]，而在损伤时脊髓中呈现明显表达[3]， 可能在脊髓损伤过程中有重要的作用。腺病毒载体 是新的载体，具有可感染不具有分化能力的中枢神 经系统神经细胞的能力，致病性小等特点[4]，在中枢 神经系统转基因研究中有重要的应用前景。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 主要材料
AxCA-BDNF为含小鼠BDNFcDNA表达框的重组腺病毒载体，赵敏博士(英国Berminham大学)惠赠。293人胚肾细胞(ATCC CRL1573：Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd,Osaka)。抗NF200单克隆抗体，抗 BDNF多克隆抗体(北京原平生物化学试剂公司)。BDNF寡 核苷酸探针(上海生物工程研究所合成，本室自行3’末端地高辛标记)。S-P免疫组化试剂盒(福洲迈新生物技术开发公司)。江湾I型立体定位仪。自行研 制的激光描计重力打击装置。恒冷冰冻切片机(CM1850， Laica，德国)。
1.2 实验分组与动物模型制备
选用Wistar大鼠36只，体重(304±20)g，雌性，随机分为3组 。①单纯损伤组；②损伤+AxCA-BDNF感染组；③正常 对照组。前2组各15只，正常对照组6只动物。手术切 除T13椎板，暴露脊髓。采用改良Allen′s重物打击法致伤。打击高度为1.25cm，重物为10g。致伤装置自行研制 ，配有激光描计装置，可对脊髓压缩幅度进行精确 定量(另文报道)。
, 百拇医药
1.3 实验方法与观测指标
1.3.1 腺病毒载体转染脊髓方法动物麻醉后固定于立 体定位仪上。在T13处硬脊膜背侧中血管旁轻轻挑开一 个纵行小口，利用微电极推进器和微量注射器，向 头侧呈45°角进针，深度约1.5mm，将滴度为1×107PFU/ml的 病毒载体(AxCA-BDNF)或含LACZ基因的腺病毒载体稀释液2μl注入脊髓，2min内推入，保留5min后退出。正常对照组 动物推入5μl生理盐水。关闭伤口，分笼喂养。
1.3.2 标本采集及处理在术后2d，2周和4周时取脊髓标本。用于免疫细胞化学染色和X-Gal染色的标本用4% 多聚甲醛灌注固定，恒冷冰冻切片机中切片，切片 厚20μm。用于甲苯胺蓝染色的标本以2.5%戊二醛灌注固定，“半薄”切片，切片厚1mm。
1.3.3 X-gal染色取含LACZ基因转移的标本，参照文献[5]方 法进行X-gal组织化学染色。
, 百拇医药
1.3.4 行为学观察采用改良LeMay评分法[6]，判定伤后下肢神经功能变化。
1.3.5 形态学观察分别作常规病理切片，HE染色，“半 薄切片”，甲苯胺蓝染色。半薄切片甲苯胺蓝染色 后，除定性观察外，参照Rosenberg方法[7]在白质腹内侧 区域，相当于灰质腹角内侧部位随机取2个视野，用 图像系统进行定量分析，轴突计数。
1.3.6 免疫组织细胞化学观察BDNFmRNA原位分子杂交：取 注射AxCA-BDNF动物的标本，按标准方法杂交，并参照 蔡文琴方法[8]略加修改。NF和BDNF免疫组化染色，采用S-P法。NF200免疫反应阳性轴突，用图像分析系统进行定 量分析。分析部位的选择同前述轴突定量的方法。
1.4 统计学处理
数据以
±s表示，并用EXCELL软件和SPSS统计程序包进行 t检验分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 转移基因检测
X-gal染出的蓝色斑可以在注射部位和损伤脊髓段内 出现。术后第4周时在损伤节段仍有半乳糖苷酶表达 ，可见到明显的染色，见图1。
图1 注射部位脊髓切片
A：注射含LACZ基因载体后2d，注射部位出现蓝色斑(X-gal×50)；B：注射后4周(X-gal×200)
Fig1 Sections of the spinal cord at injection site
, 百拇医药
A:Two days after injection of the vectors containing LACZ gene,the blue spots were found at the injection site(X-gal×50)；B:Four weeks after injection(X-gal× 200)
2.2 行为学观察
正常对照组术后12h和24h观察，LeMay评分结果：可见 部分大鼠麻醉清醒后有一过性的功能障碍，术后1d均 得到恢复。伤后第1天单纯损伤组、损伤+AxCA-BDNF组 的LeMay平均评分结果分别为8.11、7.44；伤后第2周平均评 分分别为6.00、4.67，提示动物均迅速地出现一定程度 的恢复。各时相点之间比较有显著性差异。但在相 同时相点，各组之间未能发现有统计学意义的区别 。
2.3 轴突定量观察
, http://www.100md.com
脊髓白质腹内侧轴突计数表明单纯损伤后3d和2周有 明显的轴突丧失。而损伤加AxCA-BDNF组轴突的丧失较少，见图2、表1。
图2 伤后2周脊髓切片(甲苯胺蓝法×200)
A:单纯损伤组的轴突明显丧失；B：损伤+AxCA-BDNF组 保存的轴突较少
Fig2 Sections of the spinal cord after two weeks(Toludine staining×200)
A:Significant axons loses in injury group;B:More axons were lesser in injury+AxCA- BDNF group
, 百拇医药
表1 两组轴突数目比较(n=15,±s)
Tab1 Comparison of axon numbers between the two groups(n=15,±s)
Groups
Post-injury
3days
2weeks
4weeks
Injury
, http://www.100md.com
1716.25±176.28
1061.25±163.13**
1346.25±99.87**
Injury+AxCA-BDNF
1767.50±127.06
1645.00±188.35++
1482.50±172.32*
*:P<0.05,**:P<0.01 vs the previous time points;++:P<0.01 vs injury
, 百拇医药 2.4 损伤脊髓免疫组化改变
2.4.1 BDNF mRNA 原位分子杂交结果显示伤后3d和2周时，除 对照组外，均有阳性运动神经元在灰质前角附近出现。而4周时仅在损伤+AxCA-BDNF组中可以见到阳性杂 交信号。
2.4.2 BDNF 正常时BDNF免疫组化反应阳性的神经元和神经 纤维末梢仅仅见于脊髓灰质后角及其附近。单纯损 伤组伤后3d可出现于损伤段附近脊髓灰质前角，2周 时阳性反应很难见到。损伤+AxCA-BDNF组到第4周时仍 可发现阳性反应细胞。
2.4.3 NF200 伤后3d，各组动物白质中的NF阳性轴突明显 减少，尤其以靠近灰质附近的阳性轴突减少明显。2周 时，单纯损伤组仍然有继续阳性轴突丧失，而损伤+AxCA-BDNF组未继续减少。4周时，损伤+AxCA-BDNF组阳 性轴突有所增加，见表2。
, http://www.100md.com
表2 两组NF阳性轴突比较(n=15,±s)
Tab2 Comparison of numbers of NF-positive axons between the two groups(n=15,±s)
Groups
Post-injury
3days
2weeks
4weeks
Injury
, 百拇医药
624.50±182.94
484.25±132.03*
552.38±137.74
Injury+AxCA-BDNF
624.50±140.33
624.50±92.03++
721.63±107.85+
*:P<0.01 vs the previous time points;+:P<0.05 ,++:P<0.01 vs injury
3 讨论
, 百拇医药
本实验作为转基因治疗脊髓损伤的初步研究，利用 复制缺陷腺病毒载体将外源性BDNF基因直接引入脊髓 ，证实该载体可有效地感染脊髓组织和表达报告基 因，并且进一步证实转染AxCA-BDNF基因后局部BDNF基因 的表达增加。近年来人们付出了极大的努力来探索 克服血脑屏障向中枢神经系统释放基因材料的方法 。基于成熟神经元不具有分裂能力这一特性，目前 CNS基因治疗研究较为新颖和有效的方法是先将外源基 因插入作为载体的复制缺陷病毒(如AVV，Ad，HSV-1， 这些病毒的共同特征是转染的效率高，并可以转染 不分裂的成熟细胞)，然后转染体内细胞直接在成 熟的神经元中表达目的基因(属体内直接途径法，主要用于动物实验)[9]。
直接将载体引入靶组织的注射法是一种切实可靠的 简便方法。Zhang[5]采用的注射剂量约为0.5μl[8]。而我们 的剂量稍大，但结果证明单纯注射本身引起的创伤 对下肢功能没有明显损害。后期的观察未发现功能 障碍表明重组腺病毒所引起的局部反应也未造成功 能损害。因属不完全性损伤，故行为学观察大多数 动物均有不同程度的功能恢复。LeMay评分[6]虽然为较 理想的功能评估方法，但主要是一个综合性评分系 统，因而较难证实各组动物之间在相同时相点功能 障碍程度上的较细微差异。
, 百拇医药
实验中发现，尽管直接转染病毒的方法可以使局部 注射点周围较广泛节段的脊髓细胞受到感染，但该 方法似乎主要是使脊髓灰质前角运动神经元表达在 正常时很少表达的BDNF mRNA，这种作用在脊髓损伤病理 生理过程中的价值值得探讨。
Novikov[10]证实了BDNF具有减少脊髓损伤后神经元死亡和 损伤区大小的作用。他所用的BDNF是通过导管引入， 定期给药，所用的模型为胫运动神经元池模型。本 研究进一步用直接和间接转基因的方法将BDNF引入脊 髓，观察其对临床最为常见类型脊髓挫伤的作用。 结果证实脊髓白质轴突计数提示伤后2周直接转染BDNF腺 病毒载体组动物的轴突减少程度较少。BDNF这种防止 脊髓损伤后轴突减少的作用有重要的意义，因为保 存残留轴突并促进这些轴突修复和再生是脊髓损伤 治疗和研究中最为重要的内容。仅仅多挽救百分之 几的轴突就可能给伤员带来完全不同的生存质量。 神经中丝(NF)是构成神经细胞尤其是神经轴突的主 要框架结构。我们所用的抗200×103u的抗体，正常时仅 仅存在于轴突内。故一般情况下胞体不着色。当脊 髓细胞修复或神经细胞功能增强而在胞体中大量合成200×103u的神经中丝时，轴突的着色增加，胞体也 可着色。本实验利用NF200对神经骨架蛋白进行初步观 察结果表明：BDNF直接转基因治疗的动物在伤后4周时 ，NF免疫反应阳性的轴突较正常增多。提示BDNF过表达 不但与防止轴突丧失的机制有关，还与促进神经元 骨架蛋白的修复机制有关。这种双重作用可能在脊 髓损伤治疗中有重要的价值。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670740)
作者简介：沈岳(1959.3)，男，重庆市人，博士，主治 医师，讲师，主要从事脊髓损伤及创伤救治方面的研究，发表论文16篇。电话：(023)68757624
作者单位：伍亚民(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)；龙在云(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)
参考文献
[1]Zlokovic B V, Apuzzo M L J. Cellular and molecular neuro-surgery: pathways from concept to reality[J]. Neurosurgery，1997, 40(4):789-803.
, http://www.100md.com
[2]Yan Q, Rosenfeld R D, Matheson C R, et al. Expression of brain-derived neurotrophic factor protein in the adult rat central nervous system[J].Neuroscience， 1997,78(2):431-448.
[3]李兵仓，王正国，朱佩芳，等.脑源性神经营养因子mRNA在胚胎脊髓修复成鼠脊髓损伤过程中的变化 [J].Natl Med J China， 1997, 77(7): 516-520.
[4]Kojima H, Inuzuka S, Miwa T, et al. Construction and charac-terization of adenoviral vector expressing biologically active brain derived neurotrophic factors[J]. Biochemical Biophysical Re-search Communication，1995, 212(2):712- 717.
, 百拇医药
[5]Zhang Y,Dijkhuyizen P A, Anderson P N, et al. NT-3 delivered by an adenoviral vector induces injured dorsal root axons to re-generate into the spinal cord of adult rats[J]. J Neuroscience Research， 1998, 54(3):554-562.
[6]LeMay D R,Neal S, Neal S, et al. Paraplegia in the rat induced by aortic cross- clamping: model characterization and glucose ex-acerbation of neurologic deficit[J]. J Vasc Surg, 1987, 6(4): 383-390.
[7]Rosenberg L J, Wrathall J R. Quantitative analysis of acute axonal pathology in experimental spinal cord contusion[J]. J Neurotrauma， 1997, 14(11):823- 838.
, 百拇医药
[8]蔡文琴，王伯沄.实用免疫细胞化学及核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版 社 ， 1994.421-428.
[9]Sayers S T, Khan N, Ahmed Y, et al. Preparation of brain-derived neurotrophic factor-and neurotrophin-3-secreting Schwann cells by infection with a retroviral vector[J]. J Mol Neurosci,1998,10(2):143-160.
[10]Novikov L, Novikova L, Kellerth J O. Brain derived neu-rotrophic factor promotes axonal regeneration and long term survival of adult rat spinal motoneurons in vivo[J]. Neuro-science， 1997, 79(3):765-774.
收稿日期：1999-09-15；修回日期：1999-12-21, 百拇医药
单位：沈岳(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)；廖维宏(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)；王国强(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)；李芳(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)
关键词：脊髓损伤；脑源性神经营养因子；腺病毒载体；重力打击模型；基因治疗
第三军医大学学报000214
提要 目的：研究腺病毒介导的脑源性神经营养因子 (BDNF)基因在大鼠损伤脊髓内的表达规律，观察外源性 BDNF对损伤脊髓的作用。方法：利用激光束描记位移 的重力打击装置，制备可靠的定量损伤模型；以直 接注射法将带有BDNF基因表达框的复制缺陷重组腺病 毒载体直接转移至大鼠损伤脊髓，用X-Gal染色检测 基因转移有效性，并观察损伤轴突计量形态学改变 ，损伤脊髓BDNFmRNA表达，BDNF和神经中丝(Neurofilament,NF)免疫组化活性的改变。结果：腺病毒载体直接引入脊髓 可有效地感染脊髓组织和表达报告基因。直接转染 BDNF腺病毒载体可明显减少伤后两周轴突丧失；同时 ，NF免疫反应阳性的轴突较正常增多。结论：实验性腺病毒介导的BDNF基因损伤脊髓转移是可行的。在基 因直接转移局部外源性BDNF过表达对神经具有保护作用，可减少轴突丧失，促进神经元骨架蛋白的修复 。这种双重作用可能在脊髓损伤治疗中有重要的价值。
, 百拇医药
中图法分类号R373.1;R349.32;R651.2 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0146-04
Protective effects of adenovirus-mediated expression of brain-derived neurotrophic factors on spinal axon after spinal cord injury in rats
SHEN Yue, LIAO Wei-hong, WANG Guo-qiang, LI Fang, WU Ya-min,LONG Zhai-yun, LI Ying-yu, CHEN Heng-sheng
(Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
, 百拇医药
Abstract Objective: To investigate the effects of the expression of exogenous brain- derived neurotrophic factors (BDNF) on injured spinal cord following in vivo adenoviral gene transfer to the cord. Methods: The model of quantitative injury was established in rats with the weight-drop apparatus with a laser compression recorder. The replicate-defect recombinant adenoviral vector was transferred into the injured spinal cord through direct injection. The gene transfer was verified with X-Ga1 staining and the changes in morphology of the injured axon were quantitatively determined. Meanwhile, the expression of BDNF mRNA and immunohistochemical reactivity of BDNF and NF in the injured spinal cord were investigated. Results: The spinal cord was infected by injection of the adenoviral vector and expressed the report gene. The loss of axons reduced following the in vivo infection of adenoviral vector carrying exogenous BDNF gene after SCI, while more positive axons in immunohistochemical reaction than that of normal spinal cord were seen. Conclusion: In vivo transfer of adenoviral vector into the foci can provide protection to some extent to injured axons through increasing local expression of exogenous BDNF and facilitate repair of the cytoskeleton in the injured neurons. These effects are important in gene therapy of SCI.- derived neurotrophic factors (BDNF) on injured spinal cord following in vivo adenoviral gene transfer to the cord. Methods: The model of quantitative injury was established in rats with the weight-drop apparatus with a laser compression recorder. The replicate-defect recombinant adenoviral vector was transferred into the injured spinal cord through direct injection. The gene transfer was verified with X-Ga1 staining and the changes in morphology of the injured axon were quantitatively determined. Meanwhile, the expression of BDNF mRNA and immunohistochemical reactivity of BDNF and NF in the injured spinal cord were investigated. Results: The spinal cord was infected by injection of the adenoviral vector and expressed the report gene. The loss of axons reduced following the in vivo infection of adenoviral vector carrying exogenous BDNF gene after SCI, while more positive axons in immunohistochemical reaction than that of normal spinal cord were seen. Conclusion: In vivo transfer of adenoviral vector into the foci can provide protection to some extent to injured axons through increasing local expression of exogenous BDNF and facilitate repair of the cytoskeleton in the injured neurons. These effects are important in gene therapy of SCI.
, http://www.100md.com
Key words spinal cord injury; brain derived neurotrophic factor; adenoviral vector; weight-drop model; gene therapy
神经营养因子家族(Neurotrophins,NTFs)可促进中枢神经系统(Central nervous system,CNS)创伤后神经的修复与再生。 但是NTFs因来源困难、半衰期短、组织含量低、不能 通过血脑屏障，所以常规途径应用疗效较差[1]。脑源 性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factors，BDNF)是神经营 养因子家族的代表之一，正常情况下在脊髓中很难 检测到表达[2]，而在损伤时脊髓中呈现明显表达[3]， 可能在脊髓损伤过程中有重要的作用。腺病毒载体 是新的载体，具有可感染不具有分化能力的中枢神 经系统神经细胞的能力，致病性小等特点[4]，在中枢 神经系统转基因研究中有重要的应用前景。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 主要材料
AxCA-BDNF为含小鼠BDNFcDNA表达框的重组腺病毒载体，赵敏博士(英国Berminham大学)惠赠。293人胚肾细胞(ATCC CRL1573：Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd,Osaka)。抗NF200单克隆抗体，抗 BDNF多克隆抗体(北京原平生物化学试剂公司)。BDNF寡 核苷酸探针(上海生物工程研究所合成，本室自行3’末端地高辛标记)。S-P免疫组化试剂盒(福洲迈新生物技术开发公司)。江湾I型立体定位仪。自行研 制的激光描计重力打击装置。恒冷冰冻切片机(CM1850， Laica，德国)。
1.2 实验分组与动物模型制备
选用Wistar大鼠36只，体重(304±20)g，雌性，随机分为3组 。①单纯损伤组；②损伤+AxCA-BDNF感染组；③正常 对照组。前2组各15只，正常对照组6只动物。手术切 除T13椎板，暴露脊髓。采用改良Allen′s重物打击法致伤。打击高度为1.25cm，重物为10g。致伤装置自行研制 ，配有激光描计装置，可对脊髓压缩幅度进行精确 定量(另文报道)。
, 百拇医药
1.3 实验方法与观测指标
1.3.1 腺病毒载体转染脊髓方法动物麻醉后固定于立 体定位仪上。在T13处硬脊膜背侧中血管旁轻轻挑开一 个纵行小口，利用微电极推进器和微量注射器，向 头侧呈45°角进针，深度约1.5mm，将滴度为1×107PFU/ml的 病毒载体(AxCA-BDNF)或含LACZ基因的腺病毒载体稀释液2μl注入脊髓，2min内推入，保留5min后退出。正常对照组 动物推入5μl生理盐水。关闭伤口，分笼喂养。
1.3.2 标本采集及处理在术后2d，2周和4周时取脊髓标本。用于免疫细胞化学染色和X-Gal染色的标本用4% 多聚甲醛灌注固定，恒冷冰冻切片机中切片，切片 厚20μm。用于甲苯胺蓝染色的标本以2.5%戊二醛灌注固定，“半薄”切片，切片厚1mm。
1.3.3 X-gal染色取含LACZ基因转移的标本，参照文献[5]方 法进行X-gal组织化学染色。
, 百拇医药
1.3.4 行为学观察采用改良LeMay评分法[6]，判定伤后下肢神经功能变化。
1.3.5 形态学观察分别作常规病理切片，HE染色，“半 薄切片”，甲苯胺蓝染色。半薄切片甲苯胺蓝染色 后，除定性观察外，参照Rosenberg方法[7]在白质腹内侧 区域，相当于灰质腹角内侧部位随机取2个视野，用 图像系统进行定量分析，轴突计数。
1.3.6 免疫组织细胞化学观察BDNFmRNA原位分子杂交：取 注射AxCA-BDNF动物的标本，按标准方法杂交，并参照 蔡文琴方法[8]略加修改。NF和BDNF免疫组化染色，采用S-P法。NF200免疫反应阳性轴突，用图像分析系统进行定 量分析。分析部位的选择同前述轴突定量的方法。
1.4 统计学处理
数据以
±s表示，并用EXCELL软件和SPSS统计程序包进行 t检验分析。, 百拇医药
2 结果
2.1 转移基因检测
X-gal染出的蓝色斑可以在注射部位和损伤脊髓段内 出现。术后第4周时在损伤节段仍有半乳糖苷酶表达 ，可见到明显的染色，见图1。
图1 注射部位脊髓切片
A：注射含LACZ基因载体后2d，注射部位出现蓝色斑(X-gal×50)；B：注射后4周(X-gal×200)
Fig1 Sections of the spinal cord at injection site
, 百拇医药
A:Two days after injection of the vectors containing LACZ gene,the blue spots were found at the injection site(X-gal×50)；B:Four weeks after injection(X-gal× 200)
2.2 行为学观察
正常对照组术后12h和24h观察，LeMay评分结果：可见 部分大鼠麻醉清醒后有一过性的功能障碍，术后1d均 得到恢复。伤后第1天单纯损伤组、损伤+AxCA-BDNF组 的LeMay平均评分结果分别为8.11、7.44；伤后第2周平均评 分分别为6.00、4.67，提示动物均迅速地出现一定程度 的恢复。各时相点之间比较有显著性差异。但在相 同时相点，各组之间未能发现有统计学意义的区别 。
2.3 轴突定量观察
, http://www.100md.com
脊髓白质腹内侧轴突计数表明单纯损伤后3d和2周有 明显的轴突丧失。而损伤加AxCA-BDNF组轴突的丧失较少，见图2、表1。
图2 伤后2周脊髓切片(甲苯胺蓝法×200)
A:单纯损伤组的轴突明显丧失；B：损伤+AxCA-BDNF组 保存的轴突较少
Fig2 Sections of the spinal cord after two weeks(Toludine staining×200)
A:Significant axons loses in injury group;B:More axons were lesser in injury+AxCA- BDNF group
, 百拇医药
表1 两组轴突数目比较(n=15,
±s)Tab1 Comparison of axon numbers between the two groups(n=15,
±s)Groups
Post-injury
3days
2weeks
4weeks
Injury
, http://www.100md.com
1716.25±176.28
1061.25±163.13**
1346.25±99.87**
Injury+AxCA-BDNF
1767.50±127.06
1645.00±188.35++
1482.50±172.32*
*:P<0.05,**:P<0.01 vs the previous time points;++:P<0.01 vs injury
, 百拇医药 2.4 损伤脊髓免疫组化改变
2.4.1 BDNF mRNA 原位分子杂交结果显示伤后3d和2周时，除 对照组外，均有阳性运动神经元在灰质前角附近出现。而4周时仅在损伤+AxCA-BDNF组中可以见到阳性杂 交信号。
2.4.2 BDNF 正常时BDNF免疫组化反应阳性的神经元和神经 纤维末梢仅仅见于脊髓灰质后角及其附近。单纯损 伤组伤后3d可出现于损伤段附近脊髓灰质前角，2周 时阳性反应很难见到。损伤+AxCA-BDNF组到第4周时仍 可发现阳性反应细胞。
2.4.3 NF200 伤后3d，各组动物白质中的NF阳性轴突明显 减少，尤其以靠近灰质附近的阳性轴突减少明显。2周 时，单纯损伤组仍然有继续阳性轴突丧失，而损伤+AxCA-BDNF组未继续减少。4周时，损伤+AxCA-BDNF组阳 性轴突有所增加，见表2。
, http://www.100md.com
表2 两组NF阳性轴突比较(n=15,
±s)Tab2 Comparison of numbers of NF-positive axons between the two groups(n=15,
±s)Groups
Post-injury
3days
2weeks
4weeks
Injury
, 百拇医药
624.50±182.94
484.25±132.03*
552.38±137.74
Injury+AxCA-BDNF
624.50±140.33
624.50±92.03++
721.63±107.85+
*:P<0.01 vs the previous time points;+:P<0.05 ,++:P<0.01 vs injury
3 讨论
, 百拇医药
本实验作为转基因治疗脊髓损伤的初步研究，利用 复制缺陷腺病毒载体将外源性BDNF基因直接引入脊髓 ，证实该载体可有效地感染脊髓组织和表达报告基 因，并且进一步证实转染AxCA-BDNF基因后局部BDNF基因 的表达增加。近年来人们付出了极大的努力来探索 克服血脑屏障向中枢神经系统释放基因材料的方法 。基于成熟神经元不具有分裂能力这一特性，目前 CNS基因治疗研究较为新颖和有效的方法是先将外源基 因插入作为载体的复制缺陷病毒(如AVV，Ad，HSV-1， 这些病毒的共同特征是转染的效率高，并可以转染 不分裂的成熟细胞)，然后转染体内细胞直接在成 熟的神经元中表达目的基因(属体内直接途径法，主要用于动物实验)[9]。
直接将载体引入靶组织的注射法是一种切实可靠的 简便方法。Zhang[5]采用的注射剂量约为0.5μl[8]。而我们 的剂量稍大，但结果证明单纯注射本身引起的创伤 对下肢功能没有明显损害。后期的观察未发现功能 障碍表明重组腺病毒所引起的局部反应也未造成功 能损害。因属不完全性损伤，故行为学观察大多数 动物均有不同程度的功能恢复。LeMay评分[6]虽然为较 理想的功能评估方法，但主要是一个综合性评分系 统，因而较难证实各组动物之间在相同时相点功能 障碍程度上的较细微差异。
, 百拇医药
实验中发现，尽管直接转染病毒的方法可以使局部 注射点周围较广泛节段的脊髓细胞受到感染，但该 方法似乎主要是使脊髓灰质前角运动神经元表达在 正常时很少表达的BDNF mRNA，这种作用在脊髓损伤病理 生理过程中的价值值得探讨。
Novikov[10]证实了BDNF具有减少脊髓损伤后神经元死亡和 损伤区大小的作用。他所用的BDNF是通过导管引入， 定期给药，所用的模型为胫运动神经元池模型。本 研究进一步用直接和间接转基因的方法将BDNF引入脊 髓，观察其对临床最为常见类型脊髓挫伤的作用。 结果证实脊髓白质轴突计数提示伤后2周直接转染BDNF腺 病毒载体组动物的轴突减少程度较少。BDNF这种防止 脊髓损伤后轴突减少的作用有重要的意义，因为保 存残留轴突并促进这些轴突修复和再生是脊髓损伤 治疗和研究中最为重要的内容。仅仅多挽救百分之 几的轴突就可能给伤员带来完全不同的生存质量。 神经中丝(NF)是构成神经细胞尤其是神经轴突的主 要框架结构。我们所用的抗200×103u的抗体，正常时仅 仅存在于轴突内。故一般情况下胞体不着色。当脊 髓细胞修复或神经细胞功能增强而在胞体中大量合成200×103u的神经中丝时，轴突的着色增加，胞体也 可着色。本实验利用NF200对神经骨架蛋白进行初步观 察结果表明：BDNF直接转基因治疗的动物在伤后4周时 ，NF免疫反应阳性的轴突较正常增多。提示BDNF过表达 不但与防止轴突丧失的机制有关，还与促进神经元 骨架蛋白的修复机制有关。这种双重作用可能在脊 髓损伤治疗中有重要的价值。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670740)
作者简介：沈岳(1959.3)，男，重庆市人，博士，主治 医师，讲师，主要从事脊髓损伤及创伤救治方面的研究，发表论文16篇。电话：(023)68757624
作者单位：伍亚民(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)；龙在云(第三军医大学附属 大坪医院野战外科研究所创伤中心，重庆400042)
参考文献
[1]Zlokovic B V, Apuzzo M L J. Cellular and molecular neuro-surgery: pathways from concept to reality[J]. Neurosurgery，1997, 40(4):789-803.
, http://www.100md.com
[2]Yan Q, Rosenfeld R D, Matheson C R, et al. Expression of brain-derived neurotrophic factor protein in the adult rat central nervous system[J].Neuroscience， 1997,78(2):431-448.
[3]李兵仓，王正国，朱佩芳，等.脑源性神经营养因子mRNA在胚胎脊髓修复成鼠脊髓损伤过程中的变化 [J].Natl Med J China， 1997, 77(7): 516-520.
[4]Kojima H, Inuzuka S, Miwa T, et al. Construction and charac-terization of adenoviral vector expressing biologically active brain derived neurotrophic factors[J]. Biochemical Biophysical Re-search Communication，1995, 212(2):712- 717.
, 百拇医药
[5]Zhang Y,Dijkhuyizen P A, Anderson P N, et al. NT-3 delivered by an adenoviral vector induces injured dorsal root axons to re-generate into the spinal cord of adult rats[J]. J Neuroscience Research， 1998, 54(3):554-562.
[6]LeMay D R,Neal S, Neal S, et al. Paraplegia in the rat induced by aortic cross- clamping: model characterization and glucose ex-acerbation of neurologic deficit[J]. J Vasc Surg, 1987, 6(4): 383-390.
[7]Rosenberg L J, Wrathall J R. Quantitative analysis of acute axonal pathology in experimental spinal cord contusion[J]. J Neurotrauma， 1997, 14(11):823- 838.
, 百拇医药
[8]蔡文琴，王伯沄.实用免疫细胞化学及核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版 社 ， 1994.421-428.
[9]Sayers S T, Khan N, Ahmed Y, et al. Preparation of brain-derived neurotrophic factor-and neurotrophin-3-secreting Schwann cells by infection with a retroviral vector[J]. J Mol Neurosci,1998,10(2):143-160.
[10]Novikov L, Novikova L, Kellerth J O. Brain derived neu-rotrophic factor promotes axonal regeneration and long term survival of adult rat spinal motoneurons in vivo[J]. Neuro-science， 1997, 79(3):765-774.
收稿日期：1999-09-15；修回日期：1999-12-21, 百拇医药