地塞米松及雷公藤甲素对哮喘CD4、CD8细胞凋亡的影响
作者：林科雄 王长征 钱桂生
单位：林科雄(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037)；王长征(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037)
关键词：哮喘；地塞米松；雷公藤甲素；细胞凋亡
第三军医大学学报000210
提要 目的：探讨地塞米松(DM)和雷公藤对哮喘CD4、CD8细 胞凋亡的作用。方法：采用卵蛋白致敏复制哮喘豚 鼠模型。哮喘豚鼠经腹腔内注射DM和雷公藤甲素(TP)后 ，用淋巴细胞分离液的密度梯度离心分离外周血单 个核细胞(PBMCs)。采用免疫细胞化学(ICC)与3'末端转移酶 介导的脱氧三磷酸尿苷(dUTP)缺口末端标记(TUNEL)双标染 色对CD4、CD8细胞凋亡进行检测。结果：DM和TP均能诱导 哮喘外周血CD4、CD8细胞凋亡(P<0.01)；而DM组与TP组CD4、CD8细胞凋亡率无显著差别(P><0.05)。结论：TP和DM均能 诱导哮喘CD4、CD8细胞凋亡，且其作用具有相似性。
, 百拇医药
中图法分类号R329.25;R562.250.53 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0132-03
Effects of desamethasone and triptolide on apoptosis of CD4 and CD8T cells in asthmatic guinea pigs
LIN Ke-xiong, WANG Chang-zheng, QIAN Gui-sheng
(Department of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037)
Abstract Objective: To investigate the effects of desamethasone (DM) and triptolide (TP) on apoptosis of CD4 and CD8T cells in asthma. Methods: After asthma was induced by ovalbumin in the guinea pigs, the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated with gradient centrifugation. The apoptotic CD4 or CD8T cells were detected by double staining with immunocyutochemistry (ICC) and terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP nick and end labeling (TUNEL). Results: Administration of TP or DM to allergic guinea pigs significantly increased the apoptotic rates of CD4 and CD8T cells (P<0.01);However,there was no marked difference in apoptotic rate between Ttreated and DM-treated animals.Conclusion：TP and DM can exert similar effects on induction of apoptosis of CD4 and CD8T cells in asthma.
, 百拇医药
Key words asthma; desamethasone; triptolide; apoptosis
糖皮质激素具有广泛的抗炎作用，是目前治疗哮喘 的主要药物。雷公藤具有抗炎及免疫抑制作用，可 抑制T细胞的增殖活化及IL-3、IL-5和GM-CSF等细胞因 子表达，用于治疗哮喘有效[1，2]。但二者能否诱导 哮喘CD4、CD8细胞凋亡尚不清楚。本研究采用免疫细胞 化学(ICC)S-AP法与3'末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记 (TUNEL)双标染色，对哮喘豚鼠外周血CD4、CD8细胞凋亡进 行检测，了解雷公藤甲素(Triptolide,TP)及地塞米松 (Desamethasone,DM)对哮喘T细胞亚群的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。小鼠抗人CD4、 CD8单克隆抗体及淋巴细胞亚群检测试剂盒购自北京中 山公司。卵蛋白(OVA)购自上海生化试剂公司。原位细 胞凋亡试剂盒、5-溴-3-吲哚-磷酸盐(BCIP)、四唑 氮蓝(NBT)为宝灵曼公司产品。地塞米松(DM)为重庆制药 六厂产品。雷公藤甲素(TP)为福建省中医研究所产品 。
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1.2 哮喘豚鼠模型的制备及外周血单个核细胞分离
采用OVA致敏和激发建立豚鼠哮喘模型。体重400～500g豚 鼠18只，雌雄不分。分为：哮喘组、DM处理组、TP处理 组，每组6只。第1天腹腔内注射2%OVA氢氧化铝凝胶1ml致 敏豚鼠，第8天重复注射加强致敏，第21天吸入2%OVA生 理盐水激发哮喘发作，吸入前腹腔内注射苯海拉明5mg/kg体 重。DM、TP处理组分别在激发24h后腹腔内分别注射DM10 mg/kg或TP40μg/kg。哮喘组豚鼠激发48h后，DM处理组、TP处 理组用药24h后，用3%戊巴比妥钠1ml/kg体重腹腔内注 射麻醉豚鼠，然后从颈动脉插管抽取外周血，用肝 素抗凝，以淋巴细胞分离液的密度梯度离心分离单 个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)并涂片，4%多聚甲醛固定30min。
1.3 CD4、CD8细胞凋亡检测
, 百拇医药
采用CD4或CD8ICC与TUNEL双标染色进行检测。主要步骤如下：PBS(pH7.2)漂洗。加入小鼠抗人CD4或CD8单克隆抗体20μ l/片，37°C,1h。PBS漂洗。加入二抗37°C，1h。PBS漂洗。加 入三抗37°C，1h。PBS漂洗。0.1%TritonX-100,4°C通透2min。PBS漂洗。0.03%H2O2/0.01%NaN3封闭30min。PBS漂洗。加入由末 端脱氧核苷酸转移酶、脱氧三磷酸核苷和荧光素标 记的dUTP组成的TUNEL反应混合液20μl/片，37°C反应1h。PBS漂 洗。加入过氧化物酶标记的抗荧光素抗体20μl/片，37° C反应30min。PBS漂洗。0.05%DAB/0.01%H2O2显色，光镜下控制显色深浅。PBS漂洗。NBT/BCIP显色。
计数：高倍光镜下计数双染细胞，随意选择视野，至少观察200个细胞以上，分别计数CD4、CD8细胞凋亡率 。
1.4统计学分析
, 百拇医药
CD4、CD8T细胞凋亡率以(
±s)%表示，采用非配对t检验进行组间比较，P<0.05为相差显著。
2 结果
在光学显微镜下观察，单纯凋亡阳性细胞胞核被染成黄色或棕黄色，ICC阳性细胞膜被 染成紫蓝色。ICC和TUNEL双染阳性细胞可见胞核被染成 黄色或棕黄色，胞膜被染成紫蓝色。DM处理组及TP处 理组CD4、CD8细胞凋亡率显著高于哮喘组(P<0.01)。而DM组与TP组凋亡率无显著差别(P>0.05)，结果见图1。
图1 DM和TP对哮喘豚鼠CD4、CD8细胞凋亡的影响
*:P<0.01与哮喘组比较
, 百拇医药
Fig1 The effects of DM and TP on apoptosis of CD4,CD8 cells
*:P<0.01 vs asthmatic group
3 讨论
支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞(Eos)、肥大细胞和 T细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症。CD4细胞 分泌的细胞因子IL-3、GM-CSF和IL-5促进Eos的分化、成 熟、活化和存活延长；IL-4能促进IgE的产生[3]。无论 是哮喘患者支气管肺泡灌洗液(BALF)还是外周血中CD25+ CD4细胞均增多，表达IL-3、IL-4、GM-CSF和IL-5增加， 而且与哮喘严重程度相关[4，5]。所以，CD4细胞在哮喘 发病机制中起重要的调控作用。
CD8细胞在一定条件下也能分泌IL-4、IL-5等Th2细胞因 子[6]。从特应性患者BALF制备的CD8细胞系分泌的IL-5显 著高于非特应性哮喘患者，而且特应性患者CD8T细胞 产生IL-4增加[7]。因此，CD8细胞也可能参与哮喘的发 病。
, 百拇医药
本文实验结果表明DM和TP均能诱导哮喘豚鼠外周血CD4细 胞凋亡，这可能是其减少外周血CD25+CD4细胞数量的机 制之一。同时，DM和TP也能诱导CD8细胞凋亡，提示DM和 TP对T细胞凋亡的作用不具特异性。另一方面，DM和TP诱 导哮喘CD4、CD8细胞的作用无显著差别，说明二者的作 用具有相似性。但糖皮质激素长期应用可抑制下丘脑垂体肾上腺皮质轴，而雷公藤对该轴无抑制 作用，同时雷公藤与糖皮质激素的药理作用存在互 补性[8]。因此，雷公藤与糖皮质激素交替应用或两者 合用能较好地发挥两药的互补性，减少副作用。对 激素依赖型、激素抵抗型或其他不宜应用激素治疗 的哮喘，雷公藤可能是较好的替代药物之一。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870946)
作者简介：林科雄(1969.5)，男，贵州省织金县人，博 士研究生，主治医师，主要从事哮喘气道炎症的免疫机制方面的研 究，发表论文1篇。电话：(023)68755320
, 百拇医药
参考文献
[1]王长征，王春霞，金远林等.哮喘豚鼠IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA表达及雷公藤内酯醇的影响[J].中华微生物和免疫 学杂志，1998，18(2)：145-148.
[2]王长征，王金平，周泽云，等.雷公藤多甙治疗慢性重度哮喘的临床观察[J].实用肺科杂志，1998，5(1)：17-19.
[2]王长征，王金平，周泽云，等.雷公藤多甙治疗慢性重度哮喘的临床观察[J].实用肺科杂志，1998，5(1)：17-19.
[3]Haczku A.T cells and eosinophils in asthma[J].Acta Mic-robiol Immunol Hung,1998,45(1):19-29.
[4]Robinson D S, Hamid Q, Sun Y,et al.Predominant Th2-type bronchoalveolar lavage T-lymphocyte population in atopic asthma [J].N Engl J Med,1992,326(5):298-304.
, 百拇医药
[5]Corrigan C J, Kay A B. CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma. Relationship to disease severity and atopic status [J]. Am Rev Respir Dis,1990,141(4):970-977.
[6]Jerb K, Le Gros G. The role of Th2 type CD4+ T cells and Th2 type CD8+ T cells in asthma[J]. Immunology Cell Biology,1996,74(2):206-208.
[7]Ying S, Humbert M, Barkas J, et al. Expression of IL-4 and IL-5 mRNA and protein produced by CD4+ and CD8+ T cells,eosinophils, and mast cells in bronchial biopsies obtained from atopic and nonatopic (intrinsic) asthmatics[J]. J Immunol,1997,158(7):3 539-3 544.
[8]胡大伟，刘沛霖.雷公藤与强地松的药理作用的互补性[J].中国中西医结合杂志，1997，170(2):94-96.
收稿日期：1999-09-15；修回日期：1999-12-27, http://www.100md.com
单位：林科雄(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037)；王长征(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037)
关键词：哮喘；地塞米松；雷公藤甲素；细胞凋亡
第三军医大学学报000210
提要 目的：探讨地塞米松(DM)和雷公藤对哮喘CD4、CD8细 胞凋亡的作用。方法：采用卵蛋白致敏复制哮喘豚 鼠模型。哮喘豚鼠经腹腔内注射DM和雷公藤甲素(TP)后 ，用淋巴细胞分离液的密度梯度离心分离外周血单 个核细胞(PBMCs)。采用免疫细胞化学(ICC)与3'末端转移酶 介导的脱氧三磷酸尿苷(dUTP)缺口末端标记(TUNEL)双标染 色对CD4、CD8细胞凋亡进行检测。结果：DM和TP均能诱导 哮喘外周血CD4、CD8细胞凋亡(P<0.01)；而DM组与TP组CD4、CD8细胞凋亡率无显著差别(P><0.05)。结论：TP和DM均能 诱导哮喘CD4、CD8细胞凋亡，且其作用具有相似性。
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中图法分类号R329.25;R562.250.53 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0132-03
Effects of desamethasone and triptolide on apoptosis of CD4 and CD8T cells in asthmatic guinea pigs
LIN Ke-xiong, WANG Chang-zheng, QIAN Gui-sheng
(Department of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037)
Abstract Objective: To investigate the effects of desamethasone (DM) and triptolide (TP) on apoptosis of CD4 and CD8T cells in asthma. Methods: After asthma was induced by ovalbumin in the guinea pigs, the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated with gradient centrifugation. The apoptotic CD4 or CD8T cells were detected by double staining with immunocyutochemistry (ICC) and terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP nick and end labeling (TUNEL). Results: Administration of TP or DM to allergic guinea pigs significantly increased the apoptotic rates of CD4 and CD8T cells (P<0.01);However,there was no marked difference in apoptotic rate between Ttreated and DM-treated animals.Conclusion：TP and DM can exert similar effects on induction of apoptosis of CD4 and CD8T cells in asthma.
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Key words asthma; desamethasone; triptolide; apoptosis
糖皮质激素具有广泛的抗炎作用，是目前治疗哮喘 的主要药物。雷公藤具有抗炎及免疫抑制作用，可 抑制T细胞的增殖活化及IL-3、IL-5和GM-CSF等细胞因 子表达，用于治疗哮喘有效[1，2]。但二者能否诱导 哮喘CD4、CD8细胞凋亡尚不清楚。本研究采用免疫细胞 化学(ICC)S-AP法与3'末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记 (TUNEL)双标染色，对哮喘豚鼠外周血CD4、CD8细胞凋亡进 行检测，了解雷公藤甲素(Triptolide,TP)及地塞米松 (Desamethasone,DM)对哮喘T细胞亚群的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。小鼠抗人CD4、 CD8单克隆抗体及淋巴细胞亚群检测试剂盒购自北京中 山公司。卵蛋白(OVA)购自上海生化试剂公司。原位细 胞凋亡试剂盒、5-溴-3-吲哚-磷酸盐(BCIP)、四唑 氮蓝(NBT)为宝灵曼公司产品。地塞米松(DM)为重庆制药 六厂产品。雷公藤甲素(TP)为福建省中医研究所产品 。
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1.2 哮喘豚鼠模型的制备及外周血单个核细胞分离
采用OVA致敏和激发建立豚鼠哮喘模型。体重400～500g豚 鼠18只，雌雄不分。分为：哮喘组、DM处理组、TP处理 组，每组6只。第1天腹腔内注射2%OVA氢氧化铝凝胶1ml致 敏豚鼠，第8天重复注射加强致敏，第21天吸入2%OVA生 理盐水激发哮喘发作，吸入前腹腔内注射苯海拉明5mg/kg体 重。DM、TP处理组分别在激发24h后腹腔内分别注射DM10 mg/kg或TP40μg/kg。哮喘组豚鼠激发48h后，DM处理组、TP处 理组用药24h后，用3%戊巴比妥钠1ml/kg体重腹腔内注 射麻醉豚鼠，然后从颈动脉插管抽取外周血，用肝 素抗凝，以淋巴细胞分离液的密度梯度离心分离单 个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)并涂片，4%多聚甲醛固定30min。
1.3 CD4、CD8细胞凋亡检测
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采用CD4或CD8ICC与TUNEL双标染色进行检测。主要步骤如下：PBS(pH7.2)漂洗。加入小鼠抗人CD4或CD8单克隆抗体20μ l/片，37°C,1h。PBS漂洗。加入二抗37°C，1h。PBS漂洗。加 入三抗37°C，1h。PBS漂洗。0.1%TritonX-100,4°C通透2min。PBS漂洗。0.03%H2O2/0.01%NaN3封闭30min。PBS漂洗。加入由末 端脱氧核苷酸转移酶、脱氧三磷酸核苷和荧光素标 记的dUTP组成的TUNEL反应混合液20μl/片，37°C反应1h。PBS漂 洗。加入过氧化物酶标记的抗荧光素抗体20μl/片，37° C反应30min。PBS漂洗。0.05%DAB/0.01%H2O2显色，光镜下控制显色深浅。PBS漂洗。NBT/BCIP显色。
计数：高倍光镜下计数双染细胞，随意选择视野，至少观察200个细胞以上，分别计数CD4、CD8细胞凋亡率 。
1.4统计学分析
, 百拇医药
CD4、CD8T细胞凋亡率以(
±s)%表示，采用非配对t检验进行组间比较，P<0.05为相差显著。2 结果
在光学显微镜下观察，单纯凋亡阳性细胞胞核被染成黄色或棕黄色，ICC阳性细胞膜被 染成紫蓝色。ICC和TUNEL双染阳性细胞可见胞核被染成 黄色或棕黄色，胞膜被染成紫蓝色。DM处理组及TP处 理组CD4、CD8细胞凋亡率显著高于哮喘组(P<0.01)。而DM组与TP组凋亡率无显著差别(P>0.05)，结果见图1。
图1 DM和TP对哮喘豚鼠CD4、CD8细胞凋亡的影响
*:P<0.01与哮喘组比较
, 百拇医药
Fig1 The effects of DM and TP on apoptosis of CD4,CD8 cells
*:P<0.01 vs asthmatic group
3 讨论
支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞(Eos)、肥大细胞和 T细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症。CD4细胞 分泌的细胞因子IL-3、GM-CSF和IL-5促进Eos的分化、成 熟、活化和存活延长；IL-4能促进IgE的产生[3]。无论 是哮喘患者支气管肺泡灌洗液(BALF)还是外周血中CD25+ CD4细胞均增多，表达IL-3、IL-4、GM-CSF和IL-5增加， 而且与哮喘严重程度相关[4，5]。所以，CD4细胞在哮喘 发病机制中起重要的调控作用。
CD8细胞在一定条件下也能分泌IL-4、IL-5等Th2细胞因 子[6]。从特应性患者BALF制备的CD8细胞系分泌的IL-5显 著高于非特应性哮喘患者，而且特应性患者CD8T细胞 产生IL-4增加[7]。因此，CD8细胞也可能参与哮喘的发 病。
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本文实验结果表明DM和TP均能诱导哮喘豚鼠外周血CD4细 胞凋亡，这可能是其减少外周血CD25+CD4细胞数量的机 制之一。同时，DM和TP也能诱导CD8细胞凋亡，提示DM和 TP对T细胞凋亡的作用不具特异性。另一方面，DM和TP诱 导哮喘CD4、CD8细胞的作用无显著差别，说明二者的作 用具有相似性。但糖皮质激素长期应用可抑制下丘脑垂体肾上腺皮质轴，而雷公藤对该轴无抑制 作用，同时雷公藤与糖皮质激素的药理作用存在互 补性[8]。因此，雷公藤与糖皮质激素交替应用或两者 合用能较好地发挥两药的互补性，减少副作用。对 激素依赖型、激素抵抗型或其他不宜应用激素治疗 的哮喘，雷公藤可能是较好的替代药物之一。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870946)
作者简介：林科雄(1969.5)，男，贵州省织金县人，博 士研究生，主治医师，主要从事哮喘气道炎症的免疫机制方面的研 究，发表论文1篇。电话：(023)68755320
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参考文献
[1]王长征，王春霞，金远林等.哮喘豚鼠IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA表达及雷公藤内酯醇的影响[J].中华微生物和免疫 学杂志，1998，18(2)：145-148.
[2]王长征，王金平，周泽云，等.雷公藤多甙治疗慢性重度哮喘的临床观察[J].实用肺科杂志，1998，5(1)：17-19.
[2]王长征，王金平，周泽云，等.雷公藤多甙治疗慢性重度哮喘的临床观察[J].实用肺科杂志，1998，5(1)：17-19.
[3]Haczku A.T cells and eosinophils in asthma[J].Acta Mic-robiol Immunol Hung,1998,45(1):19-29.
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[6]Jerb K, Le Gros G. The role of Th2 type CD4+ T cells and Th2 type CD8+ T cells in asthma[J]. Immunology Cell Biology,1996,74(2):206-208.
[7]Ying S, Humbert M, Barkas J, et al. Expression of IL-4 and IL-5 mRNA and protein produced by CD4+ and CD8+ T cells,eosinophils, and mast cells in bronchial biopsies obtained from atopic and nonatopic (intrinsic) asthmatics[J]. J Immunol,1997,158(7):3 539-3 544.
[8]胡大伟，刘沛霖.雷公藤与强地松的药理作用的互补性[J].中国中西医结合杂志，1997，170(2):94-96.
收稿日期：1999-09-15；修回日期：1999-12-27, http://www.100md.com