哮喘患者外周血淋巴细胞IL-5、IL-3、GM-CSFmRNA表达
作者：王长征 王春霞 金远林 钱桂生
单位：
关键词：哮喘；慢性支气管炎；细胞因子
第三军医大学学报000209
提要 目的：探讨哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA表达以及与慢性支气管炎患者的差异。方法：选 哮喘患者13例(哮喘组)，平均年龄(31.8±8.5)岁。慢性 支气管炎患者9例(慢支组)，平均年龄(64.8±4.7)岁。健康献血员9例(对照组)，平均年龄(32.8±5.2)岁。抽取 静脉血分离单个核细胞，用斑点印迹杂交法检测IL-5、GM-CSF和 IL-3mRNA的表达。结果：哮喘组PBMCIL-5、GM-CSF和IL-3mRNA表达 的相对含量明显高于慢支组和对照组(P><0.01)，慢支组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结论：哮喘IL-5、GM-CSF和IL-3mRNA表达明显增高，可能在哮喘发病中起重要作用。
, http://www.100md.com
中图法分类号R331.144;R562.25 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0129-03
Expression of IL-5, IL-3 and GM-CSF mRNA in peripheral blood mononuclear
cells from patients with asthma
WANG Chang-zheng, WANG Chun-xia, JIN Yuan-lin, QIAN Gui-sheng
(Department of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037)
, 百拇医药
Abstract Objective: To determine the differences of IL-5, IL-3 and GM-CSF mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) between the patients with asthma and those with chronic bronchitis.Methods: The PBMCs were purified from the venous blood of 13 patients with asthma,9 with chronic bronchitis and 9 healthy individuals. Then the expression of IL-5,IL-3 and GM-CSF mRNA was determined with dot hybridization.Results: The level of IL-5,IL-3 and GM-CSF mRNA expression was significantly higher in patients with asthma than in those with chronic bronchitis and healthy individuals(P<0.01).However,there was no marked difference between the patients with chronic bronchitis and healthy individuals.Conclusion:The pathogenic mechanism of asthma is different from that of chronic bronchitis.IL-5,IL-3 and GM-CSF might contribute to the pathogenesis of asthma.
, 百拇医药
Key words asthma;chronic bronchitis;cytokine
哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,嗜酸性粒细胞(Eosinophil,Eos)是 关键的效应细胞。Eos通过释放碱性颗粒蛋白及炎性介 质损伤气道上皮，导致气道高反应性[1]。而淋巴细胞 则在哮喘发病中起关键的调控作用。T细胞被过敏原 活化后，释放IL-5、IL-3和GM-CSF等前炎症细胞因子调 控哮喘气道炎症的发生和发展。IL-5、IL-3和GM-SF能 促进Eos在骨髓的分化、成熟，使机体的Eos产生增多，延长Eos的存活时间，并促使Eos在 支气管肺组织的聚集和活化。慢性支气管炎患者的 气道组织也存在慢性非特异性炎症。但慢性支气管 炎和哮喘气道炎症的差异并未完全阐明。本文通过 对哮喘和慢性支气管炎患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)IL-5、IL-3和GM-CSFmRNA表达水平的研究，探讨其在哮喘发病中的作用以及与慢性 支气管炎的差异。
, 百拇医药
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 哮喘组 我院门诊及住院哮喘患者13例，男8例， 女5例，平均年龄(31.8±8.5)岁(19～44岁)。均符合支气管哮 喘的诊断标准[2]。其中发作期8例，缓解期5例，1周内 均未使用过全身激素治疗。
1.1.2 慢性支气管炎组(简称慢支组) 我院住院治疗 的慢性支气管炎患者9例，男7例,女2例，平均年龄(64.8± 4.7)岁(60～75岁)。经肺功能检查均有显著的气道阻塞，FEV1<预计值的60%，1周内未用过激素治疗。
1.1.3 健康对照组(对照组) 健康献血员9例，男5例，女4例，平均年龄(32.8±5.2)岁(24～42岁)。均无过敏性疾病及寄生虫感染。
1.2 方法
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1.2.1 外周血单个核细胞的分离抽取受试者外周静脉 血5ml，肝素抗凝。用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。
1.2.2 PBMC总RNA的提取取1ml(细胞浓度106/ml)PBMC用异硫氰酸 胍法提取。
1.3 斑点印迹杂交
1.3.1 材料 ①质粒:含鼠IL-5cDNA的质粒pSP6K-mTRF23由Akira Tominaga教授惠赠。含人IL-3cDNA的质粒由黎伯铨博士惠 赠，构建于pXM。含GM-CSFcDNA的pEMBL8质粒由Metcalf教授惠赠 。②IL-5、IL-3、GM-CSFcDNA探针的制备及标记：质粒 经转化、扩增、碱变性提取,限制性内切酶BamHⅠ分别 酶切含mIL-5和mGM-CSFcDNA的质粒pSP6K-mTRF23和pEMBL8，用XHolⅠ 酶切含hIL-3的质粒pXM后。电洗脱回收目的片段。行32P 随机引物标记，标记方法按Promega公司的随机引物标记 试剂盒说明进行。液体闪烁计数器测量计数均达 107/min。③杂交及检测杂交主要步骤：点膜，80℃烤膜2 h，65℃预杂交20h，65℃杂交16h，洗膜及放射自显影。 薄层扫描仪扫描，以同源的cDNA为标准品参照，计算IL-5、IL-3和GM-CSFmRNA相对含量。
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2 结果
2.1 mIL-5、mGM-CSF、hIL-3cDNA酶切片段的鉴定
2.1.1 mIL-5cDNA酶切片段的鉴定 提取的质粒pSP6K-mTRF23用 限制性内切酶BamHI酶切，用1.0%琼脂糖凝胶分离该片 段，由λDNA/HindⅢMarker标定,纯化后获得约1553bp的鼠IL-5 cDNA片段。
2.1.2 hIL-3cDNA酶切片段鉴定 含hIL-3cDNA片段的质粒用限 制性内切酶XhoI酶切，琼脂糖分离后，由λDNA/HindⅢMarker标定，纯化后获约670bp的人IL-3cDNA片段。
2.1.3 mGM-CSF酶切片段鉴定 含mGM-CSFcDNA片段的质粒用限 制性内切酶BamHI酶切，琼脂糖分离后，由λDNA/HindⅢMarker标定，纯化后获约550bp的鼠GM-CSFcDNA片段。
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2.2 PBMC IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA表达的相对含量
哮喘组明显高于慢支组和对照组(P<0.01)，慢支组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结果见表1。
表1 PBMC IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA表达的相对含量(pg/106)
Tab1 The relative content of IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA expression(pg/106)
Groups
IL-5 mRNA
IL-3 mRNA
, http://www.100md.com GM-CSF mRNA
Control(n=9)
35.4±19.5
22.7±15.8
29.2±18.8
COPD(n=9)
39.8±20.1
33.2±19.5
30.4±16.1
Asthma(n=13)
95.3±31.9△
, http://www.100md.com
121.3±42.2△
47.9±18.6△
△:P<0.01 vs control and COPD
3 讨论
支气管肺组织内有大量的Eos浸润是哮喘的重要病理特征。细胞因子IL-5、GM-CSF和IL-3能促进体内Eos在骨髓的分化成熟,其中IL-5的作用最为重要。IL-5主要作 用于Eos,是调控哮喘Eos性气道炎症的关键因素。Eos是哮 喘气道炎症产生的关键效应细胞，它通过释放大量的碱性蛋白及白三烯等炎症介质参与哮喘发病。GM-CSF和IL-3除作用于Eos外，还作用于嗜碱细胞(肥大细 胞)、中性粒细胞、巨噬细胞等,促进它们的分化、成熟。许多研究证明GM-CSF也与哮喘肺内的Eos增多及 气道高反应性关系密切。然而，IL-3在哮喘发病中的作用仍有争议。在过敏性鼻炎患者的鼻粘膜内，发 现有IL-3mRNA阳性细胞明显增多，且与活化的EG2阳性Eos数 呈显著正相关，从而提示IL-3可能与Eos增多、活化有关[3]。但也有人发现哮喘患者支气管粘膜活检组织中 虽有IL-3蛋白的阳性反应，但IL-3阳性反应似乎与粘 膜组织中的Eos浸润无关[4]。本文结果表明哮喘患者PBMC表 达的IL-5、GM-CSF和IL-3均明显增高，也证实了这3种 前炎症细胞因子在哮喘病人中存在高表达。但IL-3在 哮喘发病机制中的作用仍有待进一步的确定。
, 百拇医药
慢性支气管炎为慢性阻塞性肺疾患，也可表现为喘息等症状，和哮喘有一定的相似性。但其发病机制 以及与哮喘的差异尚未完全阐明。文献报道哮喘支 气管肺组织内以Eos、肥大细胞、淋巴细胞浸润为主。而慢性支气管炎则以中性粒细胞浸润为主[5,6]。两者 体内细胞因子的增多也有差异。哮喘患者是以IL-5、IL-4、GM-CSF等细胞因子水平升高为主。而慢性支气管炎患者以则以IL-8、TNF-α等升高为主[7]。本研究 发现哮喘PBMCIL-5、GM-CSF和IL-3mRNA表达显著高于慢性 支气管炎患者。由于哮喘和慢性支气管炎患者肺内细胞因子表达的差异，也决定了哮喘与慢性支气管 炎炎性细胞浸润的差异和气道炎症发生机制的差异。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470326)
作者简介：王长征(1956.9)，男，河南省内黄县人，博士，副主任医师，副教授，主要从事支气管哮喘发 病机制及临床防治方面的研究，发表论文40余篇。电 话：(023)68755114-74603
, 百拇医药
参考文献
[1]王长征.嗜酸细胞与支气管哮喘[J].中华结核和呼 吸杂志，1998,21(9):562-564.
[2]中华医学会呼吸专业委员会.支气管哮喘的防治指 南[J].中华结核和呼吸杂志，1997,20(5):261-267.
[3] Daniel L H, Donald Y M I, Wood R，et al. Chronic hyperplastic sinusitis: Association of tissue eosinophilia with mRNA expres-sion of GM-CSF and IL-3[J]. J Allergy Clin Immunol, 1993,92(1):39-48.
[4] Coolley K L, Adelroth E, Woolley M J, et al. Interleukin-3 in bronchial biopsies from nonasthmatics and patients with mild and allergen-induced asthma[J]. J Respir Crit Care Med, 1996,153 (1):350-355.
, 百拇医药
[5] Peleman R A, Rytila P H, Kips J C, et al. The cellular com-position of induced sputum in chronic obstructive pulmonary dis-ease[J]. Eur Respir J， 1999,13(4):839-843.
[6] Pesci A, Balbi B, Majori M, et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Eur Respir J， 1998,12(2):380-386.
[7] Keatings V M, Collins P D, Scott D M, et al. Differences in interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonary disease or asthma [J]. Am J Respir Crit Care Med，1996,153(2):530-534.
收稿日期：1999-06-21；修回日期：1999-12-22, http://www.100md.com
单位：
关键词：哮喘；慢性支气管炎；细胞因子
第三军医大学学报000209
提要 目的：探讨哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA表达以及与慢性支气管炎患者的差异。方法：选 哮喘患者13例(哮喘组)，平均年龄(31.8±8.5)岁。慢性 支气管炎患者9例(慢支组)，平均年龄(64.8±4.7)岁。健康献血员9例(对照组)，平均年龄(32.8±5.2)岁。抽取 静脉血分离单个核细胞，用斑点印迹杂交法检测IL-5、GM-CSF和 IL-3mRNA的表达。结果：哮喘组PBMCIL-5、GM-CSF和IL-3mRNA表达 的相对含量明显高于慢支组和对照组(P><0.01)，慢支组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结论：哮喘IL-5、GM-CSF和IL-3mRNA表达明显增高，可能在哮喘发病中起重要作用。
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中图法分类号R331.144;R562.25 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0129-03
Expression of IL-5, IL-3 and GM-CSF mRNA in peripheral blood mononuclear
cells from patients with asthma
WANG Chang-zheng, WANG Chun-xia, JIN Yuan-lin, QIAN Gui-sheng
(Department of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037)
, 百拇医药
Abstract Objective: To determine the differences of IL-5, IL-3 and GM-CSF mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) between the patients with asthma and those with chronic bronchitis.Methods: The PBMCs were purified from the venous blood of 13 patients with asthma,9 with chronic bronchitis and 9 healthy individuals. Then the expression of IL-5,IL-3 and GM-CSF mRNA was determined with dot hybridization.Results: The level of IL-5,IL-3 and GM-CSF mRNA expression was significantly higher in patients with asthma than in those with chronic bronchitis and healthy individuals(P<0.01).However,there was no marked difference between the patients with chronic bronchitis and healthy individuals.Conclusion:The pathogenic mechanism of asthma is different from that of chronic bronchitis.IL-5,IL-3 and GM-CSF might contribute to the pathogenesis of asthma.
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Key words asthma;chronic bronchitis;cytokine
哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,嗜酸性粒细胞(Eosinophil,Eos)是 关键的效应细胞。Eos通过释放碱性颗粒蛋白及炎性介 质损伤气道上皮，导致气道高反应性[1]。而淋巴细胞 则在哮喘发病中起关键的调控作用。T细胞被过敏原 活化后，释放IL-5、IL-3和GM-CSF等前炎症细胞因子调 控哮喘气道炎症的发生和发展。IL-5、IL-3和GM-SF能 促进Eos在骨髓的分化、成熟，使机体的Eos产生增多，延长Eos的存活时间，并促使Eos在 支气管肺组织的聚集和活化。慢性支气管炎患者的 气道组织也存在慢性非特异性炎症。但慢性支气管 炎和哮喘气道炎症的差异并未完全阐明。本文通过 对哮喘和慢性支气管炎患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)IL-5、IL-3和GM-CSFmRNA表达水平的研究，探讨其在哮喘发病中的作用以及与慢性 支气管炎的差异。
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1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 哮喘组 我院门诊及住院哮喘患者13例，男8例， 女5例，平均年龄(31.8±8.5)岁(19～44岁)。均符合支气管哮 喘的诊断标准[2]。其中发作期8例，缓解期5例，1周内 均未使用过全身激素治疗。
1.1.2 慢性支气管炎组(简称慢支组) 我院住院治疗 的慢性支气管炎患者9例，男7例,女2例，平均年龄(64.8± 4.7)岁(60～75岁)。经肺功能检查均有显著的气道阻塞，FEV1<预计值的60%，1周内未用过激素治疗。
1.1.3 健康对照组(对照组) 健康献血员9例，男5例，女4例，平均年龄(32.8±5.2)岁(24～42岁)。均无过敏性疾病及寄生虫感染。
1.2 方法
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1.2.1 外周血单个核细胞的分离抽取受试者外周静脉 血5ml，肝素抗凝。用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。
1.2.2 PBMC总RNA的提取取1ml(细胞浓度106/ml)PBMC用异硫氰酸 胍法提取。
1.3 斑点印迹杂交
1.3.1 材料 ①质粒:含鼠IL-5cDNA的质粒pSP6K-mTRF23由Akira Tominaga教授惠赠。含人IL-3cDNA的质粒由黎伯铨博士惠 赠，构建于pXM。含GM-CSFcDNA的pEMBL8质粒由Metcalf教授惠赠 。②IL-5、IL-3、GM-CSFcDNA探针的制备及标记：质粒 经转化、扩增、碱变性提取,限制性内切酶BamHⅠ分别 酶切含mIL-5和mGM-CSFcDNA的质粒pSP6K-mTRF23和pEMBL8，用XHolⅠ 酶切含hIL-3的质粒pXM后。电洗脱回收目的片段。行32P 随机引物标记，标记方法按Promega公司的随机引物标记 试剂盒说明进行。液体闪烁计数器测量计数均达 107/min。③杂交及检测杂交主要步骤：点膜，80℃烤膜2 h，65℃预杂交20h，65℃杂交16h，洗膜及放射自显影。 薄层扫描仪扫描，以同源的cDNA为标准品参照，计算IL-5、IL-3和GM-CSFmRNA相对含量。
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2 结果
2.1 mIL-5、mGM-CSF、hIL-3cDNA酶切片段的鉴定
2.1.1 mIL-5cDNA酶切片段的鉴定 提取的质粒pSP6K-mTRF23用 限制性内切酶BamHI酶切，用1.0%琼脂糖凝胶分离该片 段，由λDNA/HindⅢMarker标定,纯化后获得约1553bp的鼠IL-5 cDNA片段。
2.1.2 hIL-3cDNA酶切片段鉴定 含hIL-3cDNA片段的质粒用限 制性内切酶XhoI酶切，琼脂糖分离后，由λDNA/HindⅢMarker标定，纯化后获约670bp的人IL-3cDNA片段。
2.1.3 mGM-CSF酶切片段鉴定 含mGM-CSFcDNA片段的质粒用限 制性内切酶BamHI酶切，琼脂糖分离后，由λDNA/HindⅢMarker标定，纯化后获约550bp的鼠GM-CSFcDNA片段。
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2.2 PBMC IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA表达的相对含量
哮喘组明显高于慢支组和对照组(P<0.01)，慢支组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结果见表1。
表1 PBMC IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA表达的相对含量(pg/106)
Tab1 The relative content of IL-5、IL-3、GM-CSF mRNA expression(pg/106)
Groups
IL-5 mRNA
IL-3 mRNA
, http://www.100md.com GM-CSF mRNA
Control(n=9)
35.4±19.5
22.7±15.8
29.2±18.8
COPD(n=9)
39.8±20.1
33.2±19.5
30.4±16.1
Asthma(n=13)
95.3±31.9△
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121.3±42.2△
47.9±18.6△
△:P<0.01 vs control and COPD
3 讨论
支气管肺组织内有大量的Eos浸润是哮喘的重要病理特征。细胞因子IL-5、GM-CSF和IL-3能促进体内Eos在骨髓的分化成熟,其中IL-5的作用最为重要。IL-5主要作 用于Eos,是调控哮喘Eos性气道炎症的关键因素。Eos是哮 喘气道炎症产生的关键效应细胞，它通过释放大量的碱性蛋白及白三烯等炎症介质参与哮喘发病。GM-CSF和IL-3除作用于Eos外，还作用于嗜碱细胞(肥大细 胞)、中性粒细胞、巨噬细胞等,促进它们的分化、成熟。许多研究证明GM-CSF也与哮喘肺内的Eos增多及 气道高反应性关系密切。然而，IL-3在哮喘发病中的作用仍有争议。在过敏性鼻炎患者的鼻粘膜内，发 现有IL-3mRNA阳性细胞明显增多，且与活化的EG2阳性Eos数 呈显著正相关，从而提示IL-3可能与Eos增多、活化有关[3]。但也有人发现哮喘患者支气管粘膜活检组织中 虽有IL-3蛋白的阳性反应，但IL-3阳性反应似乎与粘 膜组织中的Eos浸润无关[4]。本文结果表明哮喘患者PBMC表 达的IL-5、GM-CSF和IL-3均明显增高，也证实了这3种 前炎症细胞因子在哮喘病人中存在高表达。但IL-3在 哮喘发病机制中的作用仍有待进一步的确定。
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慢性支气管炎为慢性阻塞性肺疾患，也可表现为喘息等症状，和哮喘有一定的相似性。但其发病机制 以及与哮喘的差异尚未完全阐明。文献报道哮喘支 气管肺组织内以Eos、肥大细胞、淋巴细胞浸润为主。而慢性支气管炎则以中性粒细胞浸润为主[5,6]。两者 体内细胞因子的增多也有差异。哮喘患者是以IL-5、IL-4、GM-CSF等细胞因子水平升高为主。而慢性支气管炎患者以则以IL-8、TNF-α等升高为主[7]。本研究 发现哮喘PBMCIL-5、GM-CSF和IL-3mRNA表达显著高于慢性 支气管炎患者。由于哮喘和慢性支气管炎患者肺内细胞因子表达的差异，也决定了哮喘与慢性支气管 炎炎性细胞浸润的差异和气道炎症发生机制的差异。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470326)
作者简介：王长征(1956.9)，男，河南省内黄县人，博士，副主任医师，副教授，主要从事支气管哮喘发 病机制及临床防治方面的研究，发表论文40余篇。电 话：(023)68755114-74603
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参考文献
[1]王长征.嗜酸细胞与支气管哮喘[J].中华结核和呼 吸杂志，1998,21(9):562-564.
[2]中华医学会呼吸专业委员会.支气管哮喘的防治指 南[J].中华结核和呼吸杂志，1997,20(5):261-267.
[3] Daniel L H, Donald Y M I, Wood R，et al. Chronic hyperplastic sinusitis: Association of tissue eosinophilia with mRNA expres-sion of GM-CSF and IL-3[J]. J Allergy Clin Immunol, 1993,92(1):39-48.
[4] Coolley K L, Adelroth E, Woolley M J, et al. Interleukin-3 in bronchial biopsies from nonasthmatics and patients with mild and allergen-induced asthma[J]. J Respir Crit Care Med, 1996,153 (1):350-355.
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[5] Peleman R A, Rytila P H, Kips J C, et al. The cellular com-position of induced sputum in chronic obstructive pulmonary dis-ease[J]. Eur Respir J， 1999,13(4):839-843.
[6] Pesci A, Balbi B, Majori M, et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Eur Respir J， 1998,12(2):380-386.
[7] Keatings V M, Collins P D, Scott D M, et al. Differences in interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonary disease or asthma [J]. Am J Respir Crit Care Med，1996,153(2):530-534.
收稿日期：1999-06-21；修回日期：1999-12-22, http://www.100md.com