高亲和力IgE受体α链cDNA的克隆及序列测定
作者：孙仁山 胡川闽 刘荣卿 王延江 胡厚祥
单位：孙仁山(第三军医大学附属西南医院皮肤科)；胡川闽(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆400038)；刘荣卿(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆400038)；王延江(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆400038)；胡厚祥(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所心血管内科，重庆400042)
关键词：高亲和力IgE受体；α链；分子克隆
第三军医大学学报000207
提要 目的：为获得编码高亲和力IgE受体(FcεR1)α链的 cDNA序列。方法：从正常人外周血中富集嗜碱性粒细 胞，提总RNA进行RT-PCR，分子克隆，用自动测序及放 射自显影测序。结果：分离并鉴定了该cDNA重组子，在159密码子及185密码子分别发现了CAC→CGC与TAT→CAT置换 。结论：建立了一个编码FcεR1膜外区α链的cDNA重组子 克隆，它不含引导肽序列，可能是一个来自中国人 的该基因的变异体。
, http://www.100md.com
中图法分类号R392.13;R394-3 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0123-03
Molecular cloning and sequencing of alpha chain cDNA of high affinity IgE receptors from Chinese people
SUN Ren-shan, HU Chuan-min, LIU Rong-qing, WANG Yan-jiang, HU Hou-xiang
(Department of Dermatology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
, 百拇医药
Abstract Objective: To obtain the cDNA sequence encoding the alpha subunit of high affinity IgE receptors. Methods: Basophils were enriched in Chinese person. After the total RNA was extracted, RT-PCR and cloning were carried out. The sequence was determined with automated DNA sequencing and autoradiography. Results: The cDNA recombinant was sequenced and characterized. It had two transitions at codon 159 CAC→ CGC and 185 TAT→ CAT. Conclusion: One recombinant was constructed. It contains the cDNA sequence encoding for the extracellular domain of the alpha subunit without the leading peptide sequence. Therefore, it may be a variant from Chinese people.→ CGC and 185 TAT→ CAT. Conclusion: One recombinant was constructed. It contains the cDNA sequence encoding for the extracellular domain of the alpha subunit without the leading peptide sequence. Therefore, it may be a variant from Chinese people.
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Key words high affinity IgE receptor; alpha chain; molecular cloning
高亲和力IgE受体(FcεR1)，主要表达于肥大细胞及嗜碱性粒细胞表面，与过敏性炎症形成密切相关。近年发现嗜酸粒细胞、郎罕氏细胞及单核细胞也可表 达这种受体，参与抗寄生虫感染、抗原提呈等病理 生理活动。最近有报道[1]，抗FcεR1自身抗体可以激活肥大细胞和嗜碱粒细胞参与部分慢性荨麻疹的发生。FcεR1是一种异四聚体结构，由1条α链、1条β链、2条γ链构成，α链是IgE的结合部位。人α链cDNA最初由国 外学者克隆成功[2]，而中国人该基因的结构尚未见报 道。为了深入研究FcεR1α链的结构与功能以及其相关 细胞的激活机制，本文以RT-PCR方法首次克隆了中国 汉族人FcεR1膜外区α链cDNA，并进行了测序及序列分析。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 细菌菌株和质粒载体
大肠杆菌JM109为本室保存菌种，pUC19质粒购自华美生 物工程公司。
1.2 工具酶及其它试剂
DNA限制性内切酶HindⅢ、BamⅠ及AMV反转录酶均购自华 美生物工程公司；T7DNA测序试剂盒购自Promega公司；32P-dATP为北京亚辉公司产品；T7启动子测序引物5′-ATTATGCTGAGTGATATCCCGCT-3′由中科院上海细胞所合成。质 粒快速抽提试剂盒为宝灵曼公司产品。
1.3 嗜碱性粒细胞的富集[3]
选取1名健康献血员，该献血员无家族性遗传病史 ，从其肘静脉采肝素抗凝血10ml与等体积pH7.6Hepes-ACM缓 冲液混合，平铺于10mlFicoll-Hypague(密度1.085)的上面，离 心20min，取中间层细胞，加入上述缓冲液40ml，再次离 心15min，弃上清，制备成富含嗜碱性粒细胞的悬液。
, 百拇医药
1.4 总DNA提取及cDNA第一链合成
上述细胞沉淀物，加入500μl变性液，1.6μlβ-巯基 乙醇，充分混匀，然后酚氯仿抽提，该步骤所有的 实验用品均事先进行去RNase处理。反转录按下述体系 进行，MgCl2(25mmol/L)4μl，10×buffer2μl,10mmol/L4×dNTP2μl,总RNA 2μl(2mg)，olig(dT)152μl,H2O6.5μl混匀，68°C变性5min，室温 放置15min后，再加入RNasin(40U/μl)0.5μl，AMV反转录酶(50U/μ l)1μl,42°C水浴1h，95°C变性5min，置-20°备用。
1.5 PCR引物设计及目的片段的扩增
按照引物设计原则，根据人α链cDNA序列，拟扩增膜 外区α链不含信号肽的cDNA序列(αt)，设计引物并经计 算机辅助检索符合要求，由上海Sangong公司合成。引物 序列如下：
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P1，5′-ctaagcttgtccctcagaaacctaagg-3′(划线处为HindⅢ酶切点 )
P2,5′-tcggatcctcattatagccagtac-3′(划线处为BamHI酶切点)
以上步骤反转录产物为模板进行PCR扩增。循环参数 为94°C60s，55°C90s，72°C60s，35个循环后72°C延伸30min。2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
1.6 重组质粒构建
PCR扩增的目的片段经HindⅢ/BamHI酶切后，用“V”型槽 回收，然后与相应粘性末端的pUC19进行连接反应。
1.7 连接产物的转化及重组子的筛选和鉴定
取5μl连接产物转化受体菌JM109的感受态细胞，挑取 具有氨苄青霉素(AP)抗性的菌落于5ml含AP的LB培养基中 ，37°C振摇过夜培养。碱裂解法小量快速提取质粒DNA进 行双酶切鉴定。
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1.8 DNA序列测定
自动测序由北京中科院病毒所进行。手工测序按双 脱氧链终止法测序试剂盒说明书进行。简述如下：用质粒抽提试剂盒提取经双酶切鉴定的重组克隆质 粒，用NaOH进行模板变性，而后加入测序引物进行退 火反应，再用32P-dATP标记，最后是终止反应。样品于 80°C变性30min后，以40W电泳3h，最后进行揭胶干胶及放 射自显影。
2 结果
2.1 PCR扩增α链cDNA片段
用自行设计的引物进行PCR扩增，产物经2%的琼脂糖 凝胶电泳，发现主条带的分子量大小与我们的预计 值一致，约为559bp，见图1。
图1 PCR产物及重组子鉴定
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Fig1 Identification of the PCR product and the recombinant
1：PCR Markers；2：λ DNA/Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ；3：pUC19/αt digested by Hind Ⅲ and BamH Ⅰ；4：PCR products
2.2 重组质粒的构建与鉴定
PCR产物酶切纯化后，克隆至pUC19质粒，命名为pUC19/αt。 PUC19/αt经HindⅢ/BamHI酶切后，从电泳图谱上可看到两条 带，一条为2.7kb的pUC19载体，另一条与PCR产物的主条带 迁移距离一致，约为559bp，见图1。
2.3 DNA序列测定
为了得到正确的cDNA序列，自动测序从正反两个方向 进行，同时进行了手工放射自显影测序。结果与基 因库中的碱基序列对比，发现159位密码子由CAC置换成 了CGC，185位密码子由TAT置换成了CAT，见图2、3。
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图2 αtcDNA的自动测序
Fig2 Automation sequencing of αt cDNA
Upper:Codon 159 CAC→CGC transition；Lower:Codon 185 TAT→CAT transition
图3 αt cDNA的手工测序
Fig3 Manual sequencing of αt cDNA
Left:Codon 159 GTG→GCG(ie,CAC→CGC as to the complementary strand)transition；Right:Codon 185 ATA→GTA(ie,TAT→CAT as to the complementary strand)transition
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3 讨论
FcεR1是介导过敏等炎症反应的重要受体，FcεR1的功 能主要是由结合于该受体上的IgE交联所启动，近年研究[4，5]表明，部分慢性荨麻疹患者血清内含抗FcεR1自 身抗体，抗FcεR1的抗体与膜受体结合后，可以直接 活化效应细胞。FcεR1膜外区α链cDNA的克隆成功，为制 备探针研究其体外和体内的表达及功能，探讨过敏 性疾病的发生机制及应用于疾病的诊断打下了基础 。RT-PCR能否成功的关键因素之一为模板RNA的丰度， 本实验的模板RNA为FcεR1α链mRNA，FcεR1主要表达于肥大 细胞与嗜碱粒细胞表面，本实验曾采用分离纯化正 常皮肤中肥大细胞的方法，但因步骤繁琐获得量低 ，而未再采用这种方法。尽管采用外周血富集嗜碱 粒细胞，最后的富集嗜碱粒细胞溶液中，含有其它 的白细胞，但该方法简单、可靠，且其它细胞的掺入并不干扰目的mRNA丰度，最后实验的成功证明了该 方法的可行性。本实验的PCR循环参数经过3次变动， 这3次变动主要是退火温度的变化，退火温度越高， 模板与引物结合的特异性越强，愈容易扩增出特异 的目的片段，但温度太高，有可能使引物与模板不 退火。我们的实验证明上述理论的正确性，第一次 我们用50°C的退火温度，几乎没有任何产物；当退火 温度提高至55°C时，PCR产物为Smear；当提高温度至61°C时 ，才产生出清晰的目的条带。
, 百拇医药
在手工放射自显影测序中，模板DNA要求纯度高，断 裂少。为保证模板DNA纯度，一般需对提取的双链DNA以 聚乙二醇沉淀法或氯化铯梯度离心法进行纯化，或 从琼脂糖凝胶中回收双螺旋DNA，以避免开环和线状DNA的 污染。本实验利用质粒抽提试剂盒提出质粒DNA，能够 满足测序反应的需要，步骤简单、节省时间且效果 良好。实验表明，本实验的测序反应可较好地读出 300个核苷酸序列。在实验中，数次测序反应表明，αtcDNA对比Kochan [2]报道的cDNA序列存在密码子159位的CAC→CGC置换；密码子185位的TAT→CAT的置换。所以我们认为，本实验所获得的αtcDNA序列可能为来自于该基因在中国 人群中的变异体或基因亚型(Variant)，其生物学意义尚 待进一步探讨。
作者简介：孙仁山(1964.10)，男，河南省博爱县人，博士，主治医师，讲师，主要从事高亲和力IgE受体的 克隆与表达方面的研究，发表论文5篇。电话：(023)68752278
, 百拇医药
参考文献
[1] Sabroe R A, Greaves M W. The pathogenesis of chronic idiopat-hic urticaria [J]. Arch Dermatol,1997,133(8):1 003-1 008.
[2] Kochan J, Pettine L F, Hakimi J, et al. Isolation of the gene coding for the alpha subunit of the human high affinity IgE receptor [J]. Nucleic Acids Res,1988,16(8):3 584-3 588.
[3] 顾明亮，张学智.真菌过敏性哮喘患者嗜碱性粒细胞释放能力和总IgE的观察 [J].山东医科大学学报，1996，34(4)：322-323.
, http://www.100md.com
[4] Ferrer M, Kinet J, Kaplan A P, et al. Comparative studies of functional and binding assays for IgG anti-Fc ε R1 α (α-subuntit) in chronic urticaria [J]. J Allergy clin Immunol,1998,101(5): 672-676.
[5] Tong L, Balakrishnan G, Kochan J P, et al. Assessment of au-toimmunity in patients with chronic urticaria [J]. J Allergy Clin Immunol,1997,99(4):461-465.
收稿日期：1999-08-26；修回日期：1999-12-22, 百拇医药
单位：孙仁山(第三军医大学附属西南医院皮肤科)；胡川闽(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆400038)；刘荣卿(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆400038)；王延江(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆400038)；胡厚祥(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所心血管内科，重庆400042)
关键词：高亲和力IgE受体；α链；分子克隆
第三军医大学学报000207
提要 目的：为获得编码高亲和力IgE受体(FcεR1)α链的 cDNA序列。方法：从正常人外周血中富集嗜碱性粒细 胞，提总RNA进行RT-PCR，分子克隆，用自动测序及放 射自显影测序。结果：分离并鉴定了该cDNA重组子，在159密码子及185密码子分别发现了CAC→CGC与TAT→CAT置换 。结论：建立了一个编码FcεR1膜外区α链的cDNA重组子 克隆，它不含引导肽序列，可能是一个来自中国人 的该基因的变异体。
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中图法分类号R392.13;R394-3 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0123-03
Molecular cloning and sequencing of alpha chain cDNA of high affinity IgE receptors from Chinese people
SUN Ren-shan, HU Chuan-min, LIU Rong-qing, WANG Yan-jiang, HU Hou-xiang
(Department of Dermatology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
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Abstract Objective: To obtain the cDNA sequence encoding the alpha subunit of high affinity IgE receptors. Methods: Basophils were enriched in Chinese person. After the total RNA was extracted, RT-PCR and cloning were carried out. The sequence was determined with automated DNA sequencing and autoradiography. Results: The cDNA recombinant was sequenced and characterized. It had two transitions at codon 159 CAC→ CGC and 185 TAT→ CAT. Conclusion: One recombinant was constructed. It contains the cDNA sequence encoding for the extracellular domain of the alpha subunit without the leading peptide sequence. Therefore, it may be a variant from Chinese people.→ CGC and 185 TAT→ CAT. Conclusion: One recombinant was constructed. It contains the cDNA sequence encoding for the extracellular domain of the alpha subunit without the leading peptide sequence. Therefore, it may be a variant from Chinese people.
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Key words high affinity IgE receptor; alpha chain; molecular cloning
高亲和力IgE受体(FcεR1)，主要表达于肥大细胞及嗜碱性粒细胞表面，与过敏性炎症形成密切相关。近年发现嗜酸粒细胞、郎罕氏细胞及单核细胞也可表 达这种受体，参与抗寄生虫感染、抗原提呈等病理 生理活动。最近有报道[1]，抗FcεR1自身抗体可以激活肥大细胞和嗜碱粒细胞参与部分慢性荨麻疹的发生。FcεR1是一种异四聚体结构，由1条α链、1条β链、2条γ链构成，α链是IgE的结合部位。人α链cDNA最初由国 外学者克隆成功[2]，而中国人该基因的结构尚未见报 道。为了深入研究FcεR1α链的结构与功能以及其相关 细胞的激活机制，本文以RT-PCR方法首次克隆了中国 汉族人FcεR1膜外区α链cDNA，并进行了测序及序列分析。
1 材料与方法
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1.1 细菌菌株和质粒载体
大肠杆菌JM109为本室保存菌种，pUC19质粒购自华美生 物工程公司。
1.2 工具酶及其它试剂
DNA限制性内切酶HindⅢ、BamⅠ及AMV反转录酶均购自华 美生物工程公司；T7DNA测序试剂盒购自Promega公司；32P-dATP为北京亚辉公司产品；T7启动子测序引物5′-ATTATGCTGAGTGATATCCCGCT-3′由中科院上海细胞所合成。质 粒快速抽提试剂盒为宝灵曼公司产品。
1.3 嗜碱性粒细胞的富集[3]
选取1名健康献血员，该献血员无家族性遗传病史 ，从其肘静脉采肝素抗凝血10ml与等体积pH7.6Hepes-ACM缓 冲液混合，平铺于10mlFicoll-Hypague(密度1.085)的上面，离 心20min，取中间层细胞，加入上述缓冲液40ml，再次离 心15min，弃上清，制备成富含嗜碱性粒细胞的悬液。
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1.4 总DNA提取及cDNA第一链合成
上述细胞沉淀物，加入500μl变性液，1.6μlβ-巯基 乙醇，充分混匀，然后酚氯仿抽提，该步骤所有的 实验用品均事先进行去RNase处理。反转录按下述体系 进行，MgCl2(25mmol/L)4μl，10×buffer2μl,10mmol/L4×dNTP2μl,总RNA 2μl(2mg)，olig(dT)152μl,H2O6.5μl混匀，68°C变性5min，室温 放置15min后，再加入RNasin(40U/μl)0.5μl，AMV反转录酶(50U/μ l)1μl,42°C水浴1h，95°C变性5min，置-20°备用。
1.5 PCR引物设计及目的片段的扩增
按照引物设计原则，根据人α链cDNA序列，拟扩增膜 外区α链不含信号肽的cDNA序列(αt)，设计引物并经计 算机辅助检索符合要求，由上海Sangong公司合成。引物 序列如下：
, http://www.100md.com
P1，5′-ctaagcttgtccctcagaaacctaagg-3′(划线处为HindⅢ酶切点 )
P2,5′-tcggatcctcattatagccagtac-3′(划线处为BamHI酶切点)
以上步骤反转录产物为模板进行PCR扩增。循环参数 为94°C60s，55°C90s，72°C60s，35个循环后72°C延伸30min。2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
1.6 重组质粒构建
PCR扩增的目的片段经HindⅢ/BamHI酶切后，用“V”型槽 回收，然后与相应粘性末端的pUC19进行连接反应。
1.7 连接产物的转化及重组子的筛选和鉴定
取5μl连接产物转化受体菌JM109的感受态细胞，挑取 具有氨苄青霉素(AP)抗性的菌落于5ml含AP的LB培养基中 ，37°C振摇过夜培养。碱裂解法小量快速提取质粒DNA进 行双酶切鉴定。
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1.8 DNA序列测定
自动测序由北京中科院病毒所进行。手工测序按双 脱氧链终止法测序试剂盒说明书进行。简述如下：用质粒抽提试剂盒提取经双酶切鉴定的重组克隆质 粒，用NaOH进行模板变性，而后加入测序引物进行退 火反应，再用32P-dATP标记，最后是终止反应。样品于 80°C变性30min后，以40W电泳3h，最后进行揭胶干胶及放 射自显影。
2 结果
2.1 PCR扩增α链cDNA片段
用自行设计的引物进行PCR扩增，产物经2%的琼脂糖 凝胶电泳，发现主条带的分子量大小与我们的预计 值一致，约为559bp，见图1。
图1 PCR产物及重组子鉴定
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Fig1 Identification of the PCR product and the recombinant
1：PCR Markers；2：λ DNA/Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ；3：pUC19/αt digested by Hind Ⅲ and BamH Ⅰ；4：PCR products
2.2 重组质粒的构建与鉴定
PCR产物酶切纯化后，克隆至pUC19质粒，命名为pUC19/αt。 PUC19/αt经HindⅢ/BamHI酶切后，从电泳图谱上可看到两条 带，一条为2.7kb的pUC19载体，另一条与PCR产物的主条带 迁移距离一致，约为559bp，见图1。
2.3 DNA序列测定
为了得到正确的cDNA序列，自动测序从正反两个方向 进行，同时进行了手工放射自显影测序。结果与基 因库中的碱基序列对比，发现159位密码子由CAC置换成 了CGC，185位密码子由TAT置换成了CAT，见图2、3。
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图2 αtcDNA的自动测序
Fig2 Automation sequencing of αt cDNA
Upper:Codon 159 CAC→CGC transition；Lower:Codon 185 TAT→CAT transition
图3 αt cDNA的手工测序
Fig3 Manual sequencing of αt cDNA
Left:Codon 159 GTG→GCG(ie,CAC→CGC as to the complementary strand)transition；Right:Codon 185 ATA→GTA(ie,TAT→CAT as to the complementary strand)transition
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3 讨论
FcεR1是介导过敏等炎症反应的重要受体，FcεR1的功 能主要是由结合于该受体上的IgE交联所启动，近年研究[4，5]表明，部分慢性荨麻疹患者血清内含抗FcεR1自 身抗体，抗FcεR1的抗体与膜受体结合后，可以直接 活化效应细胞。FcεR1膜外区α链cDNA的克隆成功，为制 备探针研究其体外和体内的表达及功能，探讨过敏 性疾病的发生机制及应用于疾病的诊断打下了基础 。RT-PCR能否成功的关键因素之一为模板RNA的丰度， 本实验的模板RNA为FcεR1α链mRNA，FcεR1主要表达于肥大 细胞与嗜碱粒细胞表面，本实验曾采用分离纯化正 常皮肤中肥大细胞的方法，但因步骤繁琐获得量低 ，而未再采用这种方法。尽管采用外周血富集嗜碱 粒细胞，最后的富集嗜碱粒细胞溶液中，含有其它 的白细胞，但该方法简单、可靠，且其它细胞的掺入并不干扰目的mRNA丰度，最后实验的成功证明了该 方法的可行性。本实验的PCR循环参数经过3次变动， 这3次变动主要是退火温度的变化，退火温度越高， 模板与引物结合的特异性越强，愈容易扩增出特异 的目的片段，但温度太高，有可能使引物与模板不 退火。我们的实验证明上述理论的正确性，第一次 我们用50°C的退火温度，几乎没有任何产物；当退火 温度提高至55°C时，PCR产物为Smear；当提高温度至61°C时 ，才产生出清晰的目的条带。
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在手工放射自显影测序中，模板DNA要求纯度高，断 裂少。为保证模板DNA纯度，一般需对提取的双链DNA以 聚乙二醇沉淀法或氯化铯梯度离心法进行纯化，或 从琼脂糖凝胶中回收双螺旋DNA，以避免开环和线状DNA的 污染。本实验利用质粒抽提试剂盒提出质粒DNA，能够 满足测序反应的需要，步骤简单、节省时间且效果 良好。实验表明，本实验的测序反应可较好地读出 300个核苷酸序列。在实验中，数次测序反应表明，αtcDNA对比Kochan [2]报道的cDNA序列存在密码子159位的CAC→CGC置换；密码子185位的TAT→CAT的置换。所以我们认为，本实验所获得的αtcDNA序列可能为来自于该基因在中国 人群中的变异体或基因亚型(Variant)，其生物学意义尚 待进一步探讨。
作者简介：孙仁山(1964.10)，男，河南省博爱县人，博士，主治医师，讲师，主要从事高亲和力IgE受体的 克隆与表达方面的研究，发表论文5篇。电话：(023)68752278
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参考文献
[1] Sabroe R A, Greaves M W. The pathogenesis of chronic idiopat-hic urticaria [J]. Arch Dermatol,1997,133(8):1 003-1 008.
[2] Kochan J, Pettine L F, Hakimi J, et al. Isolation of the gene coding for the alpha subunit of the human high affinity IgE receptor [J]. Nucleic Acids Res,1988,16(8):3 584-3 588.
[3] 顾明亮，张学智.真菌过敏性哮喘患者嗜碱性粒细胞释放能力和总IgE的观察 [J].山东医科大学学报，1996，34(4)：322-323.
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[4] Ferrer M, Kinet J, Kaplan A P, et al. Comparative studies of functional and binding assays for IgG anti-Fc ε R1 α (α-subuntit) in chronic urticaria [J]. J Allergy clin Immunol,1998,101(5): 672-676.
[5] Tong L, Balakrishnan G, Kochan J P, et al. Assessment of au-toimmunity in patients with chronic urticaria [J]. J Allergy Clin Immunol,1997,99(4):461-465.
收稿日期：1999-08-26；修回日期：1999-12-22, 百拇医药