GPPCR-RDB法对HPV感染的快速基因诊断
作者：郭华阳 汪江华 周来新 叶治家 陈安
单位：郭华阳(第三军医大学：医学检验系临床生物化学教研室)；汪江华(第三军医大学：医学检验系临床生物化学教研室)；周来新(第三军医大学：医学检验系临床生物化学教研室)；叶治家(第三军医大学：基础医学部生物化学与分子生物学教研室；重庆400038)；陈安(第三军医大学：医学检验系临床生物化学教研室)
关键词：聚合酶链反应；反向斑点杂交；人乳头瘤病 毒；亚临床感染；基因诊断
第三军医大学学报000229
提要 目的：对人乳头瘤病毒(HPV)感染进行快速的基 因诊断。方法：采用通用引物介导的聚合酶链反应 (GPPCR)扩增皮损组织DNA，并同时将扩增产物标记上地高辛配基，再结合扩增产物的非放射性反向斑点杂交 技术，对HPV亚临床感染和假性湿疣进行了快速的基因分型诊断及鉴别诊断。结果：14例亚临床感染中HPV6阳 性12例，HPV11阳性4例，HPV16阳性4例，HPV18未检测出，所用 探针以外型别1例，混合感染5例；11例假性湿疣中仅 有1例为HPV16阳性。结论：该方法对HPV感染特别是亚临 床感染和隐性感染的基因诊断是快速敏感特异的，值得推广应用。
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中图法分类号R394-3；R737.33 文献标识码B
文章编号：1000-5404(2000)02-0194-02
Establishment of GPPCR-RDB method for rapid genetic diagnosis of HPV infection
人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)有100多种型别，在人类广泛传播，其感染可致皮肤疣(特别是尖锐湿疣)和 皮肤粘膜癌(特别是宫颈癌)等。尖锐湿疣(CA)的亚临床 感染(SPI)与假性湿疣在临床上有时难以鉴别，前者是CA复发的重要原因[1]，确诊者必须接受治疗，后者则 不然，可以不予治疗，因而临床上必须对它们早期 诊断和鉴别诊断。通常的方法诊断率较低，特异性 也欠佳，因而有赖于基因诊断技术对病原体HPV进行检 测作出病因诊断。单一的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)或分子杂交技术在临床上应用总存在一些不 足[2]，本文探索建立一种快速敏感特异且实用的改良 方法。
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1 材料与方法
1.1 标本收集及处理
门诊患者25例，其中经醋酸白试验证实为SPI的14例， 含11例典型CA皮损周围的SPI(典型CA皮损经激光烧灼清除 ，SPI未清除)及3例单纯SPI；经醋酸白试验阴性的假性 湿疣患者11例。活检皮损一部分作病理组织学检查， 另一部分液氮贮存备用。所有病例均随访半年，14例 SPI均于3个月内出现典型皮损(复发)，复发标准参见文 献[1]，11例假性湿疣10例皮损无变化，1例出现典型CA皮 损(女性，3个月时)。
1.2 主要材料和仪器
HPVL1通用引物和HPV6、11、16、18型特异性寡核苷酸(SSO)探针[3]由中科院上海细胞所合成。HPV11重组质粒由德国 海登保癌症研究中心赠。地高辛检测试剂盒、dNTP(含 Dig-dUTP)和蛋白酶K为德国宝灵曼公司产品。PCR扩增试 剂盒为复旦大学产品。硝酸纤维素膜为Promega公司产品 。PCR仪为美国产品(DB80230)。
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1.3 模板DNA制备
组织剪碎后加SDS和蛋白酶K37℃消化，饱和酚及氯仿-异戊醇抽提，无水乙醇沉淀。沉淀溶于0.1×SSC，加 RNaseA42℃消化。同上抽提沉淀，离心弃上清，干燥沉 淀，适量的双蒸水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳观察 ，4℃保存。
1.4通用引物介导的聚合酶链反应(GPPCR)
PCR反应总体积为50μl，含5×PCR缓冲液5μl，模板DNA适 量，dATP、dGTP和dCTP各1mmol/L，dTTP0.65mmol/L，Dig-dUTP0.35mmol/L, 50pmol的L1通用引物一对，去离子水适量，混匀，95℃变 性后加Taq酶2U，混匀后覆石蜡油30μl，在PCR仪上按93℃ 30s，52℃1min,72℃1min循环30个周期，最后72℃延伸10min。 取出10μl扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，观察特 异性带。同时设有方法对照和HPV11质粒的阳性对照及 正常包皮组织DNA的阴性对照。
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1.5 反向斑点杂交(RDB)
将HPV6、11、16、18SSO探针通过碳二亚胺的介导固定在 硝酸纤维膜上，形成4个点。按文献[4]进行预杂交30min， 然后取经氯仿抽提的PCR扩增产物分别与已固定的SSO探 针进行杂交约1h，漂洗后籍PCR产物上携带的Dig标记物 进行碱性磷酸酶显色。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
14例SPI组织DNA以GPPCR扩增后，扩增产物均为约450bp的电 泳带；11例假性湿疣组织DNA扩增后仅有1例出现了约450 bp的电泳带。方法对照和正常包皮组织DNA扩增后均未 出现特异性电泳带。其中2例扩增结果见图1。
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图1 2例PCR扩增产物电泳图谱(1.5%琼脂糖凝胶)
1、2：2例扩增产物；3：阳性对照；4：阴性对照；5： pBR328DNA/BamHI,pBR328DNA/BglI,pBR328DNA/HinfI
2.2 RDB结果
15例阳性扩增产物与HPV6、11、16、18型SSO探针反向斑点 杂交后，HPV6阳性12例，占80.0%，HPV11阳性4例，占26.7% ，HPV16阳性4例，占26.7%，HPV18型全部阴性，所用探针以 外型别1例；其中HPV6/11混合感染3例，HPV6/11/16混合感染1例 ，HPV6/16混合感染1例。1例假性湿疣组织DNA的PCR扩增产物 经RDB后为HPV16阳性。其中6例RDB的结果见图2。
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图2 6例RDB结果
a.b.c：分别为HPV6、HPV11和HPV16阳性；d：HPV阴性；e：HPV6、11阳性；f：HPV6、11、16阳性
3 讨论
本研究采用GPPCR-RDB法对SPI和假性湿疣进行了快速的 基因诊断和鉴别诊断，并对HPV进行了分型。在25例患 者中，14例SPI经检测均存在有HPVDNA，11例假性湿疣中仅 有1例检测出了HPV16DNA。在随访中，14例SPI均在3个月内出 现典型的CA皮损(3例单纯SPI)或复发(11例典型CA皮损周围 的SPI)，说明SPI未治疗是临床上CA复发的重要原因，提 示临床上应扩大治疗范围。1例女性假性湿疣患者中 也检测出了HPVDNA，随访3个月时出现了典型的CA皮损， 因此其假性湿疣的临床诊断是否成立值得考虑，也 许是合并有隐性感染。对于所有检测出HPV16DNA的病例 因有癌变的可能，应长期随访。
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该方法在PCR扩增时将地高辛配基标记在扩增产物上 ，避免了再次标记；RDB时可检测出4种(本研究中)或多 种HPV型别(固定上多种型别SSO探针)，克服了设计若干 对引物的扩增方法或通用引物扩增后斑点杂交的方 法存在的成本高和标本量无法满足要求等不足。如 果模板DNA的制备改为快速裂解法或直接采用拭子浸泡 后裂解制备DNA法，就可以缩短检测时间，半天左右可 得出结果，更便于推广应用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600175)
作者简介：郭华阳(1966.4)，男，湖北省英山市人，硕 士，主治医师，讲师。
参考文献
[1]郭华阳，李文维，赵莉蓉.激光治疗后CA复发情况 调查及原因探讨[J].第三军医大学学报，1995，17(4)：361- 362.
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[2]郭华阳，汪江华，周来新，等.HPV隐性感染的两种 基因诊断方法比较研究[J].中华医学检验杂志，1997， 20(3)：181-182.
[3]朱平.PCR基因扩增实验操作手册[M].北京：中国科学 技术出版社，1992.426-428.
[4]SaikiRK,WalshPS,LevensonCH,etal.GeneticanalysisofamplifiedDNAwith immobilizedsequence-specificoligonucleotideprobes[J].ProcNatlAcadSciUSA, 1989,86(16):6230-6234.
收稿日期：1998-09-16；修回日期：1999-03-03, 百拇医药
单位：郭华阳(第三军医大学：医学检验系临床生物化学教研室)；汪江华(第三军医大学：医学检验系临床生物化学教研室)；周来新(第三军医大学：医学检验系临床生物化学教研室)；叶治家(第三军医大学：基础医学部生物化学与分子生物学教研室；重庆400038)；陈安(第三军医大学：医学检验系临床生物化学教研室)
关键词：聚合酶链反应；反向斑点杂交；人乳头瘤病 毒；亚临床感染；基因诊断
第三军医大学学报000229
提要 目的：对人乳头瘤病毒(HPV)感染进行快速的基 因诊断。方法：采用通用引物介导的聚合酶链反应 (GPPCR)扩增皮损组织DNA，并同时将扩增产物标记上地高辛配基，再结合扩增产物的非放射性反向斑点杂交 技术，对HPV亚临床感染和假性湿疣进行了快速的基因分型诊断及鉴别诊断。结果：14例亚临床感染中HPV6阳 性12例，HPV11阳性4例，HPV16阳性4例，HPV18未检测出，所用 探针以外型别1例，混合感染5例；11例假性湿疣中仅 有1例为HPV16阳性。结论：该方法对HPV感染特别是亚临 床感染和隐性感染的基因诊断是快速敏感特异的，值得推广应用。
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中图法分类号R394-3；R737.33 文献标识码B
文章编号：1000-5404(2000)02-0194-02
Establishment of GPPCR-RDB method for rapid genetic diagnosis of HPV infection
人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)有100多种型别，在人类广泛传播，其感染可致皮肤疣(特别是尖锐湿疣)和 皮肤粘膜癌(特别是宫颈癌)等。尖锐湿疣(CA)的亚临床 感染(SPI)与假性湿疣在临床上有时难以鉴别，前者是CA复发的重要原因[1]，确诊者必须接受治疗，后者则 不然，可以不予治疗，因而临床上必须对它们早期 诊断和鉴别诊断。通常的方法诊断率较低，特异性 也欠佳，因而有赖于基因诊断技术对病原体HPV进行检 测作出病因诊断。单一的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)或分子杂交技术在临床上应用总存在一些不 足[2]，本文探索建立一种快速敏感特异且实用的改良 方法。
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1 材料与方法
1.1 标本收集及处理
门诊患者25例，其中经醋酸白试验证实为SPI的14例， 含11例典型CA皮损周围的SPI(典型CA皮损经激光烧灼清除 ，SPI未清除)及3例单纯SPI；经醋酸白试验阴性的假性 湿疣患者11例。活检皮损一部分作病理组织学检查， 另一部分液氮贮存备用。所有病例均随访半年，14例 SPI均于3个月内出现典型皮损(复发)，复发标准参见文 献[1]，11例假性湿疣10例皮损无变化，1例出现典型CA皮 损(女性，3个月时)。
1.2 主要材料和仪器
HPVL1通用引物和HPV6、11、16、18型特异性寡核苷酸(SSO)探针[3]由中科院上海细胞所合成。HPV11重组质粒由德国 海登保癌症研究中心赠。地高辛检测试剂盒、dNTP(含 Dig-dUTP)和蛋白酶K为德国宝灵曼公司产品。PCR扩增试 剂盒为复旦大学产品。硝酸纤维素膜为Promega公司产品 。PCR仪为美国产品(DB80230)。
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1.3 模板DNA制备
组织剪碎后加SDS和蛋白酶K37℃消化，饱和酚及氯仿-异戊醇抽提，无水乙醇沉淀。沉淀溶于0.1×SSC，加 RNaseA42℃消化。同上抽提沉淀，离心弃上清，干燥沉 淀，适量的双蒸水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳观察 ，4℃保存。
1.4通用引物介导的聚合酶链反应(GPPCR)
PCR反应总体积为50μl，含5×PCR缓冲液5μl，模板DNA适 量，dATP、dGTP和dCTP各1mmol/L，dTTP0.65mmol/L，Dig-dUTP0.35mmol/L, 50pmol的L1通用引物一对，去离子水适量，混匀，95℃变 性后加Taq酶2U，混匀后覆石蜡油30μl，在PCR仪上按93℃ 30s，52℃1min,72℃1min循环30个周期，最后72℃延伸10min。 取出10μl扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，观察特 异性带。同时设有方法对照和HPV11质粒的阳性对照及 正常包皮组织DNA的阴性对照。
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1.5 反向斑点杂交(RDB)
将HPV6、11、16、18SSO探针通过碳二亚胺的介导固定在 硝酸纤维膜上，形成4个点。按文献[4]进行预杂交30min， 然后取经氯仿抽提的PCR扩增产物分别与已固定的SSO探 针进行杂交约1h，漂洗后籍PCR产物上携带的Dig标记物 进行碱性磷酸酶显色。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
14例SPI组织DNA以GPPCR扩增后，扩增产物均为约450bp的电 泳带；11例假性湿疣组织DNA扩增后仅有1例出现了约450 bp的电泳带。方法对照和正常包皮组织DNA扩增后均未 出现特异性电泳带。其中2例扩增结果见图1。
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图1 2例PCR扩增产物电泳图谱(1.5%琼脂糖凝胶)
1、2：2例扩增产物；3：阳性对照；4：阴性对照；5： pBR328DNA/BamHI,pBR328DNA/BglI,pBR328DNA/HinfI
2.2 RDB结果
15例阳性扩增产物与HPV6、11、16、18型SSO探针反向斑点 杂交后，HPV6阳性12例，占80.0%，HPV11阳性4例，占26.7% ，HPV16阳性4例，占26.7%，HPV18型全部阴性，所用探针以 外型别1例；其中HPV6/11混合感染3例，HPV6/11/16混合感染1例 ，HPV6/16混合感染1例。1例假性湿疣组织DNA的PCR扩增产物 经RDB后为HPV16阳性。其中6例RDB的结果见图2。
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图2 6例RDB结果
a.b.c：分别为HPV6、HPV11和HPV16阳性；d：HPV阴性；e：HPV6、11阳性；f：HPV6、11、16阳性
3 讨论
本研究采用GPPCR-RDB法对SPI和假性湿疣进行了快速的 基因诊断和鉴别诊断，并对HPV进行了分型。在25例患 者中，14例SPI经检测均存在有HPVDNA，11例假性湿疣中仅 有1例检测出了HPV16DNA。在随访中，14例SPI均在3个月内出 现典型的CA皮损(3例单纯SPI)或复发(11例典型CA皮损周围 的SPI)，说明SPI未治疗是临床上CA复发的重要原因，提 示临床上应扩大治疗范围。1例女性假性湿疣患者中 也检测出了HPVDNA，随访3个月时出现了典型的CA皮损， 因此其假性湿疣的临床诊断是否成立值得考虑，也 许是合并有隐性感染。对于所有检测出HPV16DNA的病例 因有癌变的可能，应长期随访。
, http://www.100md.com
该方法在PCR扩增时将地高辛配基标记在扩增产物上 ，避免了再次标记；RDB时可检测出4种(本研究中)或多 种HPV型别(固定上多种型别SSO探针)，克服了设计若干 对引物的扩增方法或通用引物扩增后斑点杂交的方 法存在的成本高和标本量无法满足要求等不足。如 果模板DNA的制备改为快速裂解法或直接采用拭子浸泡 后裂解制备DNA法，就可以缩短检测时间，半天左右可 得出结果，更便于推广应用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600175)
作者简介：郭华阳(1966.4)，男，湖北省英山市人，硕 士，主治医师，讲师。
参考文献
[1]郭华阳，李文维，赵莉蓉.激光治疗后CA复发情况 调查及原因探讨[J].第三军医大学学报，1995，17(4)：361- 362.
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[2]郭华阳，汪江华，周来新，等.HPV隐性感染的两种 基因诊断方法比较研究[J].中华医学检验杂志，1997， 20(3)：181-182.
[3]朱平.PCR基因扩增实验操作手册[M].北京：中国科学 技术出版社，1992.426-428.
[4]SaikiRK,WalshPS,LevensonCH,etal.GeneticanalysisofamplifiedDNAwith immobilizedsequence-specificoligonucleotideprobes[J].ProcNatlAcadSciUSA, 1989,86(16):6230-6234.
收稿日期：1998-09-16；修回日期：1999-03-03, 百拇医药