中耳胆脂瘤上皮细胞的增生与凋亡
作者：余其林 金康业
单位：湖北医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科，武汉 430071
关键词：
实用医学进修杂志000227
中耳胆脂瘤是一种临床危害极大的中耳疾患，其独特的病理特征表现为中耳腔内鳞状上皮的高度增生及角化碎片的累积。其发病机制尚不十分清楚，为了探讨其确切的发病机制，近年来围绕着胆脂瘤上皮细胞的增生和凋亡这一问题，各国学者从多方面展开了研究，并取得了相当大的进展。
1 中耳胆脂瘤上皮细胞的增生与凋亡特性
1.1，中耳胆脂瘤上皮的增生特性
临床研究表明中耳胆脂瘤为一位于中耳、乳突腔内的囊性结构，囊内壁为复层鳞状上皮，囊内充满脱落上皮、角化物质及胆固醇结晶，结合其膨胀性生长特性，学者们推测胆脂瘤上皮即囊内壁复层鳞状上皮具有高度增生的特性，多年的研究也证实了这一点，人们在胆脂瘤上皮中发现了多种增生标志，为胆脂瘤上皮的增生提供了有力的证据。
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在上皮细胞中，细胞角蛋白(cytokeratins,CKs)是重要的分化标志[1]，CK16(cytokeratin 16，CK16)是角质细胞高度增生的标志[2，3]。Broekaert等人[4]利用免疫组织化学方法对细胞角蛋白(CKs)在中耳胆脂瘤上皮中的表达进行了研究，发现CK16在后天性中耳胆脂瘤上皮的基底上层细胞中有表达。Bujia[5]等人对此作了进一步研究，他们利用凝胶电泳技术证实了CK13和CK16在中耳胆脂瘤上皮中的存在，进而利用免疫组化方法发现CK16表达于中耳胆脂瘤上皮的基底上层细胞中，并且在中耳胆脂瘤上皮厚的区域CK16的表达明显强于上皮薄的区域，同时他们也发现作为高度分化标志的CK13只出现在没有CK16表达区域的基底层细胞中。Sasaki等人[6]的研究也得到了相似的结果。这些研究为中耳胆脂瘤上皮的高度增生提供了直接的生化证据。
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Ki67是一种核抗原，它在细胞生长周期的各个阶段均有表达，常被用作增生标志来反应细胞的增生状态[7]。Ergun等人[8]在研究中发现Ki67在正常上皮组织中仅存在于基底层细胞中，而在中耳胆脂瘤上皮中其表达增加，它不仅存在于基底细胞层中，而且也存在于基底层以上的细胞层中，同时他们还发现BerEP4及4F2抗原在中耳胆脂瘤上皮中的表达明显增加，Ki67、BerEP4及4F2抗原的表达增加，说明了中耳胆脂瘤上皮具有高度增生的特性。但是由于技术原因Ki67抗原免疫组化方法检测仅局限于冰冻切片。因此，为了解决这个难题，人们找到了单克隆抗体MIB1。MIB1在迟G1、S1、G2和M期能与细胞增生相关抗原发生反应，即能与Ki67抗原结合部发生反应[9、10]，能够被用于石蜡切片，因此亦用于细胞增生状态的研究。Sudhoff[11]等人应用免疫组织化学方法对MIB1抗原在中耳胆脂瘤上皮和外耳道正常上皮的表达作了对比研究，结果发现中耳胆脂瘤上皮细胞的增生指数(MIB1阳性细胞率)为17.4±8.9%，是正常外耳道上皮的2到3倍，而且MIB1阳性细胞不仅出现于中耳胆脂瘤上皮的基底层(正常上皮仅局限于该层)，在基底层以上的细胞层亦存在。这有力地说明了中耳胆脂瘤是一种高度增生性疾病。同时他们也发现了一个有趣的现象，那就是MIB1抗原在不同区域表达情况并不相同，进而提出中耳胆脂瘤上皮增生能力可能与上皮下炎性组织及各种细胞因子密切相关。许昱等也得到了相似的结果[12]。
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增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)是非组蛋白性核蛋白，表达在细胞周期的迟G1、S和G2期，是血清中自分泌、能特异性地与增生细胞核抗原发生反应的抗体的抗原，是提高DNA多聚酶d核心酶活性所必须的，它参与了DNA合成和细胞增生[13]。关于PCNA在中耳胆脂瘤上皮中的表达，以前的研究有所不同。Uchida等[14]观察到在8例中耳胆脂瘤样本中，有4例出现PCNA阳性细胞，而正常外耳道皮肤样本则没有，并认为PCNA阳性细胞只存在于伴有骨质溶解的中耳胆脂瘤上皮中。Tsuruhara等人[15]报道，在中耳胆脂瘤上皮和正常外耳道上皮中PCNA阳性细胞数没有多大差别，只是出现的部位有所不同，在正常外耳道上皮中PCNA阳性细胞仅出现在基底层，而在中耳胆脂瘤上皮中则多只出现于棘细胞层。目前随着技术的改进，研究结果趋于一致。Tanaka等[16]研究发现，在正常外耳道上皮中，PCNA阳性细胞仅出现于基底层，在中耳胆脂瘤上皮中，PCNA大量表达于基底层细胞，而且在棘细胞层和颗粒细胞层中也有表达。其PCNA阳性细胞率为19.9±12.6%，远高于前者的4.8±1.3%。同时他们也注意到在中耳胆脂瘤上皮组织中，不同样本及同一样本不同部位，PCNA的表达并不尽相同，其增生状态与炎性细胞的浸润密切相关。结果表明，与正常外耳道上皮相比，中耳胆脂瘤上皮具有高度增生的能力。
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通过上述增生标志在中耳胆脂瘤上皮的表达的研究，证实了中耳胆脂瘤上皮具有高度增生的特性，即在中耳胆脂瘤上皮组织中，除基底层细胞外基底层以上的细胞也具有增生的能力，并通过MIB1及PCNA在中耳胆脂瘤上皮中表达研究发现，中耳胆脂瘤上皮的增生与炎性细胞及细胞因子有关。
1.2 中耳胆脂瘤上皮细胞的凋亡特性
细胞凋亡(apoptosis)又称细胞程序性死亡(pragrammed cell drath,PCD)它是由基因调控的机的一种基本生理机制，是机体维持正常生理所必须的。它也是机体清除生理上不需要细胞的一种方式。它不同于坏死或老死的死亡方式，其超微结构、生化及分子改变与之有显著差别。在细胞凋亡时，激活的内源性核酸内切酶将自身的DNA或染色质切割，出现单链或双链切口，进而形成核碎片，并各自被膜包囊，形成含有多个细胞的凋亡小体被邻近的活化细胞(上皮细胞、巨噬细胞等)吞噬而清除[17]。一般认为，核酸内切酸的活化和DNA电泳呈梯状改变是细胞凋亡的生化标志。正是由于DNA的变化，才使早期在原位检测凋亡细胞成为了可能[18]。
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Koba等[19]利用原位凋亡细胞检测TUNEL染色技术(TdT-mediated dUTP nick and labeling)[18]对中耳胆脂瘤上皮细胞的凋亡状态进行了研究，他们发现，中耳胆脂瘤上皮细胞的凋亡率、出现部位(上皮的最上层)与正常外耳道上皮没有什么不同。Kojima等[20]也做类似的研究，发现在中耳胆脂瘤上皮中，凋亡细胞出现在颗粒细胞层，而正常外耳道上皮也相同，两者的凋亡率分别为66.8±7.8%和59.5±10.1%，在统计学上没有差别。因此，他们认为中耳胆脂瘤上皮细胞具有与正常外耳道上皮相似的凋亡能力，在中耳胆脂瘤的形成和发展过程中具有重要作用。
1.3 中耳胆脂瘤上皮细胞的增生和凋亡的，动力学特征
在一个多细胞机体中，细胞分裂增生与凋亡是对立统一的，共同协调着组织和器官形态发生的发展方向——维持、增生、抑制或退化，组织细胞数处于动态平衡[21]。在中耳胆脂瘤中，其鳞状上皮具有高度增殖能力这已经被公认，上述研究表明，中耳胆脂瘤上皮的增生能力远高于正常外耳道上皮，这与肿瘤相似，但同时也有研究表明。中耳胆脂瘤上皮细胞仍具有凋亡能力，尽管目前有关研究很少，尚不能对中耳胆脂瘤上皮细胞的凋亡状态作出全面的判断，但这足以显示出与肿瘤具有抵抗凋亡的能力或凋亡与增生失衡的不同。这样，虽然中耳胆脂瘤上皮细胞具有高度增生的能力，然而由于中耳胆脂瘤上皮细胞仍保持与正常上皮相似的凋亡率，从而使中耳胆脂瘤上皮的细胞处于相对的动态平衡，但却产生了大量的角化碎片。当然角化碎片的累积与其转运障碍也有关。
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2 细胞因子及生长因子与中耳胆脂瘤上皮，细胞的增生和凋亡
细胞因子和生长因子参与中耳胆脂瘤上皮细胞的增生和分化调节，在中耳胆脂瘤的形成和发展过程中起着重要作用，特别是白细胞介素-1(IL-1)及其受体、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)及其受体、转移生长因子α(TGF-α)热休克蛋白(HSP)等。现分述如下：
IL-1是一种分泌生长因子，主要由单核细胞、巨噬细胞等多种炎性细胞分泌，上皮细胞也能分泌。IL-1有两种分子类型，都能结合相同的受体，引起几乎完全相同的效应[22]。由于IL-1是非常有效的骨溶解诱导因素，因此许多研究都集中在IL-1与中耳胆脂瘤骨破坏的关系上，但是IL-1同时也是一种潜在的角质细胞增生因子[23]，在中耳胆脂瘤上皮细胞增生调控中起重要作用。Kamide等[24]研究认为郎罕氏细胞之所以能刺激胆脂上皮增和角质化，可能与其释放IL-1等因子有关，首先提出了IL-1在中耳胆脂瘤上皮增生中扮演了重要角色。Schilling[25]运用免疫组化技术研究发现，在中耳胆脂瘤上皮中IL-1的染色强度明显高于正常外耳道上皮，并且上皮细胞各层次强度相同，Kakiuchi等[26]进一步利用Western杂交技术研究发现角质细胞只产生IL-1-α，证实了IL-1-α在中耳胆脂瘤上皮中的高表达，同时，Bujia等[27、28]也对中耳胆脂瘤上皮中IL-1-R及IL-1-RA(白介素-1受体拮抗剂)的表达进行了研究，他们发现在中耳胆脂瘤上皮中IL-1-R表达增加，但其IL-1RA表达明显减少。因此不难看出，正是由于IL-1-RA表达的减少，IL-1及IL-1-R表达的大量增加，通过IL-1与其受体的结合激活相关蛋白激酶，从而发挥其生物功能，促进上皮的增生。
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表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)首先是Coken从雌鼠颌下腺中提取的多功能生长因子。人EGF的分子量为6KDa左右、含有53个氨基酸残基的多肽，对多种细胞是个很强的促细胞分裂因子，其生物学效应是通过和细胞表面专一受体(EGF-R)的相互作用进行，EGF-R的分子为170KDa的跨膜糖蛋白，当EGF与其受体结合后，激活相关酪氨酸激酶，使其它蛋白在酪氨酸残基上磷酸化，产生增殖信号[23]。Kojima[29]等对表皮生长因子及其受体的mRNA在中耳胆脂瘤中表达进行了研究，结果表明，在中耳胆脂瘤中EGF-R的mRNA出现在基底层细胞中，而在正常外耳道上皮中则没有，相反，在正常外耳道上皮中EGF的mRNA的信号在基底层细胞被观察到，而在中耳胆脂瘤中上皮全层均有其信号。正是由于中耳胆脂瘤上皮中EGF-R的表达异常，导致了角质细胞的异常增生。
转移生长因子α(TGF-α)是EGF-R的配体，也是一种角质细胞生长因子，它的氨基酸序列有0%到40%与EGF同源，能与EGF-R结合促进多种细胞的增生[23]。Shulz等[30]曾对TGF-α在中耳胆脂瘤上皮中的表达进行了研究认为其参与了中耳胆脂瘤上皮细胞的增生。为此，Shiwa等[31]作了进一步探讨，他们发现TGF-α蛋白在中耳胆脂瘤上皮和外耳道中分布相似，但其mRNA的分布却存在明显差异，在中耳胆脂瘤中TGF-α的mRNA出现在基底层、颗粒层细胞中，而正常外耳道上皮中仅基底层细胞中有表达，同时，他们也发现基底下的炎性组织中也有EGF-α的表达，进而认为，TGF-α通过自分泌及旁分泌途径促进了上皮细胞的增生。
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肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子，根据结构和来源分为两种类型TNF-α和TNF-β，它们具有相似的分子结构，并且可以与同一受体结合，发挥相似的生物学功能。它们均可以由角化细胞分泌[22]。Yan等[32]首先报告TNF-α存在于中耳胆脂瘤上皮中，他们发现TNF-α主要分布在中耳胆脂瘤上皮的基底层及以上层次的细胞中，上皮下的炎性细胞中亦存在，紧接着利用细胞体外培养的方法对TNF-α在基底层角质细胞的增生、分化中所起的作用进行了研究，结果发现，TNF-α能刺激细胞的增生、蛋白合成及细胞终末分，从而增加了角化碎片的产生。因为TNF-β与TNF-α可以竞争同一受体而产生相似的生物学活性，因此Yan等人[33]利用同一种方法对TNF-β在中耳胆脂瘤形成和发展过程中的作用进行了研究，得到了相似的结果。由此看出，TNF-α和TNF-β在中耳胆脂瘤中发挥着相似的生物学功能，共同促进中耳胆脂瘤上皮细胞的增生与凋亡。
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热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)普遍存在于从细菌到人类的整个生物界，其家庭成员依其分子量而命名。其中HSP60和HSP70是目前研究得比较深入、全面的两种热休克蛋白，它们是许多蛋白的拆叠、亚基的形成、运输及降解所必需的，它们亦因此被称为分子伴侣[34](molecular chaperone)。Shinoda等[34]研究发现HSP60和HSP70在中耳胆脂瘤上皮细胞浆中大量表达，通过阻碍胞质内蛋白早熟折叠和不适当聚合，保证了角质细胞加快合成蛋白质的速度。促进了角质细胞的增生。同时Shinoda等[35]也发现HSP70高浓度聚集在中耳胆脂瘤上皮细胞的胞核中，LaThangue[36]通过实践证明HSP70的核堆积在增殖细胞中提高，这进一步说明了HSP70与中耳胆脂瘤上皮细胞的增殖活动有关。中耳胆脂瘤独特的病理特征为角化碎片的累积，这是由于角质细胞增殖、分化、凋亡而引起的。Shinoda[35]认为HSP70不仅参与了中耳胆脂瘤上皮细胞的增殖调节，而且也参与了其凋亡调控。研究表明，HSP70有稳定p53蛋白的作用[37]，正是由于HSP70及其它蛋白质稳定了p53蛋白，使其在中耳胆脂瘤上皮颗粒层细胞中大量表达，从而诱导了细胞的凋亡[38]。
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角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)是成纤维细胞生长因子家庭中的一员(成纤维细胞生长因子7)。在作用于上皮细胞的因子中，KGF是一种旁分泌生长因子，它不仅能刺激成纤维细胞的增生，也能作用于上皮细胞直接决定其增生和分化[39]。Kojima[40]证实了KGF在中耳胆脂瘤上皮下相连组织的成纤维细胞中的异常表达，并认为KGF以旁分泌的方式参与了中耳胆脂瘤上皮增生调节。
此外还有多种因子参与了中耳胆脂瘤的临床进展，如IL-6、INF、PDGF、TGF-β等。当然它们所起的作用并不是孤立的，而是通过互相作用、以复杂的网络共同调节着中耳胆脂瘤上皮细胞的增生、分化与凋亡。
3 癌基因在中耳胆脂瘤上皮中的表达及中，耳胆脂瘤上皮细胞增生与凋亡调控机制
细胞的增生和凋亡受机体外多种因素的影响。细胞内基因变化直接调控着增生与凋亡的发生和发展，细胞外部的因素通过信号传递影响细胞内基因表达而起间接调控作用。目前在中耳胆脂瘤中研究较多的基因有C-myc、p53、C-jun和C-ras。
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在细胞的增生和凋亡调控中C-myc是一个重要的相关基因。虽然C-myc蛋白作为转录因子的作用机理还不十分清楚，但它在增殖调控中的重要作用，以及在生长抑制的条件下也可诱导凋亡的作用得到了证实。因此，C-myc被认为是具有诱导增生和凋亡双重作用的基因。其作用的选择是由其它信号决定的(如生长因子的存在或其它存活刺激)。它所引起的效应是细胞类型和刺激特异的，并不是所有类型的凋亡诱导所必需的。C-myc的表达和生长因子的获得与否决定了细胞的状态，生长抑制(C-myc不表达，生长因子缺如)、增殖(C-myc表达，生长因子存在)、凋亡(C-myc表达，生长因子缺如)[41，42]。研究表明C-myc 蛋白产物在中耳胆脂瘤上皮的基底层及以上细胞中大量表达，其核染阳性率为38.3%，远高于正常外耳道上皮，证实了C-myc在中耳胆脂瘤上皮细胞增生与凋亡调控中起重要作用[43]。
p53基因有野生型(wt)和突变型(mt)两种，Wtp53编码的蛋白监控，维持着基因组的完整性。如果DNA受损，p53使细胞周期停滞去G1期，便于DNA修复。若修复失败，p53则诱发凋亡[44]。C-jun基因编码的蛋白可以形成同源二聚体，也可与C-fos的表达产物形成二聚体。在特定靶细胞中，Fos-Jun或Jun-Jun二聚体组成的多样性可能决定某些特异基因的转录[45，46]。Shinoda[38]等人发现Wtp53表达于中耳胆脂瘤上皮的颗粒细胞层膜核中，C-jun蛋白则存在于上皮的基底层和棘细胞层中，这正好与中耳胆脂瘤上皮的增生和凋亡情况相符。
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Ras蛋白作为一种鸟苷酸(GTP)结合蛋白，在许多细胞的增生和分化中起信号转导作用，Hung等[47]发现了ras蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的表达，对中耳胆脂瘤上皮细胞的增生和凋亡机制作了探讨。他们认为胞外的一些信号(如一些生长因子EGF、PDGF、GM-CSF等)和胞膜上的受体结合，激活胞内的相关酪氨酸酶，这些酶再激Ras蛋白，进而激活有丝分裂原活化的蛋白激酶，信号传到胞核，通过核内的转录因子C-jun调节基因的表达和蛋白的合成。而胞外的另一些信号(如干扰素)转移生长因子β则刺激另一些基因的表达(如p53)介导细胞的凋亡，从而产生大量的角化碎片。
4 展望
综上所述，中耳胆脂瘤是一种上皮高度增生性疾病，并伴有角化磷片的累积，多种细胞因子及生长因子、癌基因参与了上皮细胞增生与凋亡的调控。虽然目前各种因子在中耳胆脂瘤的形成和发展过程中究竟起到了什么具体作用、其确切的机制又是什么还不十分清楚，但是随着科学技术的发展，这些疑团一定会被破解，而这一问题的解决必将对中耳胆脂瘤的预防、诊断、治疗起着巨大的推动作用。
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参考文献
1，Moll R,Franke WW,Schiller DL,et al.The catalog of human cytokeratins patterns of expression in normal epithelia,tumors and cultured cells[J].Cell,1982;31:11
2，Sun T-T,Eichner R,Schermer A,et al.Classification,xpression,and possible mechanisms of evolution of manmalian epithelial keratins:a unifying model[A].In:Levine AJ,Vande Wonde GF,Topp WC,Watson JD,eds.Cancer cells 1/The transformed phenotype[M].Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory,1984:169～176
, 百拇医药
3，Weiss RA,Eichner R,Sun T-T.Monoclonal antibody analysis of keratin expression in epidermal diserse:a 48-and 56-kdalton keratin as molecular markers for hyperproliferative keratinocytes[J].J cell Biol,1984;98:1397
4，Broekaert D,Coucke P,Leperque S,et al.Immunohistochemical analysis of the cytokeratin expression in middle ear cholesteatoma and related epithelial tissue[J].Ann otol Rhinol Laryngol,1992;101:931
5，Bujia J,Schilling V,Holly A,et al.Hyperproliferation-associated Keratin expression in human middle ear cholseteatoma[J].Acta Otolaryngol (stockh) 1993;113:364
, 百拇医药
6，Sasaki H,Huang CC.Expression of cytokeration 13 and 16 in middle ear cholesteatoma[J].Otolaryngol Head Neck Sury 1994;110:310
7，Sasaki K,Murakami T,Takahashi M.The cell cycle associated change of the Ki-67 reactive nuclear antigen expression[J].J Cell physicol 1987;133:579
8，Ergun S,zheng X,Carlsoo B.Antigen expression of epthelial markers,collagen IV and Ki67 in middle ear chiolesteatoma[J].Acta Otolaryngol.1994;14:295
, http://www.100md.com
9，Cattoretti G,Becker MHG,key G,et al.Monoclonal Antibodies Against recombinant parts of the Ki67 Antigen MIB1 and MIB3 detect proliferating cell in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections[J].J pathol,1992;168:357
10，Gerdes J,Lemke H,Baisch H,et al.Cell cycle Analysis a cell proliferation associated human nuclear antigen defined by the monoclone antibody Ki-67[J].J.Immunl,1984;133:1710
11，Shudhoff H,Bujia J,Holly A,et al.Expression of a cell cycle-Associated nuclear antigen(MIB) in cholesteatoma and Auditory Meatal skin[J].Laryngoscope,1995;105:1227
, http://www.100md.com
12，许昱，金康业，董卫国.Ki67和转化生长因子α在中耳胆脂瘤中的表达[J].中华耳鼻咽喉杂志，1994；34(5)：320
13，Prelich G,Cheng KT,Kostura,et al.Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase-d auxiliary protein[J].Nature,1987;326:517
14，Uchida N,Ito S,Hirano M.Localization of PCNA in aural cholesteatoma[J].Kurume Med J,1993;40:225
15，Tsuruhara,Iwano T,Ushiro K,Proliferative activity of cholesteatoma epithelium[A].In:Nakano Y,ed.Cholesteatoma and Mastoid Surgery[M].Niigate,Japan:Kugler on Ghedini;1993:223～226
, 百拇医药
16，Tanaka Y,Shiwa M,Kojima H,et al.A study on epideymal proliferation abiligy in cholesteatoma[J].laryngoscope,1998;108:537
17，Wyllie AH,Kerr JFR,Currie AR.Cell death:the significance of apoptosis[J].Int Rev Cytol,1980;68:251
18，Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ viaspecific labeling of nuclear DNA Fragmentation[J].The Journal of cell Biology,1992;119:493
, 百拇医药
19，Koba K,Yagi M,Tabe H,et al.Kinetic analysis of cell proliferation using bromodeoxyuridine labeling and in situ detection of dying cells in the tympanic membrane and middle ear cholesteatoma[J].Arch Histol Cytol,1996;59:339
20，Kojima,H,Tanaka Y,Tanaka T,et al.Cell proliferation and apoptisis in human middle ear cholesteatoma[J].Arch Otolaryngol head neck sury,1998;124:261
21，胡继鹰.基础医学细胞生物学[M].武汉：武汉大学出版社，1995：143～144
, 百拇医药
22，毕爱华.医学免疫学[M].北京：人民军医出版社，1995：68～79
23，谭增柔.医学细胞生物学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1992：25～260
24，Kamide Y,Sasaki H,Abramson M,et al.Effects of epidermal Langerhans cell's conditioned medium on Keratinacytes:a role of Langerhans cells in cholesteatoma[J].Am J Otolaryngol,1991;12:307
25，Schilling V,Bujia J,Negri B,et al.Interleukin-1-containing cells in cholesteatoma of the middle ear[J].Laryngouhinootologie,1992;71:271
, 百拇医药
26，Kakiuchi H,Kinoshita K,Katoh Y,et al.Interleukin-1 of cholesteatoma Keratinocytes[J].Ann otol Rhinol Laryngol,1992;157:32
27，Bujia J,Kim C,Ostos P,et al.IL-1 and IL-1-receptor antagonist(IL-1-RA)in middle ear cholesteatoma:an analysis of protein production and biological activety[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,1996;253:252
28，Bujia J,Kim C,Ostos P,et al.Enhanced epithelial proliferation due to elevated levels of Interleukin-1 receptors in middle ear cholesteatoma[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,1997;254:6
, 百拇医药
29，kojima H,Shiwa M,Kamide Y,et al.Expression and Iocalization of mRNA for epidermal growth factor and epidermal growth factor receptor in human cholesteatoma,Acta[J].Otolaryngologica(stockh),1994；114:423
30，Schulz P,Bujia J,Shilling V.Possible autocrine growth stimulation of cholesteatoma epithelium by transforming growth factor alpha[J].American J of Otolaryngology,1993;14:82
31，Shiwa M,Kojima H,Moriyama H.Expression of transforming growth factor-αin cholesteatoma[J].J of laryngology and otology,1998;112:750
, 百拇医药
32，Yan SD,Huang CC.Tumor necrosis factor alpha in middle ear cholesteatoma and its effect on keratinocytes in vitro[J].Ann Otol Rhinol Larygol,1991；100:157
33，Yan SD,Huang CC.Lymphotoxin in human middle ear cholesteatoma[J].Laryngoscope,1991;101:411
34，Pelham HR.Speculations the functions of the major heat shock and glucose regulated proteins[J].Cell,1998;46(7):959
35，Shinoda H,Huang CC.Heat shock protein in middle ear cholesteatoma[J].Otolaryngology Head Neck Surg,1996;114:77
, 百拇医药
36，La Thangue NB.A major heat-shock protein defined by a monoclonal antibody[J].EMBOJ.1984;32:1871
37，Matsumoto H,Shimara M,Omatsu T,et al,p53 protein accumulated by heat stress associate with heat shock proteins HSP 72/HSC 73 in human glioblastoma cell lines[J].Cancer lett 1994;87:39
38，Shinoda H,Huang CC.Expression of c-jun and p53 proteins in human middle ear cholesteatoma:related go keratinocyte proliferation differentiation and programmed cell death[J].Laryngoscope,1995；105:1232
, 百拇医药
39，Finch PW,Rubin JS,Miki T,et al.Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth[J].Science,1989；245:752
40，Kojima H,Matsuhisa A,Shiwa M,et al.Expression of Messenger RNA for Kerationocyte growth factor in human cholesteatoma[J].Arch otolaryngol head neck surg,1996;123:157
41，Williams GT,Smith CA.Molecular regulation of apoptosis:genetic controls on cell death[J].Cell,1993;74:777
, 百拇医药
42，Evan GT,Wyllie AH,Gilbert CS,et al.Induction of apoptosis by c-myc protein[J].Cell,1992；41：119
43，Holly A,Sittinger M,Bujia J.Immunohistochemical detection of c-myc proto-oncogene products in middle ear cholesteatoma[J].Laryngorhinootologie,1995；74:348
44，Lovine A,Moman J,Finlay CA.The p53 Tumor Suppressor Gene[J].Nature,1991;351:452
45，Angel P,Allegretto EA,Okino ST,et al.Oncogene jun encodes a sequencen-specifictrans-activator similar to AP-1[J].Nature,1988；322:166
46，Eagen SE,Weinberg RA.The pathway to signal achievement[J].Nature,1993;365:781
47，Huang CC,Chen CT,Huang TS,et al.Mediation of signal transductive in keratinocytes of human middle ear cholesteatoma by ras protein[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,1996;253:385, 百拇医药
单位：湖北医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科，武汉 430071
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中耳胆脂瘤是一种临床危害极大的中耳疾患，其独特的病理特征表现为中耳腔内鳞状上皮的高度增生及角化碎片的累积。其发病机制尚不十分清楚，为了探讨其确切的发病机制，近年来围绕着胆脂瘤上皮细胞的增生和凋亡这一问题，各国学者从多方面展开了研究，并取得了相当大的进展。
1 中耳胆脂瘤上皮细胞的增生与凋亡特性
1.1，中耳胆脂瘤上皮的增生特性
临床研究表明中耳胆脂瘤为一位于中耳、乳突腔内的囊性结构，囊内壁为复层鳞状上皮，囊内充满脱落上皮、角化物质及胆固醇结晶，结合其膨胀性生长特性，学者们推测胆脂瘤上皮即囊内壁复层鳞状上皮具有高度增生的特性，多年的研究也证实了这一点，人们在胆脂瘤上皮中发现了多种增生标志，为胆脂瘤上皮的增生提供了有力的证据。
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在上皮细胞中，细胞角蛋白(cytokeratins,CKs)是重要的分化标志[1]，CK16(cytokeratin 16，CK16)是角质细胞高度增生的标志[2，3]。Broekaert等人[4]利用免疫组织化学方法对细胞角蛋白(CKs)在中耳胆脂瘤上皮中的表达进行了研究，发现CK16在后天性中耳胆脂瘤上皮的基底上层细胞中有表达。Bujia[5]等人对此作了进一步研究，他们利用凝胶电泳技术证实了CK13和CK16在中耳胆脂瘤上皮中的存在，进而利用免疫组化方法发现CK16表达于中耳胆脂瘤上皮的基底上层细胞中，并且在中耳胆脂瘤上皮厚的区域CK16的表达明显强于上皮薄的区域，同时他们也发现作为高度分化标志的CK13只出现在没有CK16表达区域的基底层细胞中。Sasaki等人[6]的研究也得到了相似的结果。这些研究为中耳胆脂瘤上皮的高度增生提供了直接的生化证据。
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Ki67是一种核抗原，它在细胞生长周期的各个阶段均有表达，常被用作增生标志来反应细胞的增生状态[7]。Ergun等人[8]在研究中发现Ki67在正常上皮组织中仅存在于基底层细胞中，而在中耳胆脂瘤上皮中其表达增加，它不仅存在于基底细胞层中，而且也存在于基底层以上的细胞层中，同时他们还发现BerEP4及4F2抗原在中耳胆脂瘤上皮中的表达明显增加，Ki67、BerEP4及4F2抗原的表达增加，说明了中耳胆脂瘤上皮具有高度增生的特性。但是由于技术原因Ki67抗原免疫组化方法检测仅局限于冰冻切片。因此，为了解决这个难题，人们找到了单克隆抗体MIB1。MIB1在迟G1、S1、G2和M期能与细胞增生相关抗原发生反应，即能与Ki67抗原结合部发生反应[9、10]，能够被用于石蜡切片，因此亦用于细胞增生状态的研究。Sudhoff[11]等人应用免疫组织化学方法对MIB1抗原在中耳胆脂瘤上皮和外耳道正常上皮的表达作了对比研究，结果发现中耳胆脂瘤上皮细胞的增生指数(MIB1阳性细胞率)为17.4±8.9%，是正常外耳道上皮的2到3倍，而且MIB1阳性细胞不仅出现于中耳胆脂瘤上皮的基底层(正常上皮仅局限于该层)，在基底层以上的细胞层亦存在。这有力地说明了中耳胆脂瘤是一种高度增生性疾病。同时他们也发现了一个有趣的现象，那就是MIB1抗原在不同区域表达情况并不相同，进而提出中耳胆脂瘤上皮增生能力可能与上皮下炎性组织及各种细胞因子密切相关。许昱等也得到了相似的结果[12]。
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增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)是非组蛋白性核蛋白，表达在细胞周期的迟G1、S和G2期，是血清中自分泌、能特异性地与增生细胞核抗原发生反应的抗体的抗原，是提高DNA多聚酶d核心酶活性所必须的，它参与了DNA合成和细胞增生[13]。关于PCNA在中耳胆脂瘤上皮中的表达，以前的研究有所不同。Uchida等[14]观察到在8例中耳胆脂瘤样本中，有4例出现PCNA阳性细胞，而正常外耳道皮肤样本则没有，并认为PCNA阳性细胞只存在于伴有骨质溶解的中耳胆脂瘤上皮中。Tsuruhara等人[15]报道，在中耳胆脂瘤上皮和正常外耳道上皮中PCNA阳性细胞数没有多大差别，只是出现的部位有所不同，在正常外耳道上皮中PCNA阳性细胞仅出现在基底层，而在中耳胆脂瘤上皮中则多只出现于棘细胞层。目前随着技术的改进，研究结果趋于一致。Tanaka等[16]研究发现，在正常外耳道上皮中，PCNA阳性细胞仅出现于基底层，在中耳胆脂瘤上皮中，PCNA大量表达于基底层细胞，而且在棘细胞层和颗粒细胞层中也有表达。其PCNA阳性细胞率为19.9±12.6%，远高于前者的4.8±1.3%。同时他们也注意到在中耳胆脂瘤上皮组织中，不同样本及同一样本不同部位，PCNA的表达并不尽相同，其增生状态与炎性细胞的浸润密切相关。结果表明，与正常外耳道上皮相比，中耳胆脂瘤上皮具有高度增生的能力。
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通过上述增生标志在中耳胆脂瘤上皮的表达的研究，证实了中耳胆脂瘤上皮具有高度增生的特性，即在中耳胆脂瘤上皮组织中，除基底层细胞外基底层以上的细胞也具有增生的能力，并通过MIB1及PCNA在中耳胆脂瘤上皮中表达研究发现，中耳胆脂瘤上皮的增生与炎性细胞及细胞因子有关。
1.2 中耳胆脂瘤上皮细胞的凋亡特性
细胞凋亡(apoptosis)又称细胞程序性死亡(pragrammed cell drath,PCD)它是由基因调控的机的一种基本生理机制，是机体维持正常生理所必须的。它也是机体清除生理上不需要细胞的一种方式。它不同于坏死或老死的死亡方式，其超微结构、生化及分子改变与之有显著差别。在细胞凋亡时，激活的内源性核酸内切酶将自身的DNA或染色质切割，出现单链或双链切口，进而形成核碎片，并各自被膜包囊，形成含有多个细胞的凋亡小体被邻近的活化细胞(上皮细胞、巨噬细胞等)吞噬而清除[17]。一般认为，核酸内切酸的活化和DNA电泳呈梯状改变是细胞凋亡的生化标志。正是由于DNA的变化，才使早期在原位检测凋亡细胞成为了可能[18]。
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Koba等[19]利用原位凋亡细胞检测TUNEL染色技术(TdT-mediated dUTP nick and labeling)[18]对中耳胆脂瘤上皮细胞的凋亡状态进行了研究，他们发现，中耳胆脂瘤上皮细胞的凋亡率、出现部位(上皮的最上层)与正常外耳道上皮没有什么不同。Kojima等[20]也做类似的研究，发现在中耳胆脂瘤上皮中，凋亡细胞出现在颗粒细胞层，而正常外耳道上皮也相同，两者的凋亡率分别为66.8±7.8%和59.5±10.1%，在统计学上没有差别。因此，他们认为中耳胆脂瘤上皮细胞具有与正常外耳道上皮相似的凋亡能力，在中耳胆脂瘤的形成和发展过程中具有重要作用。
1.3 中耳胆脂瘤上皮细胞的增生和凋亡的，动力学特征
在一个多细胞机体中，细胞分裂增生与凋亡是对立统一的，共同协调着组织和器官形态发生的发展方向——维持、增生、抑制或退化，组织细胞数处于动态平衡[21]。在中耳胆脂瘤中，其鳞状上皮具有高度增殖能力这已经被公认，上述研究表明，中耳胆脂瘤上皮的增生能力远高于正常外耳道上皮，这与肿瘤相似，但同时也有研究表明。中耳胆脂瘤上皮细胞仍具有凋亡能力，尽管目前有关研究很少，尚不能对中耳胆脂瘤上皮细胞的凋亡状态作出全面的判断，但这足以显示出与肿瘤具有抵抗凋亡的能力或凋亡与增生失衡的不同。这样，虽然中耳胆脂瘤上皮细胞具有高度增生的能力，然而由于中耳胆脂瘤上皮细胞仍保持与正常上皮相似的凋亡率，从而使中耳胆脂瘤上皮的细胞处于相对的动态平衡，但却产生了大量的角化碎片。当然角化碎片的累积与其转运障碍也有关。
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2 细胞因子及生长因子与中耳胆脂瘤上皮，细胞的增生和凋亡
细胞因子和生长因子参与中耳胆脂瘤上皮细胞的增生和分化调节，在中耳胆脂瘤的形成和发展过程中起着重要作用，特别是白细胞介素-1(IL-1)及其受体、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)及其受体、转移生长因子α(TGF-α)热休克蛋白(HSP)等。现分述如下：
IL-1是一种分泌生长因子，主要由单核细胞、巨噬细胞等多种炎性细胞分泌，上皮细胞也能分泌。IL-1有两种分子类型，都能结合相同的受体，引起几乎完全相同的效应[22]。由于IL-1是非常有效的骨溶解诱导因素，因此许多研究都集中在IL-1与中耳胆脂瘤骨破坏的关系上，但是IL-1同时也是一种潜在的角质细胞增生因子[23]，在中耳胆脂瘤上皮细胞增生调控中起重要作用。Kamide等[24]研究认为郎罕氏细胞之所以能刺激胆脂上皮增和角质化，可能与其释放IL-1等因子有关，首先提出了IL-1在中耳胆脂瘤上皮增生中扮演了重要角色。Schilling[25]运用免疫组化技术研究发现，在中耳胆脂瘤上皮中IL-1的染色强度明显高于正常外耳道上皮，并且上皮细胞各层次强度相同，Kakiuchi等[26]进一步利用Western杂交技术研究发现角质细胞只产生IL-1-α，证实了IL-1-α在中耳胆脂瘤上皮中的高表达，同时，Bujia等[27、28]也对中耳胆脂瘤上皮中IL-1-R及IL-1-RA(白介素-1受体拮抗剂)的表达进行了研究，他们发现在中耳胆脂瘤上皮中IL-1-R表达增加，但其IL-1RA表达明显减少。因此不难看出，正是由于IL-1-RA表达的减少，IL-1及IL-1-R表达的大量增加，通过IL-1与其受体的结合激活相关蛋白激酶，从而发挥其生物功能，促进上皮的增生。
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表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)首先是Coken从雌鼠颌下腺中提取的多功能生长因子。人EGF的分子量为6KDa左右、含有53个氨基酸残基的多肽，对多种细胞是个很强的促细胞分裂因子，其生物学效应是通过和细胞表面专一受体(EGF-R)的相互作用进行，EGF-R的分子为170KDa的跨膜糖蛋白，当EGF与其受体结合后，激活相关酪氨酸激酶，使其它蛋白在酪氨酸残基上磷酸化，产生增殖信号[23]。Kojima[29]等对表皮生长因子及其受体的mRNA在中耳胆脂瘤中表达进行了研究，结果表明，在中耳胆脂瘤中EGF-R的mRNA出现在基底层细胞中，而在正常外耳道上皮中则没有，相反，在正常外耳道上皮中EGF的mRNA的信号在基底层细胞被观察到，而在中耳胆脂瘤中上皮全层均有其信号。正是由于中耳胆脂瘤上皮中EGF-R的表达异常，导致了角质细胞的异常增生。
转移生长因子α(TGF-α)是EGF-R的配体，也是一种角质细胞生长因子，它的氨基酸序列有0%到40%与EGF同源，能与EGF-R结合促进多种细胞的增生[23]。Shulz等[30]曾对TGF-α在中耳胆脂瘤上皮中的表达进行了研究认为其参与了中耳胆脂瘤上皮细胞的增生。为此，Shiwa等[31]作了进一步探讨，他们发现TGF-α蛋白在中耳胆脂瘤上皮和外耳道中分布相似，但其mRNA的分布却存在明显差异，在中耳胆脂瘤中TGF-α的mRNA出现在基底层、颗粒层细胞中，而正常外耳道上皮中仅基底层细胞中有表达，同时，他们也发现基底下的炎性组织中也有EGF-α的表达，进而认为，TGF-α通过自分泌及旁分泌途径促进了上皮细胞的增生。
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肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子，根据结构和来源分为两种类型TNF-α和TNF-β，它们具有相似的分子结构，并且可以与同一受体结合，发挥相似的生物学功能。它们均可以由角化细胞分泌[22]。Yan等[32]首先报告TNF-α存在于中耳胆脂瘤上皮中，他们发现TNF-α主要分布在中耳胆脂瘤上皮的基底层及以上层次的细胞中，上皮下的炎性细胞中亦存在，紧接着利用细胞体外培养的方法对TNF-α在基底层角质细胞的增生、分化中所起的作用进行了研究，结果发现，TNF-α能刺激细胞的增生、蛋白合成及细胞终末分，从而增加了角化碎片的产生。因为TNF-β与TNF-α可以竞争同一受体而产生相似的生物学活性，因此Yan等人[33]利用同一种方法对TNF-β在中耳胆脂瘤形成和发展过程中的作用进行了研究，得到了相似的结果。由此看出，TNF-α和TNF-β在中耳胆脂瘤中发挥着相似的生物学功能，共同促进中耳胆脂瘤上皮细胞的增生与凋亡。
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热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)普遍存在于从细菌到人类的整个生物界，其家庭成员依其分子量而命名。其中HSP60和HSP70是目前研究得比较深入、全面的两种热休克蛋白，它们是许多蛋白的拆叠、亚基的形成、运输及降解所必需的，它们亦因此被称为分子伴侣[34](molecular chaperone)。Shinoda等[34]研究发现HSP60和HSP70在中耳胆脂瘤上皮细胞浆中大量表达，通过阻碍胞质内蛋白早熟折叠和不适当聚合，保证了角质细胞加快合成蛋白质的速度。促进了角质细胞的增生。同时Shinoda等[35]也发现HSP70高浓度聚集在中耳胆脂瘤上皮细胞的胞核中，LaThangue[36]通过实践证明HSP70的核堆积在增殖细胞中提高，这进一步说明了HSP70与中耳胆脂瘤上皮细胞的增殖活动有关。中耳胆脂瘤独特的病理特征为角化碎片的累积，这是由于角质细胞增殖、分化、凋亡而引起的。Shinoda[35]认为HSP70不仅参与了中耳胆脂瘤上皮细胞的增殖调节，而且也参与了其凋亡调控。研究表明，HSP70有稳定p53蛋白的作用[37]，正是由于HSP70及其它蛋白质稳定了p53蛋白，使其在中耳胆脂瘤上皮颗粒层细胞中大量表达，从而诱导了细胞的凋亡[38]。
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角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)是成纤维细胞生长因子家庭中的一员(成纤维细胞生长因子7)。在作用于上皮细胞的因子中，KGF是一种旁分泌生长因子，它不仅能刺激成纤维细胞的增生，也能作用于上皮细胞直接决定其增生和分化[39]。Kojima[40]证实了KGF在中耳胆脂瘤上皮下相连组织的成纤维细胞中的异常表达，并认为KGF以旁分泌的方式参与了中耳胆脂瘤上皮增生调节。
此外还有多种因子参与了中耳胆脂瘤的临床进展，如IL-6、INF、PDGF、TGF-β等。当然它们所起的作用并不是孤立的，而是通过互相作用、以复杂的网络共同调节着中耳胆脂瘤上皮细胞的增生、分化与凋亡。
3 癌基因在中耳胆脂瘤上皮中的表达及中，耳胆脂瘤上皮细胞增生与凋亡调控机制
细胞的增生和凋亡受机体外多种因素的影响。细胞内基因变化直接调控着增生与凋亡的发生和发展，细胞外部的因素通过信号传递影响细胞内基因表达而起间接调控作用。目前在中耳胆脂瘤中研究较多的基因有C-myc、p53、C-jun和C-ras。
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在细胞的增生和凋亡调控中C-myc是一个重要的相关基因。虽然C-myc蛋白作为转录因子的作用机理还不十分清楚，但它在增殖调控中的重要作用，以及在生长抑制的条件下也可诱导凋亡的作用得到了证实。因此，C-myc被认为是具有诱导增生和凋亡双重作用的基因。其作用的选择是由其它信号决定的(如生长因子的存在或其它存活刺激)。它所引起的效应是细胞类型和刺激特异的，并不是所有类型的凋亡诱导所必需的。C-myc的表达和生长因子的获得与否决定了细胞的状态，生长抑制(C-myc不表达，生长因子缺如)、增殖(C-myc表达，生长因子存在)、凋亡(C-myc表达，生长因子缺如)[41，42]。研究表明C-myc 蛋白产物在中耳胆脂瘤上皮的基底层及以上细胞中大量表达，其核染阳性率为38.3%，远高于正常外耳道上皮，证实了C-myc在中耳胆脂瘤上皮细胞增生与凋亡调控中起重要作用[43]。
p53基因有野生型(wt)和突变型(mt)两种，Wtp53编码的蛋白监控，维持着基因组的完整性。如果DNA受损，p53使细胞周期停滞去G1期，便于DNA修复。若修复失败，p53则诱发凋亡[44]。C-jun基因编码的蛋白可以形成同源二聚体，也可与C-fos的表达产物形成二聚体。在特定靶细胞中，Fos-Jun或Jun-Jun二聚体组成的多样性可能决定某些特异基因的转录[45，46]。Shinoda[38]等人发现Wtp53表达于中耳胆脂瘤上皮的颗粒细胞层膜核中，C-jun蛋白则存在于上皮的基底层和棘细胞层中，这正好与中耳胆脂瘤上皮的增生和凋亡情况相符。
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Ras蛋白作为一种鸟苷酸(GTP)结合蛋白，在许多细胞的增生和分化中起信号转导作用，Hung等[47]发现了ras蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的表达，对中耳胆脂瘤上皮细胞的增生和凋亡机制作了探讨。他们认为胞外的一些信号(如一些生长因子EGF、PDGF、GM-CSF等)和胞膜上的受体结合，激活胞内的相关酪氨酸酶，这些酶再激Ras蛋白，进而激活有丝分裂原活化的蛋白激酶，信号传到胞核，通过核内的转录因子C-jun调节基因的表达和蛋白的合成。而胞外的另一些信号(如干扰素)转移生长因子β则刺激另一些基因的表达(如p53)介导细胞的凋亡，从而产生大量的角化碎片。
4 展望
综上所述，中耳胆脂瘤是一种上皮高度增生性疾病，并伴有角化磷片的累积，多种细胞因子及生长因子、癌基因参与了上皮细胞增生与凋亡的调控。虽然目前各种因子在中耳胆脂瘤的形成和发展过程中究竟起到了什么具体作用、其确切的机制又是什么还不十分清楚，但是随着科学技术的发展，这些疑团一定会被破解，而这一问题的解决必将对中耳胆脂瘤的预防、诊断、治疗起着巨大的推动作用。
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参考文献
1，Moll R,Franke WW,Schiller DL,et al.The catalog of human cytokeratins patterns of expression in normal epithelia,tumors and cultured cells[J].Cell,1982;31:11
2，Sun T-T,Eichner R,Schermer A,et al.Classification,xpression,and possible mechanisms of evolution of manmalian epithelial keratins:a unifying model[A].In:Levine AJ,Vande Wonde GF,Topp WC,Watson JD,eds.Cancer cells 1/The transformed phenotype[M].Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory,1984:169～176
, 百拇医药
3，Weiss RA,Eichner R,Sun T-T.Monoclonal antibody analysis of keratin expression in epidermal diserse:a 48-and 56-kdalton keratin as molecular markers for hyperproliferative keratinocytes[J].J cell Biol,1984;98:1397
4，Broekaert D,Coucke P,Leperque S,et al.Immunohistochemical analysis of the cytokeratin expression in middle ear cholesteatoma and related epithelial tissue[J].Ann otol Rhinol Laryngol,1992;101:931
5，Bujia J,Schilling V,Holly A,et al.Hyperproliferation-associated Keratin expression in human middle ear cholseteatoma[J].Acta Otolaryngol (stockh) 1993;113:364
, 百拇医药
6，Sasaki H,Huang CC.Expression of cytokeration 13 and 16 in middle ear cholesteatoma[J].Otolaryngol Head Neck Sury 1994;110:310
7，Sasaki K,Murakami T,Takahashi M.The cell cycle associated change of the Ki-67 reactive nuclear antigen expression[J].J Cell physicol 1987;133:579
8，Ergun S,zheng X,Carlsoo B.Antigen expression of epthelial markers,collagen IV and Ki67 in middle ear chiolesteatoma[J].Acta Otolaryngol.1994;14:295
, http://www.100md.com
9，Cattoretti G,Becker MHG,key G,et al.Monoclonal Antibodies Against recombinant parts of the Ki67 Antigen MIB1 and MIB3 detect proliferating cell in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections[J].J pathol,1992;168:357
10，Gerdes J,Lemke H,Baisch H,et al.Cell cycle Analysis a cell proliferation associated human nuclear antigen defined by the monoclone antibody Ki-67[J].J.Immunl,1984;133:1710
11，Shudhoff H,Bujia J,Holly A,et al.Expression of a cell cycle-Associated nuclear antigen(MIB) in cholesteatoma and Auditory Meatal skin[J].Laryngoscope,1995;105:1227
, http://www.100md.com
12，许昱，金康业，董卫国.Ki67和转化生长因子α在中耳胆脂瘤中的表达[J].中华耳鼻咽喉杂志，1994；34(5)：320
13，Prelich G,Cheng KT,Kostura,et al.Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase-d auxiliary protein[J].Nature,1987;326:517
14，Uchida N,Ito S,Hirano M.Localization of PCNA in aural cholesteatoma[J].Kurume Med J,1993;40:225
15，Tsuruhara,Iwano T,Ushiro K,Proliferative activity of cholesteatoma epithelium[A].In:Nakano Y,ed.Cholesteatoma and Mastoid Surgery[M].Niigate,Japan:Kugler on Ghedini;1993:223～226
, 百拇医药
16，Tanaka Y,Shiwa M,Kojima H,et al.A study on epideymal proliferation abiligy in cholesteatoma[J].laryngoscope,1998;108:537
17，Wyllie AH,Kerr JFR,Currie AR.Cell death:the significance of apoptosis[J].Int Rev Cytol,1980;68:251
18，Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ viaspecific labeling of nuclear DNA Fragmentation[J].The Journal of cell Biology,1992;119:493
, 百拇医药
19，Koba K,Yagi M,Tabe H,et al.Kinetic analysis of cell proliferation using bromodeoxyuridine labeling and in situ detection of dying cells in the tympanic membrane and middle ear cholesteatoma[J].Arch Histol Cytol,1996;59:339
20，Kojima,H,Tanaka Y,Tanaka T,et al.Cell proliferation and apoptisis in human middle ear cholesteatoma[J].Arch Otolaryngol head neck sury,1998;124:261
21，胡继鹰.基础医学细胞生物学[M].武汉：武汉大学出版社，1995：143～144
, 百拇医药
22，毕爱华.医学免疫学[M].北京：人民军医出版社，1995：68～79
23，谭增柔.医学细胞生物学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1992：25～260
24，Kamide Y,Sasaki H,Abramson M,et al.Effects of epidermal Langerhans cell's conditioned medium on Keratinacytes:a role of Langerhans cells in cholesteatoma[J].Am J Otolaryngol,1991;12:307
25，Schilling V,Bujia J,Negri B,et al.Interleukin-1-containing cells in cholesteatoma of the middle ear[J].Laryngouhinootologie,1992;71:271
, 百拇医药
26，Kakiuchi H,Kinoshita K,Katoh Y,et al.Interleukin-1 of cholesteatoma Keratinocytes[J].Ann otol Rhinol Laryngol,1992;157:32
27，Bujia J,Kim C,Ostos P,et al.IL-1 and IL-1-receptor antagonist(IL-1-RA)in middle ear cholesteatoma:an analysis of protein production and biological activety[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,1996;253:252
28，Bujia J,Kim C,Ostos P,et al.Enhanced epithelial proliferation due to elevated levels of Interleukin-1 receptors in middle ear cholesteatoma[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,1997;254:6
, 百拇医药
29，kojima H,Shiwa M,Kamide Y,et al.Expression and Iocalization of mRNA for epidermal growth factor and epidermal growth factor receptor in human cholesteatoma,Acta[J].Otolaryngologica(stockh),1994；114:423
30，Schulz P,Bujia J,Shilling V.Possible autocrine growth stimulation of cholesteatoma epithelium by transforming growth factor alpha[J].American J of Otolaryngology,1993;14:82
31，Shiwa M,Kojima H,Moriyama H.Expression of transforming growth factor-αin cholesteatoma[J].J of laryngology and otology,1998;112:750
, 百拇医药
32，Yan SD,Huang CC.Tumor necrosis factor alpha in middle ear cholesteatoma and its effect on keratinocytes in vitro[J].Ann Otol Rhinol Larygol,1991；100:157
33，Yan SD,Huang CC.Lymphotoxin in human middle ear cholesteatoma[J].Laryngoscope,1991;101:411
34，Pelham HR.Speculations the functions of the major heat shock and glucose regulated proteins[J].Cell,1998;46(7):959
35，Shinoda H,Huang CC.Heat shock protein in middle ear cholesteatoma[J].Otolaryngology Head Neck Surg,1996;114:77
, 百拇医药
36，La Thangue NB.A major heat-shock protein defined by a monoclonal antibody[J].EMBOJ.1984;32:1871
37，Matsumoto H,Shimara M,Omatsu T,et al,p53 protein accumulated by heat stress associate with heat shock proteins HSP 72/HSC 73 in human glioblastoma cell lines[J].Cancer lett 1994;87:39
38，Shinoda H,Huang CC.Expression of c-jun and p53 proteins in human middle ear cholesteatoma:related go keratinocyte proliferation differentiation and programmed cell death[J].Laryngoscope,1995；105:1232
, 百拇医药
39，Finch PW,Rubin JS,Miki T,et al.Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth[J].Science,1989；245:752
40，Kojima H,Matsuhisa A,Shiwa M,et al.Expression of Messenger RNA for Kerationocyte growth factor in human cholesteatoma[J].Arch otolaryngol head neck surg,1996;123:157
41，Williams GT,Smith CA.Molecular regulation of apoptosis:genetic controls on cell death[J].Cell,1993;74:777
, 百拇医药
42，Evan GT,Wyllie AH,Gilbert CS,et al.Induction of apoptosis by c-myc protein[J].Cell,1992；41：119
43，Holly A,Sittinger M,Bujia J.Immunohistochemical detection of c-myc proto-oncogene products in middle ear cholesteatoma[J].Laryngorhinootologie,1995；74:348
44，Lovine A,Moman J,Finlay CA.The p53 Tumor Suppressor Gene[J].Nature,1991;351:452
45，Angel P,Allegretto EA,Okino ST,et al.Oncogene jun encodes a sequencen-specifictrans-activator similar to AP-1[J].Nature,1988；322:166
46，Eagen SE,Weinberg RA.The pathway to signal achievement[J].Nature,1993;365:781
47，Huang CC,Chen CT,Huang TS,et al.Mediation of signal transductive in keratinocytes of human middle ear cholesteatoma by ras protein[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,1996;253:385, 百拇医药