卡托普利对实验性心肌再灌注损伤细胞内离子浓度的影响
作者：陈江斌 黄从新 孙小梅 李庚山 许家俐
单位：湖北医科大学附属第一医院 武汉 430060
关键词：
重庆医学000272 卡托普利(Captopril)是竞争性血管紧张素转换酶抑制剂，具 有抑制血管紧张素Ⅰ转换成血管紧张素Ⅱ，临床上已广泛用于心肌梗塞、高血压和心力衰竭 的治疗[1，2]。本研究从大鼠分离的、耐钙的心肌细胞模型上观察卡托普利对缺氧 -复氧损伤的保护作用，旨在为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 大鼠耐钙心肌细胞的分离 主要根据Luc Ver Donck和Farmer的方法并 作改良[3，4]。Wistar大鼠(湖北医科大学实验动物中心提供)，体重200～250g， 禁食16小时，术前半小时腹腔注射肝素5000u抗凝血，猛击头部致昏，迅速开胸取出心脏 悬挂 于Langendorff灌流装置上，灌注液流速8ml/分钟。先用含Ca2+1.25mmol/L的Krebs- Hense leit(K-H)液灌流15分钟，然后换上含Ca2+20μmol/L的K-H液灌流5分钟，加入0.0 2 %的Ⅰ型胶原酶(Sigma Co.产)循环灌流5小时，将含酶灌流液中的Ca2+提高至浓度为 50μmol/L，再灌流5分钟。此时，可见心脏比原来膨胀20%～30%，呈樱桃色。从灌流架上取 下 心脏，剪取心室肌置于硅化的小三角瓶内，在含50μmol/LCa2+的低钙K-H液中冲洗 二次，用眼科手术剪剪碎心肌组织，置于震荡孵化器上，在含2%牛血清白蛋白(Sigma Co.产 )的低钙K-H液中孵化5分钟，持续通以95%O2和5%CO2的混合气体，过滤后剩余的心肌组 织继续在含2%牛血清白蛋白的低钙K-H液中孵化5分钟，共三次。收集滤液，初次弃去不用 。 收集的滤液在室温下加入低钙K-H液离心洗三次，分离的心肌细胞置于低钙K-H液中，缓慢 复钙至Ca2+为1.25mmol/L，室温下贮存。
, 百拇医药
1.2 溶液与药品 K-H液(mmol/L)：NaCl 118，KCl 4.74，CaCl2 1.25 ，NaH2PO40.93，HEPES 5，Glucose 5，MgSO41.2，用NaOH调至pH为7.3；低钙K-H液 除CaCl2浓度改变外，其余成分与正常K-H液相同，未注明钙离子浓度的低钙K-H液含Ca 2+50μmol/L。溶液成分除HEPES为SigmaCo.产品外，均为国产分析纯。卡托普利注 射液由江苏常州制药厂提供。
1.3 实验方法 分离出的心肌细胞在室温下稳定30分钟后，分别置于硅化 试 管中，调节细胞浓度为6×105/2ml。将实验分为9组，每组两个平行管。(1)不缺氧组心肌 细胞悬液中通以95%O2与5%CO2的混合气体，于震荡孵化器37℃孵化40分钟。(2)单纯缺 氧 组：心肌细胞悬液中通以95%N2与5%CO2的混合气体，孵化20分钟。(3)对照组：缺氧孵 化 20分钟后，复氧(通以95%O2与5%CO2的混合气体)孵化20分钟。(4)～(9)组：缺氧-复氧 孵 化条件同(3)组，心肌细胞悬液中分别含卡托普利0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6μmol/L 。
, 百拇医药
1.4 观察指标 (1)台盘兰排斥试验计算杆形心肌细胞百分比。(2)心肌细 胞内K+/Na+及Ca2+浓度由原子吸收分光光度计测定含量。
2 结 果
7次实验，分离的大鼠心肌细胞在含钙1.25mmol/L的K-H液中，大于80%的细胞是静止的。不 缺氧组细胞孵化40分钟，心肌细胞的生存率，心肌细胞内K+/Na+及Ca2+浓度 无 明显变化。单纯缺氧20分钟，心肌细胞的生存率、心肌细胞内K+/Na+浓度比降低，Ca 2+浓度增加；复氧20分钟对心肌细胞造成更严重的损伤，心肌细胞的生存率、K+ / Na+浓度比下降更显著，Ca2+浓度进一步增加(较复氧前)；卡托普利0.05、0.1μ mol/L对缺氧-复氧造成的损伤无明显作用(P>0.05)，0.2、0.4、0.8和1.6μmol/L能明 显抑制心肌细胞缺氧-复氧过程中上述指标的变化，且随着剂量的增加，抑 制作用增强，提示其对心肌细胞具有直接保护作用，见表1。
, 百拇医药
表1 卡托普利对缺氧-复氧心肌细胞生存率、细胞内K+/Na+及Ca 2+浓度的影响(
±s，n=7) 组 别
生存率(%)
P值
K+/Na+
P值
Ca2+(nmol/mg.pr)
P 值
, 百拇医药
实验前值
76.5±1.0
5.8±0.7
17.2±0.4
不缺氧组
74.1±0.9
>0.05*
5.5±0.8
>0.05*
17.8±0.3
>0.05*
, 百拇医药 缺氧组
51.1±1.2
<0.01*△
1.5±0.2
<0.01*△
20. 1±0.3
<0.01*△
复氧组
(μmol/L)
对照组
35.6±1.6
<0.01**
, 百拇医药
0.8±0.1
<0.01**
22.8 ±0.5
<0.01**
卡托普利0.05
36.9±1.6
>0.05△△
0.9±0.1
>0.05△△
21.9±0.4
>0.05△△
, 百拇医药
卡托普利0.1
39.3±1.7
>0.05△△
1.1±0.1
>0.05△△
20.8±0.6
>0.05△△
卡托普利0.2
45.3±1.9
<0.01△△
1.9±0.3
, 百拇医药
<0.01△△
18.5±0.4
<0.01△△
卡托普利0.4
47.8±1.7
<0.01△△
2.4±0.5
<0.01△△
17.5±0.5
<0.01△△
卡托普利0.8
, 百拇医药
49.8±1.8
<0.01△△
2.7±0.6
<0.01△△
16.6±0.3
<0.01△△
卡托普利1.6
52.6±1.6
<0.01△△
3.1±0.7
<0.01△△
, http://www.100md.com
15.2±0.4
<0.01△△
注：*与实验前值相比，*△与不缺氧组相比，**与缺氧组相比 ，△△与对照组相比
3 讨 论
心肌细胞在急性缺血的状态下会影响心肌细胞的能量代谢，遭到缺血一定时间后恢复心肌细 胞的血供，细胞损伤由于氧自由基及细胞内钙离子过分聚集等因素反而进行性加重，出现缺 血心肌细胞的再灌注损伤。心肌细胞的缺氧-复氧损伤与心肌细胞的缺血-再灌注损伤具有 相似的病理生理机制[5]。本实验大鼠心肌细胞缺氧20分钟后，生存率和细胞内K +/Na+降低、Ca2+浓度增加，这可能与缺氧造成细胞膜的通透性增加和细胞能量 缺乏，细胞内酸中毒，能量依赖性Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-AT P酶活性明显降低，细胞膜内外离子转运功能减退，细胞外K+不能转运入细胞内，H+ -Na+交换活跃，Na+过多地滞留细胞内，且通过Na+-Ca2+交换，增加细 胞内的Ca2+积聚等有密切关系[6]。由于缺血所致线粒体功能紊乱，细胞能 量生成不足，是缺血心肌细胞不可逆损伤的最主要因素[7]。缺氧-复氧后细胞出 现进行性挛缩，杆形细胞生存率和细胞内K+/Na+较缺血期进一步降低，Ca2+ 浓度较缺氧期显著增加，这表明缺氧-复氧后造成的损伤较缺氧期进一步加重，这些结果支 持缺血细胞的能量供应和抑制细胞内Ca2+的积聚，对于防止心肌细胞的缺氧-复氧 损伤具有重要意义。另外，因缺血造成儿茶酚胺类物质浓度升高可使心肌细胞膜的通透性发 生改变，钾离子漏出细胞，钠离子大量进入细胞内，心肌细胞膜容许钙离子通过的慢钙通道 开放数量增多，使细胞内的钙离子浓度增高，导致细胞内钙离子超负荷，将因离子转运泵的 功能降低，离子转运所依赖的ATP酶过度兴奋而导致心肌细胞坏死[8]。应用卡托普 利在细胞水平上直接观察其对缺氧-复氧损伤心肌细胞的保护作用，用其灌流心肌细胞后， 缺氧-复氧造成的损伤明显减轻，随着卡托普利剂量的增加，心肌细胞的生存率亦增加，细 胞内K+/Na+值逐渐升高，Ca2+进一步下降，它的机制可能与改善心肌细胞的 能量代谢，抑制细胞内Ca2+的积聚有关，其具体机制有待于进一步研究。本实验结 果提示卡托普利对冠状动脉急性阻塞后再通的心肌具有保护作用，能减轻再灌注对心肌的损 伤，提高心肌细胞的存活率。■
, 百拇医药
参考文献：
[1]陆德澄，侯建民，汤水祥，等.静脉注射卡托普利和酚妥拉明治疗重症高血压病 的比较.新药与临床，1996，15:328
[2]郭向阳，除守春，罗爱伦，等.卡托普利对心肌高能磷酸化合物代谢的影响.中 华胸心血管外科杂志，1998，14:42
[3]王军，章鲁，齐建华，等.不同年龄SHR心肌细胞内游离钙浓度和心肌组织NE含 量的变化.中国高血压杂志，1995，3:104
[4]Farmer BB,Gierman LD.Isolation of calcium-tolerant myocytes from adul t rat-hearts.Life Sci,1983,33:1
[5]Barunwald E,Stone FM,Binditt DG,et al.Myocardial reperfusion:A double edged sward.J Clin Invest,1985,76:1713
, 百拇医药
[6]Editorial Comment.The calcium paradox:a role for[Na]i A cell ular or tissue basis;a property unique to the Langendroff persued heart?A bundle of con tradications!J Mol Cell Cardiol,1991,23:773
[7]Cheung JY,Cabrol C,Fabiato A,et al.Mitochondrial function and intracel lular calcium in anoxic cardiac myocytes.Am J Physiol,1986,250:18
[8]Fleckenstern A,Husle JE.History of calcium antagonists.Circ Res,1983,52:1, 百拇医药
单位：湖北医科大学附属第一医院 武汉 430060
关键词：
重庆医学000272 卡托普利(Captopril)是竞争性血管紧张素转换酶抑制剂，具 有抑制血管紧张素Ⅰ转换成血管紧张素Ⅱ，临床上已广泛用于心肌梗塞、高血压和心力衰竭 的治疗[1，2]。本研究从大鼠分离的、耐钙的心肌细胞模型上观察卡托普利对缺氧 -复氧损伤的保护作用，旨在为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 大鼠耐钙心肌细胞的分离 主要根据Luc Ver Donck和Farmer的方法并 作改良[3，4]。Wistar大鼠(湖北医科大学实验动物中心提供)，体重200～250g， 禁食16小时，术前半小时腹腔注射肝素5000u抗凝血，猛击头部致昏，迅速开胸取出心脏 悬挂 于Langendorff灌流装置上，灌注液流速8ml/分钟。先用含Ca2+1.25mmol/L的Krebs- Hense leit(K-H)液灌流15分钟，然后换上含Ca2+20μmol/L的K-H液灌流5分钟，加入0.0 2 %的Ⅰ型胶原酶(Sigma Co.产)循环灌流5小时，将含酶灌流液中的Ca2+提高至浓度为 50μmol/L，再灌流5分钟。此时，可见心脏比原来膨胀20%～30%，呈樱桃色。从灌流架上取 下 心脏，剪取心室肌置于硅化的小三角瓶内，在含50μmol/LCa2+的低钙K-H液中冲洗 二次，用眼科手术剪剪碎心肌组织，置于震荡孵化器上，在含2%牛血清白蛋白(Sigma Co.产 )的低钙K-H液中孵化5分钟，持续通以95%O2和5%CO2的混合气体，过滤后剩余的心肌组 织继续在含2%牛血清白蛋白的低钙K-H液中孵化5分钟，共三次。收集滤液，初次弃去不用 。 收集的滤液在室温下加入低钙K-H液离心洗三次，分离的心肌细胞置于低钙K-H液中，缓慢 复钙至Ca2+为1.25mmol/L，室温下贮存。
, 百拇医药
1.2 溶液与药品 K-H液(mmol/L)：NaCl 118，KCl 4.74，CaCl2 1.25 ，NaH2PO40.93，HEPES 5，Glucose 5，MgSO41.2，用NaOH调至pH为7.3；低钙K-H液 除CaCl2浓度改变外，其余成分与正常K-H液相同，未注明钙离子浓度的低钙K-H液含Ca 2+50μmol/L。溶液成分除HEPES为SigmaCo.产品外，均为国产分析纯。卡托普利注 射液由江苏常州制药厂提供。
1.3 实验方法 分离出的心肌细胞在室温下稳定30分钟后，分别置于硅化 试 管中，调节细胞浓度为6×105/2ml。将实验分为9组，每组两个平行管。(1)不缺氧组心肌 细胞悬液中通以95%O2与5%CO2的混合气体，于震荡孵化器37℃孵化40分钟。(2)单纯缺 氧 组：心肌细胞悬液中通以95%N2与5%CO2的混合气体，孵化20分钟。(3)对照组：缺氧孵 化 20分钟后，复氧(通以95%O2与5%CO2的混合气体)孵化20分钟。(4)～(9)组：缺氧-复氧 孵 化条件同(3)组，心肌细胞悬液中分别含卡托普利0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6μmol/L 。
, 百拇医药
1.4 观察指标 (1)台盘兰排斥试验计算杆形心肌细胞百分比。(2)心肌细 胞内K+/Na+及Ca2+浓度由原子吸收分光光度计测定含量。
2 结 果
7次实验，分离的大鼠心肌细胞在含钙1.25mmol/L的K-H液中，大于80%的细胞是静止的。不 缺氧组细胞孵化40分钟，心肌细胞的生存率，心肌细胞内K+/Na+及Ca2+浓度 无 明显变化。单纯缺氧20分钟，心肌细胞的生存率、心肌细胞内K+/Na+浓度比降低，Ca 2+浓度增加；复氧20分钟对心肌细胞造成更严重的损伤，心肌细胞的生存率、K+ / Na+浓度比下降更显著，Ca2+浓度进一步增加(较复氧前)；卡托普利0.05、0.1μ mol/L对缺氧-复氧造成的损伤无明显作用(P>0.05)，0.2、0.4、0.8和1.6μmol/L能明 显抑制心肌细胞缺氧-复氧过程中上述指标的变化，且随着剂量的增加，抑 制作用增强，提示其对心肌细胞具有直接保护作用，见表1。
, 百拇医药
表1 卡托普利对缺氧-复氧心肌细胞生存率、细胞内K+/Na+及Ca 2+浓度的影响(
±s，n=7) 组 别生存率(%)
P值
K+/Na+
P值
Ca2+(nmol/mg.pr)
P 值
, 百拇医药
实验前值
76.5±1.0
5.8±0.7
17.2±0.4
不缺氧组
74.1±0.9
>0.05*
5.5±0.8
>0.05*
17.8±0.3
>0.05*
, 百拇医药 缺氧组
51.1±1.2
<0.01*△
1.5±0.2
<0.01*△
20. 1±0.3
<0.01*△
复氧组
(μmol/L)
对照组
35.6±1.6
<0.01**
, 百拇医药
0.8±0.1
<0.01**
22.8 ±0.5
<0.01**
卡托普利0.05
36.9±1.6
>0.05△△
0.9±0.1
>0.05△△
21.9±0.4
>0.05△△
, 百拇医药
卡托普利0.1
39.3±1.7
>0.05△△
1.1±0.1
>0.05△△
20.8±0.6
>0.05△△
卡托普利0.2
45.3±1.9
<0.01△△
1.9±0.3
, 百拇医药
<0.01△△
18.5±0.4
<0.01△△
卡托普利0.4
47.8±1.7
<0.01△△
2.4±0.5
<0.01△△
17.5±0.5
<0.01△△
卡托普利0.8
, 百拇医药
49.8±1.8
<0.01△△
2.7±0.6
<0.01△△
16.6±0.3
<0.01△△
卡托普利1.6
52.6±1.6
<0.01△△
3.1±0.7
<0.01△△
, http://www.100md.com
15.2±0.4
<0.01△△
注：*与实验前值相比，*△与不缺氧组相比，**与缺氧组相比 ，△△与对照组相比
3 讨 论
心肌细胞在急性缺血的状态下会影响心肌细胞的能量代谢，遭到缺血一定时间后恢复心肌细 胞的血供，细胞损伤由于氧自由基及细胞内钙离子过分聚集等因素反而进行性加重，出现缺 血心肌细胞的再灌注损伤。心肌细胞的缺氧-复氧损伤与心肌细胞的缺血-再灌注损伤具有 相似的病理生理机制[5]。本实验大鼠心肌细胞缺氧20分钟后，生存率和细胞内K +/Na+降低、Ca2+浓度增加，这可能与缺氧造成细胞膜的通透性增加和细胞能量 缺乏，细胞内酸中毒，能量依赖性Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-AT P酶活性明显降低，细胞膜内外离子转运功能减退，细胞外K+不能转运入细胞内，H+ -Na+交换活跃，Na+过多地滞留细胞内，且通过Na+-Ca2+交换，增加细 胞内的Ca2+积聚等有密切关系[6]。由于缺血所致线粒体功能紊乱，细胞能 量生成不足，是缺血心肌细胞不可逆损伤的最主要因素[7]。缺氧-复氧后细胞出 现进行性挛缩，杆形细胞生存率和细胞内K+/Na+较缺血期进一步降低，Ca2+ 浓度较缺氧期显著增加，这表明缺氧-复氧后造成的损伤较缺氧期进一步加重，这些结果支 持缺血细胞的能量供应和抑制细胞内Ca2+的积聚，对于防止心肌细胞的缺氧-复氧 损伤具有重要意义。另外，因缺血造成儿茶酚胺类物质浓度升高可使心肌细胞膜的通透性发 生改变，钾离子漏出细胞，钠离子大量进入细胞内，心肌细胞膜容许钙离子通过的慢钙通道 开放数量增多，使细胞内的钙离子浓度增高，导致细胞内钙离子超负荷，将因离子转运泵的 功能降低，离子转运所依赖的ATP酶过度兴奋而导致心肌细胞坏死[8]。应用卡托普 利在细胞水平上直接观察其对缺氧-复氧损伤心肌细胞的保护作用，用其灌流心肌细胞后， 缺氧-复氧造成的损伤明显减轻，随着卡托普利剂量的增加，心肌细胞的生存率亦增加，细 胞内K+/Na+值逐渐升高，Ca2+进一步下降，它的机制可能与改善心肌细胞的 能量代谢，抑制细胞内Ca2+的积聚有关，其具体机制有待于进一步研究。本实验结 果提示卡托普利对冠状动脉急性阻塞后再通的心肌具有保护作用，能减轻再灌注对心肌的损 伤，提高心肌细胞的存活率。■
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参考文献：
[1]陆德澄，侯建民，汤水祥，等.静脉注射卡托普利和酚妥拉明治疗重症高血压病 的比较.新药与临床，1996，15:328
[2]郭向阳，除守春，罗爱伦，等.卡托普利对心肌高能磷酸化合物代谢的影响.中 华胸心血管外科杂志，1998，14:42
[3]王军，章鲁，齐建华，等.不同年龄SHR心肌细胞内游离钙浓度和心肌组织NE含 量的变化.中国高血压杂志，1995，3:104
[4]Farmer BB,Gierman LD.Isolation of calcium-tolerant myocytes from adul t rat-hearts.Life Sci,1983,33:1
[5]Barunwald E,Stone FM,Binditt DG,et al.Myocardial reperfusion:A double edged sward.J Clin Invest,1985,76:1713
, 百拇医药
[6]Editorial Comment.The calcium paradox:a role for[Na]i A cell ular or tissue basis;a property unique to the Langendroff persued heart?A bundle of con tradications!J Mol Cell Cardiol,1991,23:773
[7]Cheung JY,Cabrol C,Fabiato A,et al.Mitochondrial function and intracel lular calcium in anoxic cardiac myocytes.Am J Physiol,1986,250:18
[8]Fleckenstern A,Husle JE.History of calcium antagonists.Circ Res,1983,52:1, 百拇医药