流式细胞仪双标法分析白血病相关复合物及预后价值
作者：于桂芬 殷晓华 程美兰 胡赛鹏 张泽国 尉达民 王良绪
单位：于桂芬(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院 牡丹江，157003)；殷晓华(牡丹江市红旗医院)；程美兰(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院 牡丹江，157003)；胡赛鹏(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院 牡丹江，157003)；张泽国(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院 牡丹江，157003)；尉达民(北京医科大学第三临床医学院)；王良绪(北京医科大学第三临床医学院)
关键词：
临床血液学杂志000216 应用流式细胞仪免疫荧光双标法检测18例急性白血病(AL)，对照11例骨髓单个核细胞(MNC)或外周血干细胞移植术(PBSCT)时采集的外周血干细胞(PBSCS)的白血病相关复合物表达情况〔其中急性髓细胞白血病(AML)以CD34/CD56复合物为标志，急性淋巴细胞白血病(ALL)及急性未分化细胞白血病(AUL)以CD34/CD56，CD19/CD34，CD19/CD33，CD19/CD56复合物为标志探讨这些白血病相关复合物对AL的预后价值。
, 百拇医药
1 病例和方法
1.1 病例来源
18例AL患者包括AML 15例(M28例，M37例)，ALL-L22例，AUL 1例。男6例，女12例。年龄18～60岁。采集标本28份，其中2份来自PBSCT时采集之PBSCS，26份为骨髓标本。对照组取自非白血病(NL)患者的骨髓标本，共采标本11份(大致正常4例，小细胞低色素性贫血4例，巨幼红细胞贫血1例，原发性血小板减少性紫癜2例)。男7例，女4例。年龄29～69岁。AML以DA方案(柔红霉素、阿糖胞苷)化疗，ALL、AUL以DVCP方案(柔红霉素、长春新碱、环磷酰胺、泼尼松)化疗。其中6例为PBSCT术者。疗效判断依据1987年全国白血病化疗讨论会制定的标准。
1.2 抗原标志
无菌操作取抗凝骨髓或PBSCT术时采集之PBSCS 1～3 ml，分离MNC。取1×106 MNC分装于50 μl小离心管内，离心(5 000 r/min×30 s)，弃上清。根据待检免疫复合物配对，分别于相应小离心管内加入相应直标单克隆抗体，其中CD-34FITC、CD-56PE、CD-19cychrome(美国Pharmigen公司)各20 μl，CD-33PE(美国BD公司)10 μl，加毕后轻轻振荡混匀，置冰箱4℃30 min后取出，PBS洗液清洗2次后，加保存液1 ml，4℃冰箱保存待上机。对照组标本以同样方法制备。
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1.3 流式细胞仪双荧光法分析膜抗原标志
采用FACS can流式细胞仪(BD公司)分析，FACS激光功率15 mv，激发光波长488 nm，第1荧光探测器收集通过530 nm带滤光片的绿色荧光(FL1)，第2荧光探测器收集通过586 nm带滤光片的橙色荧光(FL2)、第3荧光探测器收集通过620 nm带滤光片的红色荧光(FL3)，分别反映FITC、PE及cychrome的荧光强度。用Autocomp软件结合CALIBRITE Beads检正仪器，采用LYSIS Ⅱ软件分析，每次读取10 000个细胞。
1.4 统计学处理
采用F检验、Q检验或秩和检验。
2 结果
2.1 对照组、完全缓解(CR)组AL白血病相关复合物的检测结果
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动态观察18例AL患者，13例CR者，5例患者复发或死亡。11例对照CD+19/CD+34、CD+19/CD+56、CD+19/CD+33检测结果见表1。对照组及CR组(包括化疗CR组及PBSCT CR组)CD+34/CD+56复合物及CD+34单阳细胞检测结果及统计学分析结果见表2。
表1 11例对照检测结果
，% 项目
CD+19/CD+56
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CD+19/CD+33
CD+19/CD+34
gate值
0.70±0.16
0.35±0.12
0.20±0.10
total值
0.29±0.11
0.17±0.06
0.10±0.04
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表2 对照组、化疗CR组、PBSCT CR组CD+34/CD+56、CD+34检测结果，% 项目
对照组
化疗CR组
PBSCT CR组
P值
CD+34/CD+56
gate值
total值
, 百拇医药
0.2591±0.1099
0.0682±0.0231
0.1800±0.0459
0.0911±0.0210
0.0550±0.0290
0.0350±0.0253
>0.20
>0.20
CD+34
gate值
total值
, 百拇医药
1.9360±0.3201
0.2818±0.0831
1.5733±0.3842
0.8400±0.2126
1.4475±1.1113
1.1850±0.9973
>0.50
>0.10
由表1可见，CD+19/CD+56、CD+19/CD+33、CD+19/CD+34于对照组中表达率很低，各组gate值均<1.0%，total值均<0.5%。表2可见，CD+34/CD+56表达率于对照组、化疗CR组、PBSCT CR组gate值<0.5%，total值<0.1%。CD+34单阳细胞表达率于各组gate值<2.5%，total值<0.5%。各组CD+34/CD+56及CD+34表达率差异无统计学意义。
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2.2 复发或死亡患者白血病相关复合物检测结果
5例临床预后差的患者及1例PBSCT术后CR患者，白血病相关复合物检测结果及相关临床资料见表3。①CD+34/CD+56复合物：1，2为M2患者，检出有CD+34/CD+56高表达，较对照gate值及total值均升高>10倍，其中例1 gate值升高>130倍，total值升高>239倍。此2例患者化疗均不敏感。例1诊断后3个月死亡，例2复发后多次化疗均未缓解。例3，4分别为AUL、ALL-L2患者，其CD+34/CD+56表达率较对照无明显升高。例5，6为PBSCT术者，其PBSCS CD+34/CD+56表达率亦无明显升高。②CD+34单阳细胞：例2，3，4，5，6均检出CD+34单阳细胞高表达，gate值升高>1.3倍，total值升高>8倍，其中例5，6标本来自PBSCS。此5例患者前4例复发或复发后持续未缓解，例6仍CR。③CD+19/CD+33，CD+19/CD+56，CD+19/CD+34复合物：例3复发状态、例4 CR状态时，检测骨髓细胞CD+19/CD+33，CD+19/CD+56，CD+19/CD+34表达率升高，较对照gate值分别升高>3，9，6倍，total值分别升高>5，18，15倍，检测3个月后，例4复发，例3复发后多次化疗均未缓解。例5 PBSCS检出有CD+19/CD+33高表达，较对照gate值升高69倍，total值升高76倍。PBSCT术后3个月的患者复发。表3 白血病临床资料及相关复合物测定结果 % 病例
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诊断
标本
来源
检测
状态
预后
CD+34/CD+56
CD+34
CD+19/CD+56
CD+19/CD+34
, 百拇医药
CD+19/CD+33
gate
total
gate
total
gate
total
gate
total
gate
total
1
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M2
BM
初发
死亡
47.44
21.89
1.86
0.86
2
M2
BM
复发
NP
, 百拇医药
4.02
2.94
36.38
24.61
3
AUL
BM
复发
NP
0.50
0.28
26.93
15.14
, 百拇医药
2.51
1.41
26.97
15.98
2.22
1.19
4
L2
BM
CR
复发
0.19
0.17
, 百拇医药
2.94
2.76
14.08
12.97
2.29
2.15
1.28
1.20
5
L2
PBSCS
CR
复发
, 百拇医药
0.29
0.14
8.84
4.08
0.16
0.11
0.04
0.02
32.64
17.39
6
M3
PBSCS
, 百拇医药
CR
CR
0.30
0.13
6.54
2.92
3 讨论
3.1 CD+34/CD+56复合物
文献报道，CD+34/CD+56复合物多见于伴有t(8；21)(q22；q22)染色体易位的AML患者，儿童20%可检出，对CD+34/CD+56阳性AML，尤其是M2有明显预后提示价值。本文检测18例AL患者有该复合物，得出类似结论。AML M2患者无论初发或复发状态，一旦检出CD+34/CD+56高表达，则对化疗不敏感，预后差，患者1，2即如此。从本文检测结果看，CD+34/CD+56复合物对AUL、ALL-L2预后价值不大。
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3.2 CD+34单阳细胞
例2，3，4复发或CR状态时，检测骨髓细胞均有CD+34细胞高表达，此3例患者均表现为化疗不敏感或CR者3个月内复发。因此认为，无论AML还是AUL、ALL-L2患者，一旦骨髓细胞检出CD+34单阳细胞高表达，则化疗不敏感，短期内复发。原因与该类细胞存在PgP高表达(MDR高表达)有关。
3.3 CD+19/CD+56，CD+19/CD+33，CD+19/CD+34复合物
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11例对照此3种复合物表达率很低，gate值<1.0%，total值<0.5%，即正常人或造血系统非恶性疾患骨髓内此类细胞存在微量，这与国外报道一致。国外报道，CD+19/CD+56、CD+19/CD+33、CD+19/CD+34高表达，对ALL有明显预后价值。例3复发状态、例4 CR状态时，检出此三种复合物高表达，3个月后例4复发，例3多次化疗均未缓解，表明患者体内存在多个白血病细胞亚群，白血病细胞分布异质性大，化疗不敏感，预后差。与其他报道一致。
3.4 PBSCS的评价
患者5，6为2例PBSCT术者，对其PBSCS进行了分析。结果例5 PBSCS检出有CD+19/CD+33明显高表达，例6检测CD+34/CD+56表达率无明显升高，PBSCT术后3个月，例5复发，例6仍CR。表明例5 PBSCS内有大量CD+19/CD+33白血病细胞存在，因此回输后很快复发。这与其他报道类似。这2例患者PBSCS均检出CD+34单阳细胞高表达，PBSCT术者应用氟美松、G-CSF、化疗等动员措施后，外周血CD+34单阳细胞升高。而CD+34单阳细胞对PBSCS的预后评价作用，有待进一步探讨。■
(收稿日期：1998-10-23), 百拇医药
单位：于桂芬(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院 牡丹江，157003)；殷晓华(牡丹江市红旗医院)；程美兰(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院 牡丹江，157003)；胡赛鹏(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院 牡丹江，157003)；张泽国(牡丹江市血液病研究所、北方血液病医院 牡丹江，157003)；尉达民(北京医科大学第三临床医学院)；王良绪(北京医科大学第三临床医学院)
关键词：
临床血液学杂志000216 应用流式细胞仪免疫荧光双标法检测18例急性白血病(AL)，对照11例骨髓单个核细胞(MNC)或外周血干细胞移植术(PBSCT)时采集的外周血干细胞(PBSCS)的白血病相关复合物表达情况〔其中急性髓细胞白血病(AML)以CD34/CD56复合物为标志，急性淋巴细胞白血病(ALL)及急性未分化细胞白血病(AUL)以CD34/CD56，CD19/CD34，CD19/CD33，CD19/CD56复合物为标志探讨这些白血病相关复合物对AL的预后价值。
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1 病例和方法
1.1 病例来源
18例AL患者包括AML 15例(M28例，M37例)，ALL-L22例，AUL 1例。男6例，女12例。年龄18～60岁。采集标本28份，其中2份来自PBSCT时采集之PBSCS，26份为骨髓标本。对照组取自非白血病(NL)患者的骨髓标本，共采标本11份(大致正常4例，小细胞低色素性贫血4例，巨幼红细胞贫血1例，原发性血小板减少性紫癜2例)。男7例，女4例。年龄29～69岁。AML以DA方案(柔红霉素、阿糖胞苷)化疗，ALL、AUL以DVCP方案(柔红霉素、长春新碱、环磷酰胺、泼尼松)化疗。其中6例为PBSCT术者。疗效判断依据1987年全国白血病化疗讨论会制定的标准。
1.2 抗原标志
无菌操作取抗凝骨髓或PBSCT术时采集之PBSCS 1～3 ml，分离MNC。取1×106 MNC分装于50 μl小离心管内，离心(5 000 r/min×30 s)，弃上清。根据待检免疫复合物配对，分别于相应小离心管内加入相应直标单克隆抗体，其中CD-34FITC、CD-56PE、CD-19cychrome(美国Pharmigen公司)各20 μl，CD-33PE(美国BD公司)10 μl，加毕后轻轻振荡混匀，置冰箱4℃30 min后取出，PBS洗液清洗2次后，加保存液1 ml，4℃冰箱保存待上机。对照组标本以同样方法制备。
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1.3 流式细胞仪双荧光法分析膜抗原标志
采用FACS can流式细胞仪(BD公司)分析，FACS激光功率15 mv，激发光波长488 nm，第1荧光探测器收集通过530 nm带滤光片的绿色荧光(FL1)，第2荧光探测器收集通过586 nm带滤光片的橙色荧光(FL2)、第3荧光探测器收集通过620 nm带滤光片的红色荧光(FL3)，分别反映FITC、PE及cychrome的荧光强度。用Autocomp软件结合CALIBRITE Beads检正仪器，采用LYSIS Ⅱ软件分析，每次读取10 000个细胞。
1.4 统计学处理
采用F检验、Q检验或秩和检验。
2 结果
2.1 对照组、完全缓解(CR)组AL白血病相关复合物的检测结果
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动态观察18例AL患者，13例CR者，5例患者复发或死亡。11例对照CD+19/CD+34、CD+19/CD+56、CD+19/CD+33检测结果见表1。对照组及CR组(包括化疗CR组及PBSCT CR组)CD+34/CD+56复合物及CD+34单阳细胞检测结果及统计学分析结果见表2。
表1 11例对照检测结果
，% 项目CD+19/CD+56
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CD+19/CD+33
CD+19/CD+34
gate值
0.70±0.16
0.35±0.12
0.20±0.10
total值
0.29±0.11
0.17±0.06
0.10±0.04
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表2 对照组、化疗CR组、PBSCT CR组CD+34/CD+56、CD+34检测结果
，% 项目对照组
化疗CR组
PBSCT CR组
P值
CD+34/CD+56
gate值
total值
, 百拇医药
0.2591±0.1099
0.0682±0.0231
0.1800±0.0459
0.0911±0.0210
0.0550±0.0290
0.0350±0.0253
>0.20
>0.20
CD+34
gate值
total值
, 百拇医药
1.9360±0.3201
0.2818±0.0831
1.5733±0.3842
0.8400±0.2126
1.4475±1.1113
1.1850±0.9973
>0.50
>0.10
由表1可见，CD+19/CD+56、CD+19/CD+33、CD+19/CD+34于对照组中表达率很低，各组gate值均<1.0%，total值均<0.5%。表2可见，CD+34/CD+56表达率于对照组、化疗CR组、PBSCT CR组gate值<0.5%，total值<0.1%。CD+34单阳细胞表达率于各组gate值<2.5%，total值<0.5%。各组CD+34/CD+56及CD+34表达率差异无统计学意义。
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2.2 复发或死亡患者白血病相关复合物检测结果
5例临床预后差的患者及1例PBSCT术后CR患者，白血病相关复合物检测结果及相关临床资料见表3。①CD+34/CD+56复合物：1，2为M2患者，检出有CD+34/CD+56高表达，较对照gate值及total值均升高>10倍，其中例1 gate值升高>130倍，total值升高>239倍。此2例患者化疗均不敏感。例1诊断后3个月死亡，例2复发后多次化疗均未缓解。例3，4分别为AUL、ALL-L2患者，其CD+34/CD+56表达率较对照无明显升高。例5，6为PBSCT术者，其PBSCS CD+34/CD+56表达率亦无明显升高。②CD+34单阳细胞：例2，3，4，5，6均检出CD+34单阳细胞高表达，gate值升高>1.3倍，total值升高>8倍，其中例5，6标本来自PBSCS。此5例患者前4例复发或复发后持续未缓解，例6仍CR。③CD+19/CD+33，CD+19/CD+56，CD+19/CD+34复合物：例3复发状态、例4 CR状态时，检测骨髓细胞CD+19/CD+33，CD+19/CD+56，CD+19/CD+34表达率升高，较对照gate值分别升高>3，9，6倍，total值分别升高>5，18，15倍，检测3个月后，例4复发，例3复发后多次化疗均未缓解。例5 PBSCS检出有CD+19/CD+33高表达，较对照gate值升高69倍，total值升高76倍。PBSCT术后3个月的患者复发。表3 白血病临床资料及相关复合物测定结果 % 病例
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诊断
标本
来源
检测
状态
预后
CD+34/CD+56
CD+34
CD+19/CD+56
CD+19/CD+34
, 百拇医药
CD+19/CD+33
gate
total
gate
total
gate
total
gate
total
gate
total
1
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M2
BM
初发
死亡
47.44
21.89
1.86
0.86
2
M2
BM
复发
NP
, 百拇医药
4.02
2.94
36.38
24.61
3
AUL
BM
复发
NP
0.50
0.28
26.93
15.14
, 百拇医药
2.51
1.41
26.97
15.98
2.22
1.19
4
L2
BM
CR
复发
0.19
0.17
, 百拇医药
2.94
2.76
14.08
12.97
2.29
2.15
1.28
1.20
5
L2
PBSCS
CR
复发
, 百拇医药
0.29
0.14
8.84
4.08
0.16
0.11
0.04
0.02
32.64
17.39
6
M3
PBSCS
, 百拇医药
CR
CR
0.30
0.13
6.54
2.92
3 讨论
3.1 CD+34/CD+56复合物
文献报道，CD+34/CD+56复合物多见于伴有t(8；21)(q22；q22)染色体易位的AML患者，儿童20%可检出，对CD+34/CD+56阳性AML，尤其是M2有明显预后提示价值。本文检测18例AL患者有该复合物，得出类似结论。AML M2患者无论初发或复发状态，一旦检出CD+34/CD+56高表达，则对化疗不敏感，预后差，患者1，2即如此。从本文检测结果看，CD+34/CD+56复合物对AUL、ALL-L2预后价值不大。
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3.2 CD+34单阳细胞
例2，3，4复发或CR状态时，检测骨髓细胞均有CD+34细胞高表达，此3例患者均表现为化疗不敏感或CR者3个月内复发。因此认为，无论AML还是AUL、ALL-L2患者，一旦骨髓细胞检出CD+34单阳细胞高表达，则化疗不敏感，短期内复发。原因与该类细胞存在PgP高表达(MDR高表达)有关。
3.3 CD+19/CD+56，CD+19/CD+33，CD+19/CD+34复合物
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11例对照此3种复合物表达率很低，gate值<1.0%，total值<0.5%，即正常人或造血系统非恶性疾患骨髓内此类细胞存在微量，这与国外报道一致。国外报道，CD+19/CD+56、CD+19/CD+33、CD+19/CD+34高表达，对ALL有明显预后价值。例3复发状态、例4 CR状态时，检出此三种复合物高表达，3个月后例4复发，例3多次化疗均未缓解，表明患者体内存在多个白血病细胞亚群，白血病细胞分布异质性大，化疗不敏感，预后差。与其他报道一致。
3.4 PBSCS的评价
患者5，6为2例PBSCT术者，对其PBSCS进行了分析。结果例5 PBSCS检出有CD+19/CD+33明显高表达，例6检测CD+34/CD+56表达率无明显升高，PBSCT术后3个月，例5复发，例6仍CR。表明例5 PBSCS内有大量CD+19/CD+33白血病细胞存在，因此回输后很快复发。这与其他报道类似。这2例患者PBSCS均检出CD+34单阳细胞高表达，PBSCT术者应用氟美松、G-CSF、化疗等动员措施后，外周血CD+34单阳细胞升高。而CD+34单阳细胞对PBSCS的预后评价作用，有待进一步探讨。■
(收稿日期：1998-10-23), 百拇医药