国产免疫磁珠分离细胞的方法学研究及初步应用
作者：庄俊玲 王良利 游泳 龚非力 邹萍
单位：庄俊玲(同济医科大学附属协和医院血液病研究所 武汉，430022)；王良利(同济医科大学附属协和医院血液病研究所 武汉，430022)；游泳(同济医科大学附属协和医院血液病研究所 武汉，430022)；龚非力(同济医科大学免疫学教研室)；邹萍(同济医科大学附属协和医院血液病研究所 武汉，430022)
关键词：国产免疫磁珠 细胞分离 CD+34细胞
临床血液学杂志000210 摘 要：目的：探讨以国产免疫磁珠进行细胞分离的方法，并评价直接包被法的特异性和敏感性及其在脐血和骨髓CD+34细胞分离中的应用。方法：直接包被法、SPA法、生物素-亲和素法。结果：直接包被法、SPA法和生物素-亲合素法均可有效分离细胞，但以直接包被法最具优势，并证明其有较高特异性和敏感性。应用直接包被法分离脐血及骨髓中的CD+34细胞率为51%～82%，台盼蓝拒染率为82%～88%。结论：国产免疫磁珠有较好的分离效果，对细胞活性影响较小。
, 百拇医药
Methods and Utility of Cell Separation with Domestic Immunomagnetic Beads
ZHUANG JUN-ling WANG Liang-li YOU Yong ZOU Ping
(Institute of Hematology,Union Hospital,Tong ji Medical University,Wuhan,430022)
GONG Fei-li
Abstract：Objective:To investigate the methods of cell separation with domestic immunomagnetic beads and assess the specifity and sensitivity of the direct method and its application in the separation of CD+34 positive cell.Method:Direct method,SPA method,Biotin-Avidin method.Results:Separation rate was high in direct method,SPA method and Biotin-Avidin method,but direct method was the best and its specifity and sensitivity were verified.CD+34 positive cell separation rate was 51%～82% with direct method.Conclusion:Domestic immunomagnetic beads had the effectiveness of separation and slightly affected the viability of cells.
, 百拇医药
Key words：Domestic immunomagnetic beads Cell separation CD+34 positive cell▲
免疫磁珠(immunomagnetic beads，IMB)是包被有单克隆抗体的磁性微粒，它可特异性地与靶物质结合使之具有磁响应性，继而在外加磁场的作用下，结合有靶物质的磁珠被滞留，从而与其他成分分离，达到纯化富集的作用。此法可用于分离各种骨髓及血细胞、肿瘤细胞、核酸、细菌及其他微生物等〔1～4〕，其中分离造血细胞应用最为广泛。本实验即是探讨以国产磁珠进行细胞分离的方法，比较直接包被法、SPA法、生物素-亲合素法的特点。并选择直接包被法分离外周血中CD+4细胞，评价该法的特异性和敏感性，进而用直接包被法分离脐血及正常骨髓中的CD+34细胞，以进一步证明国产磁珠的分离效果及其对细胞活性的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 直接包被法
将空白磁珠用pH 3.6，0.05 MHAc-NaAc缓冲液洗两遍后悬浮，每mg磁珠加入10 mg碳二亚胺(CMC)和5 μl抗-CD4，于室温缓慢摇动2 h，在磁场中去除上清，洗涤后按磁珠：细胞=50∶1的比例加入Hut-78细胞株，室温缓慢摇动0.5 h，再通过磁场去除未结合的细胞。
1.2 SPA法
加入CMC后每mg磁珠加入5 μg SPA缓摇2 h，PBS洗两遍后加入单抗缓摇0.5 h，余同上。
1.3 生物素-亲合素法
磁珠+CMC+5 μg亲合素/磁珠，室温缓慢摇动2 h，PBS洗两遍，按每mg磁珠1.5 μg生物素的比例使其与单抗混合，室温缓慢摇动2 h后，置于透析袋中透析24 h，将上述两体系混合缓摇0.5 h，余同上。
, http://www.100md.com
1.4 解离与鉴定
按每mg磁珠加入木瓜蛋白酶2 mg的比例于上述体系中，匀摇15 min，通过磁场，收获上清中的解离细胞，台盼蓝染色。
1.5 外周血中CD+4细胞的分离
将分离得到的健康人外周血单个核细胞(MNC)与磁珠按1∶20的比例混合，分离前MNC及分离后去除的阴性细胞均离心涂片，干燥24 h后碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶试验(APAAP)法分别测定其CD+4细胞阳性率。
1.6 脐血及骨髓CD+34细胞的分离
将分离得到的健康人外周血MNC与磁珠按1∶5的比例混合(单抗浓度为3 μl/mg磁珠)，木瓜蛋白酶解离时间30 min，分离后的细胞台盼蓝染色并用APAAP法测定其CD+34细胞阳性率。
, 百拇医药
2 结果
2.1 对Hut-78细胞的分离
直接包被法细胞的分离率93.3%±2.3%，木瓜蛋白酶的解离率>95%，台盼蓝拒染率>90%。SPA法与生物素-亲合素法也可有效分离细胞，分离率>90%，与直接包被法差异无显著性。
2.2 对外周血CD+4细胞的分离
MNC中CD+4阳性率46.4%±6.4%，阴性上清中CD+4阳性率仅6.2%±2.3%。去除阴性细胞后可见80.6%±7.7%的细胞与磁珠结合。
2.3 脐血与骨髓中CD+34细胞的分离
, 百拇医药
77.6%±4.9%的细胞与磁珠结合，CD+34细胞木瓜蛋白酶的解离率75.2%±4.9%；APAAP法检测脐血解离后收获细胞CD+34阳性率为51%～82%；台盼蓝拒染率82%～88%。
3 讨论
早在80年代初期，Ugelstad〔1〕就提出用磁性微粒分离细胞，后由挪威Dynal公司制成免疫磁珠出售，可用于各种细胞的分离。并被公认具有简便易行、分离纯度高、保留细胞活性等优点。但因其制备工艺复杂，成品价格昂贵，故在国内未得到广泛应用。由武汉工业大学复合新材料实验室与本校免疫室合作研制生产的国产磁珠，已被用于分离可溶性蛋白大分子及体内微量活性物质的检测，证明了其性能的可靠性〔5〕。本实验应用并比较了三种不同的方法，即直接包被法、蛋白A(SPA)法和生物素-亲合素法，旨在选择出简便有效的一种，进行细胞分离。通过对细胞株Hut-78的分离，证明三种方法的效果是肯定的，分离率均>90%。我们认为其中以直接包被法操作最为简便，造价也较为低廉。亲合素-生物素法的特点是生物素亲合素与抗体亲合力很强〔6〕，分子亲合素可结合四分子生物素，起到放大作用，有利于细胞的结合。该方法不足之处在于操作过程较直接法为复杂。实验条件要求严格。SPA法操作也略显复杂，特异性较前二者为差。
, 百拇医药
与磁珠结合后的细胞必须与单克隆抗体解离后才能获得。我们采用木瓜蛋白酶解离法，原理是该酶可作用于抗体Fab段与Fc段的连接处，将其切断，从而使细胞从磁珠上解离下来。我们观察到，此法对于细胞株解离率>95%，台盼蓝拒染率>90%，对细胞活性影响较小，获得较为满意的效果。
为了进一步验证国产磁珠的细胞分离效果。本实验还应用直接包被法进行了外周血CD+4细胞的分离。首先在分离前证实样本中单个核细胞CD+4阳性率为46.4%±6.4%。分离细胞后的上清中仅遗留6.2%±2.3%的CD+4细胞。同时也观察了去除上清后CD+34阳性细胞的结合状态，可见80.6%±7.7%的细胞与磁珠结合，证明大部分CD+4细胞已被分离，显示该方法有较高的特异性和敏感性。
, 百拇医药
在完善直接包被法操作规程后，将其用于脐血和骨髓CD+34细胞的分离。细胞与磁珠结合良好，有77.6%±4.9%的细胞与磁珠结合，可见玫瑰花环样结构。我们用木瓜蛋白酶解离脐血和骨髓中的CD+34细胞，解离率为75.2%±4.9%，较细胞株解离率低。原因可能是抗-CD+34效价较高，酶解离困难所致。酶解离后APAAP法测得收获细胞CD+34阳性率为51%～82%。总之，国产磁珠对细胞有较好的分离效果，且对细胞活性的影响较小，随着制作工艺的完善，可以逐步替代进口产品。■
基金项目：卫生部科研基金资助项目(96-1-141)
参考文献：
[1]Ugelstad J,Soderberg L,Berge A,et al.Monodisperse polymer particles-a step forward for chromatography.Nature,1983,303:95～98
, http://www.100md.com
[2]Sleasman J W,Leon B H,Aleixo L F,et al.Immunomagnetic selection of purified monocyte and lymphocyte populations from peripheral blood mononuclear cells following cryopreservation.Clin Diagn Lab Immunol,1997,4:653～654
[3]Makarovskiy A N,Wojcik L,Halpert G K,et al.Application of immunomagnetic beads in combination with RT-PCR for the detection of circulating prostate cancer cells.J Clin Lab Anal,1997,11:346～348
[4]Gagne A,Lacouture S,Broes A,et al.Development of and immunomagnetic method for selective isolation of actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 from tonsils.J Clin Microbiol,1998,36:251～254
[5]熊平，徐勇，朱颉安等.免疫磁性微珠的研制及其在免疫检测中的应用.同济医科大学学报，1994，23：443～445
[6]Wixler V,Klarmann B,Begemann U,et al.Isolation and quanlification of class IMHC gene mutants in mouse T cells by immunoselection with a magnetic cell sorter.J Immunol Methods,1994,171:121～129
(收稿日期：1999-06-18), 百拇医药
单位：庄俊玲(同济医科大学附属协和医院血液病研究所 武汉，430022)；王良利(同济医科大学附属协和医院血液病研究所 武汉，430022)；游泳(同济医科大学附属协和医院血液病研究所 武汉，430022)；龚非力(同济医科大学免疫学教研室)；邹萍(同济医科大学附属协和医院血液病研究所 武汉，430022)
关键词：国产免疫磁珠 细胞分离 CD+34细胞
临床血液学杂志000210 摘 要：目的：探讨以国产免疫磁珠进行细胞分离的方法，并评价直接包被法的特异性和敏感性及其在脐血和骨髓CD+34细胞分离中的应用。方法：直接包被法、SPA法、生物素-亲和素法。结果：直接包被法、SPA法和生物素-亲合素法均可有效分离细胞，但以直接包被法最具优势，并证明其有较高特异性和敏感性。应用直接包被法分离脐血及骨髓中的CD+34细胞率为51%～82%，台盼蓝拒染率为82%～88%。结论：国产免疫磁珠有较好的分离效果，对细胞活性影响较小。
, 百拇医药
Methods and Utility of Cell Separation with Domestic Immunomagnetic Beads
ZHUANG JUN-ling WANG Liang-li YOU Yong ZOU Ping
(Institute of Hematology,Union Hospital,Tong ji Medical University,Wuhan,430022)
GONG Fei-li
Abstract：Objective:To investigate the methods of cell separation with domestic immunomagnetic beads and assess the specifity and sensitivity of the direct method and its application in the separation of CD+34 positive cell.Method:Direct method,SPA method,Biotin-Avidin method.Results:Separation rate was high in direct method,SPA method and Biotin-Avidin method,but direct method was the best and its specifity and sensitivity were verified.CD+34 positive cell separation rate was 51%～82% with direct method.Conclusion:Domestic immunomagnetic beads had the effectiveness of separation and slightly affected the viability of cells.
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Key words：Domestic immunomagnetic beads Cell separation CD+34 positive cell▲
免疫磁珠(immunomagnetic beads，IMB)是包被有单克隆抗体的磁性微粒，它可特异性地与靶物质结合使之具有磁响应性，继而在外加磁场的作用下，结合有靶物质的磁珠被滞留，从而与其他成分分离，达到纯化富集的作用。此法可用于分离各种骨髓及血细胞、肿瘤细胞、核酸、细菌及其他微生物等〔1～4〕，其中分离造血细胞应用最为广泛。本实验即是探讨以国产磁珠进行细胞分离的方法，比较直接包被法、SPA法、生物素-亲合素法的特点。并选择直接包被法分离外周血中CD+4细胞，评价该法的特异性和敏感性，进而用直接包被法分离脐血及正常骨髓中的CD+34细胞，以进一步证明国产磁珠的分离效果及其对细胞活性的影响。
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1 材料与方法
1.1 直接包被法
将空白磁珠用pH 3.6，0.05 MHAc-NaAc缓冲液洗两遍后悬浮，每mg磁珠加入10 mg碳二亚胺(CMC)和5 μl抗-CD4，于室温缓慢摇动2 h，在磁场中去除上清，洗涤后按磁珠：细胞=50∶1的比例加入Hut-78细胞株，室温缓慢摇动0.5 h，再通过磁场去除未结合的细胞。
1.2 SPA法
加入CMC后每mg磁珠加入5 μg SPA缓摇2 h，PBS洗两遍后加入单抗缓摇0.5 h，余同上。
1.3 生物素-亲合素法
磁珠+CMC+5 μg亲合素/磁珠，室温缓慢摇动2 h，PBS洗两遍，按每mg磁珠1.5 μg生物素的比例使其与单抗混合，室温缓慢摇动2 h后，置于透析袋中透析24 h，将上述两体系混合缓摇0.5 h，余同上。
, http://www.100md.com
1.4 解离与鉴定
按每mg磁珠加入木瓜蛋白酶2 mg的比例于上述体系中，匀摇15 min，通过磁场，收获上清中的解离细胞，台盼蓝染色。
1.5 外周血中CD+4细胞的分离
将分离得到的健康人外周血单个核细胞(MNC)与磁珠按1∶20的比例混合，分离前MNC及分离后去除的阴性细胞均离心涂片，干燥24 h后碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶试验(APAAP)法分别测定其CD+4细胞阳性率。
1.6 脐血及骨髓CD+34细胞的分离
将分离得到的健康人外周血MNC与磁珠按1∶5的比例混合(单抗浓度为3 μl/mg磁珠)，木瓜蛋白酶解离时间30 min，分离后的细胞台盼蓝染色并用APAAP法测定其CD+34细胞阳性率。
, 百拇医药
2 结果
2.1 对Hut-78细胞的分离
直接包被法细胞的分离率93.3%±2.3%，木瓜蛋白酶的解离率>95%，台盼蓝拒染率>90%。SPA法与生物素-亲合素法也可有效分离细胞，分离率>90%，与直接包被法差异无显著性。
2.2 对外周血CD+4细胞的分离
MNC中CD+4阳性率46.4%±6.4%，阴性上清中CD+4阳性率仅6.2%±2.3%。去除阴性细胞后可见80.6%±7.7%的细胞与磁珠结合。
2.3 脐血与骨髓中CD+34细胞的分离
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77.6%±4.9%的细胞与磁珠结合，CD+34细胞木瓜蛋白酶的解离率75.2%±4.9%；APAAP法检测脐血解离后收获细胞CD+34阳性率为51%～82%；台盼蓝拒染率82%～88%。
3 讨论
早在80年代初期，Ugelstad〔1〕就提出用磁性微粒分离细胞，后由挪威Dynal公司制成免疫磁珠出售，可用于各种细胞的分离。并被公认具有简便易行、分离纯度高、保留细胞活性等优点。但因其制备工艺复杂，成品价格昂贵，故在国内未得到广泛应用。由武汉工业大学复合新材料实验室与本校免疫室合作研制生产的国产磁珠，已被用于分离可溶性蛋白大分子及体内微量活性物质的检测，证明了其性能的可靠性〔5〕。本实验应用并比较了三种不同的方法，即直接包被法、蛋白A(SPA)法和生物素-亲合素法，旨在选择出简便有效的一种，进行细胞分离。通过对细胞株Hut-78的分离，证明三种方法的效果是肯定的，分离率均>90%。我们认为其中以直接包被法操作最为简便，造价也较为低廉。亲合素-生物素法的特点是生物素亲合素与抗体亲合力很强〔6〕，分子亲合素可结合四分子生物素，起到放大作用，有利于细胞的结合。该方法不足之处在于操作过程较直接法为复杂。实验条件要求严格。SPA法操作也略显复杂，特异性较前二者为差。
, 百拇医药
与磁珠结合后的细胞必须与单克隆抗体解离后才能获得。我们采用木瓜蛋白酶解离法，原理是该酶可作用于抗体Fab段与Fc段的连接处，将其切断，从而使细胞从磁珠上解离下来。我们观察到，此法对于细胞株解离率>95%，台盼蓝拒染率>90%，对细胞活性影响较小，获得较为满意的效果。
为了进一步验证国产磁珠的细胞分离效果。本实验还应用直接包被法进行了外周血CD+4细胞的分离。首先在分离前证实样本中单个核细胞CD+4阳性率为46.4%±6.4%。分离细胞后的上清中仅遗留6.2%±2.3%的CD+4细胞。同时也观察了去除上清后CD+34阳性细胞的结合状态，可见80.6%±7.7%的细胞与磁珠结合，证明大部分CD+4细胞已被分离，显示该方法有较高的特异性和敏感性。
, 百拇医药
在完善直接包被法操作规程后，将其用于脐血和骨髓CD+34细胞的分离。细胞与磁珠结合良好，有77.6%±4.9%的细胞与磁珠结合，可见玫瑰花环样结构。我们用木瓜蛋白酶解离脐血和骨髓中的CD+34细胞，解离率为75.2%±4.9%，较细胞株解离率低。原因可能是抗-CD+34效价较高，酶解离困难所致。酶解离后APAAP法测得收获细胞CD+34阳性率为51%～82%。总之，国产磁珠对细胞有较好的分离效果，且对细胞活性的影响较小，随着制作工艺的完善，可以逐步替代进口产品。■
基金项目：卫生部科研基金资助项目(96-1-141)
参考文献：
[1]Ugelstad J,Soderberg L,Berge A,et al.Monodisperse polymer particles-a step forward for chromatography.Nature,1983,303:95～98
, http://www.100md.com
[2]Sleasman J W,Leon B H,Aleixo L F,et al.Immunomagnetic selection of purified monocyte and lymphocyte populations from peripheral blood mononuclear cells following cryopreservation.Clin Diagn Lab Immunol,1997,4:653～654
[3]Makarovskiy A N,Wojcik L,Halpert G K,et al.Application of immunomagnetic beads in combination with RT-PCR for the detection of circulating prostate cancer cells.J Clin Lab Anal,1997,11:346～348
[4]Gagne A,Lacouture S,Broes A,et al.Development of and immunomagnetic method for selective isolation of actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 from tonsils.J Clin Microbiol,1998,36:251～254
[5]熊平，徐勇，朱颉安等.免疫磁性微珠的研制及其在免疫检测中的应用.同济医科大学学报，1994，23：443～445
[6]Wixler V,Klarmann B,Begemann U,et al.Isolation and quanlification of class IMHC gene mutants in mouse T cells by immunoselection with a magnetic cell sorter.J Immunol Methods,1994,171:121～129
(收稿日期：1999-06-18), 百拇医药