慢性冬眠心肌细胞内Ca2+及Mg2+含量测定
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山东医科大学学报 2000年第2期第38卷 论著
作者：季晓平 张运 邢艳秋 张园园 王勇 郑昭伦
单位：山东医科大学附属医院心内科
关键词：心肌缺血；钙；镁；狗
山东医科大学学报000216
摘 要：目的：探讨慢性冬眠心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量的变化。方法：使22只犬冠状动脉左前降支缩窄50%，继续喂养1个月，利用三电极直流等离子体原子发射光电直读光谱仪测量慢性冬眠心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量。结果：①成功地建立了慢性心肌冬眠的动物模型；②10只犬完成所有实验步骤，存活(45.2±9.59)d，左前降支内径缩窄平均48%；③缺血心肌细胞内Ca2+含量明显高于正常心肌[(13.48±4.26)vs(9.47±2.32),P<0.05]，而Mg2+则明显低于正常[(19.37±5.62)vs(27.18±8.77)，P<0.05]。结论：慢性冬眠心肌存在细胞内Ca2+超载，提示细胞内Ca2+超载可能是慢性心肌冬眠的发生机制之一。
, 百拇医药
分类号：R542.2；Q582 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0158-03
THE ASSESSMENT OF THE CAPACITY OF Ca2+ AND Mg2+IN THE MYOCYTES OF HIBERNATING MYOCARDIUM
JI Xiao-ping,ZHANG Yun,XING Yan-qiou
(Dept.of Cardiology, The Affiliated Hospital of Shandong Medical University)
Abstract：Objective:To assess the changes of Ca2+ and Mg2+ in the myocytes of hibernating myocardium and their roles in hibernating myocardium.Metheds: A left anterior descending coronary artery stenosis was created in 22 dogs and mantained for(45.s±9.59)days toe reduce the diameter of coroanry artery by a means of 48% with severe regional myocardial systolic dysfunction, as documented by echocardiography, establishing the animal model of chronic hibernating my ocardium in 10 dogs.The contents of introcelluar Ca2+ and Mg2+ were measured.Results:1.The animal model of chronic hibernating myocardium were successful;2.The capacity of Ca2+ in ischemic myocardial cells was obronic higher than the mormal myocardium[(13.48±4.26)vs(9.47±2.32),P<0.05＝]and the capacity of Mg2+ was obviously lower than the normal myocardium[(19.37±5.62)vs(27.18±8.77),P<0.05].Conlcusion:The intracelluar Ca2+ overload and Mg2+ decrease were detected in the chronic hiberanting myocardium.
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Keywords：Hibernating myocardium;Calcium;Magnesium;Dogs 自从Rahimtoola[1，2]提出“冬眠心肌”(hibernatingmycocardium)的概念以来，学者们对心肌冬眠的发生机制进行了深入的探讨，但由于建立一个慢性心肌缺血而无坏死的动物模型非常困难，至今尚无公认的慢性心肌冬眠的动物模型，故对心肌冬眠的发生机制尚未明了。近年来，学者们对顿抑心肌细胞内存在Ca2+超载已达成共识，但对于冬眠心肌细胞内Ca2+含量的变化尚不明确。本研究旨在建立慢性心肌冬眠动物模型，观察冬眠心肌细胞内Ca2+及Mg2+含量变化，以探讨Ca2+及Mg2+在心肌冬眠发生机制中的作用。
1材料与方法
1.1实验动物随机选择健康杂种犬22只，雌雄不拘，其中雌性12只，雄性10只，体重8.0～17.5kg，平均(11.55±1.99)kg。
, 百拇医药 1.2方法
1.2.1慢性心肌冬眠动物模型的建立
以3%戊巴比妥(1mg/kg体重)静脉麻醉，无菌条件下开胸，暴露左心室及冠状动脉左前降支。利用美国惠普公司SONOS-5500型彩色多普勒超声心动图仪测定左室室壁运动、左室射血分数(LVEF)、左前降支内径和血流频谱，利用无损伤线缩窄左前降支，根据超声测得的冠脉内径进行调整，使左前降支内径减少50%，然后重复上述超声心动图检查。上述步骤完成后关胸，术中及术后3天给予肝素及青霉素治疗，待实验犬状态稳定后送回我院动物实验中心继续饲养。
第一次手术过程中及手术后，22只犬中有12只犬因室颤、呼吸衰竭、胸腔出血、感染等原因死亡。存活的10只犬(雌性8只，雄性2只，体重8～17.5kg，平均(12.85±2.80)kg)进行第二次手术，距第一次手术的间期为25～55天，平均(45.2±9.59)天。以与第一次手术相同的条件，经原切口开胸，暴露左心室及左前降支狭窄处，测定左室室壁运动、LVEF、狭窄左前降支内径和血流速度。实验结束后处死犬，立即取其心脏，在左前降支狭窄部的远心端注射伊文氏蓝，以显示狭窄冠脉支配的缺血区域，将左室自心尖至心底切成0.5cm厚的薄片，进行氯化三苯基四唑氮(TTC)染色，呈深红色区域为存活心肌，而未被TTC染色的区域为坏死心肌，并进行光镜和电镜检查。
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1.2.2心肌细胞内Ca2+及Mg2+浓度测定
分别于10只犬的正常区、缺血区、坏死区(限于4只有小灶性坏死的实验犬)取1cm×1cm×1cm大小全层心肌组织。称取一定数量的心肌组织，加入纯硝酸，加热溶解使体积浓缩，有机物质破坏后，加入纯氯酸，继续加热溶解，用纯水冲入试管中定容5ml体积，摇匀后利用三电极直流等离子体原子发射光电直读光谱仪进行测量，测量单位为mmol/L
1.3统计学分析
所在测值均以＝S表示，采用EXCEL及SPSS统计分析软件进行方差分析及配对t检验比较测值间有无显著性差异，P<0.05表示差异有显著性。
2结果
2.1慢性心肌冬眠动物模型
10只犬均顺利完成了所有实验步骤，术中3只犬出现室性早搏，未给予药物治疗即自行恢复，无其他严重并发症发生。
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第二次手术距第一次手术的间期为25～55天，平均(45.2±9.59)天；两次手术时的犬体重分别为：(11.55±1.99)kg及(12.85±2.80)kg，两者之间无显著性差异(P>0.05)；结扎前与结扎后冠脉内径分别为：(1.72±0.19)mmvs(0.84±0.14)mm，结扎后与结扎前冠脉内径比为：0.44～0.54，平均0.48±0.04。所有实验犬均出现并保持了节段性室壁运动异常，结扎前及结扎后LVEF分别为0.65±0.08和0.56±0.08，二者差异显著(P<0.05)；术后TTC染色显示：3只犬出现小灶性心肌坏死，分别占左前降支供血区域的3%、3%、4%，1只犬出现小灶性心内膜下(小于室壁厚度的50%)心肌坏死，占左前降支供血区域的2%，余6只犬均无心肌坏死发现，染色结果与光镜及电镜观察结果一致。表明本研究成功建立了慢性缺血而无坏死的动物模型。
2.2细胞内Ca2+、Mg2-含量测定
缺血心肌细胞内Ca2+含量明显高于正常心肌[(13.48±4.26)vs(9.47±2.32)，P<0.05]；而Mg2+含量明显低于正常心肌[(19.37±5.62)vs(27.18±8.77)，P<0.05]；坏死心肌细胞内Ca2+含量亦明显高于正常心肌[(13.90±6.40)vs(9.47±2.32)，P<0.05]；而Mg2+含量明显低于正常心肌[(10.94±1.23)vs(27.18±8.77)，P<0.05](见表1)。
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表1心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量测定结果(±s，c/mmol·L-1)
*P<0.05vs正常区域
3.讨论
3.1慢性心肌冬眠动物模型的建立
本实验中，我们使犬左前降支内径减少约50%，旨在导致长期节段性室壁运动异常而不发生心肌坏死。结果显示：①结扎后与结扎前冠脉内径比值为0.44～0.54，平均0.48±0.44，达到了实验设计要求；②两次手术的间隔时间为25～55天，平均(45.2±9.59)天，是目前慢性心肌缺血动物试验报道中较长者；③所有实验犬均出现并保持了节段性室壁运动异常，LVEF测值较冠脉结扎前明显降低，证明产生了足够大的缺血范围；④手术后TTC染色、光镜及电镜检查证实，3只犬出现小于缺血区5%的透壁性心肌坏死，1只犬出现面积为缺血区2%的心内膜下心肌坏死，余6只犬均无心肌坏死发生。以上结果表明：本研究建立的慢性心肌冬眠动物模型是成功的，这为我们进一步探讨心肌冬眠的发生机制提供了可靠的研究对象。
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3.2冬眠心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量的变化正常情况下，体内的Ca2+广泛分布于包括心肌细胞在内的各组织细胞中，细胞内外Ca2+的分布相差悬殊，正常细胞内游离Ca2+浓度为100nmol/L(10-8～10-7mol/L)，而细胞外Ca2+浓度为2mmol/L(10-3～10-2mol/L)，两者相差20000倍。生理状态下，细胞内Ca2+浓度远低于细胞外及线粒体和内质网，如此大的Ca2+电化学梯度的维持，有赖于细胞膜或细胞器膜对Ca2+的较低通透性和Ca2+转运系统的调节。Ca2+的转运主要包括两方面，即由低浓度的细胞内向高浓度的细胞外或细胞器内转运和由高浓度的细胞外或细胞器向胞浆内流或释放。在缺血和缺氧状态下，细胞膜的通透性增加，Ca2+通道开放，使得细胞外Ca2+大量内流入细胞；ATP减少，使Ca+-K+-ATP酶活性降低，细胞内Na+水平升高，Na+-Ca2+交换增加，使Ca2+内流增加；ATP减少还可使肌纤维膜上的Ca2+泵活性降低，使Ca2+逆浓度差泵到细胞外的功能障碍。所有这些改变，均导致细胞内Ca2+超载[3]。由于Mg2+是Ca2+的拮抗离子，因此细胞内Mg2+含量降低。
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冬眠心肌细胞内是否存在Ca2+超载仍未达成共识，一些学者提出，尽管顿抑心肌细胞内Ca2+含量是增加的，但冬眠心肌可能是一种细胞内低钙水平的低氧供-氧需状态[4]，其机制可能是由于反复发生的心肌顿抑导致心肌细胞收缩性持续减低，从而使肌原纤维细丝对Ca2+的敏感性降低和(或)内质网对Ca2+的贮存能力降低[5，6]所致。
在本研究中，我们测量了实验犬心肌缺血区和正常区的细胞内Ca2+和Mg2+，结果显示缺血心肌细胞内Ca2+含量明显高于正常心肌，而Mg2+则明显低于正常，这与大多数学者的发现一致[7]，从而证明慢性冬眠心肌细胞内Ca2+超载，支持细胞内Ca2+超载是慢性心肌冬眠的发生机制之一。
参考文献：
[1]NHLBI,workshop on surgery in the treatment of coronary agtery diseasv: September 6 and 7, 1984, Bethesda, Maryland. Braunwald E, Hollingsworth C, Passamani E, eds[J]. Circulation, 1985, (suppl V,December)
, 百拇医药
[2]Rahimtoola S, et al. The hibernating myocardium [J]. Am Heart J,1989,117:211
[3]王迪浔主编，病理生理学[M].北京：人民卫生出版社，1994.5:840
[4]Clapham DE. Calcium signaling[J].Cell,1995,80:259
[5]Bakker a, Thone F, Borgers M, et al. Contact sites between the inner and outer mitochondrial membranes in stunned versus hibernating myocardium[J]. Cardiovas Pathol, 1995,4:195
[6]Chiarieello M, Perrone-Filardi P, Ambrosio G. Hibernating and stunned myocardium [J]. Cardioscience, 1993,4:63
[7]Marban E. Myocardial stunning and hibernation. The physlology behind the colloquialisms[J]. Circulation, 1991,83:681
收稿日期：1998-09-08, http://www.100md.com
单位：山东医科大学附属医院心内科
关键词：心肌缺血；钙；镁；狗
山东医科大学学报000216
摘 要：目的：探讨慢性冬眠心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量的变化。方法：使22只犬冠状动脉左前降支缩窄50%，继续喂养1个月，利用三电极直流等离子体原子发射光电直读光谱仪测量慢性冬眠心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量。结果：①成功地建立了慢性心肌冬眠的动物模型；②10只犬完成所有实验步骤，存活(45.2±9.59)d，左前降支内径缩窄平均48%；③缺血心肌细胞内Ca2+含量明显高于正常心肌[(13.48±4.26)vs(9.47±2.32),P<0.05]，而Mg2+则明显低于正常[(19.37±5.62)vs(27.18±8.77)，P<0.05]。结论：慢性冬眠心肌存在细胞内Ca2+超载，提示细胞内Ca2+超载可能是慢性心肌冬眠的发生机制之一。
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分类号：R542.2；Q582 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0158-03
THE ASSESSMENT OF THE CAPACITY OF Ca2+ AND Mg2+IN THE MYOCYTES OF HIBERNATING MYOCARDIUM
JI Xiao-ping,ZHANG Yun,XING Yan-qiou
(Dept.of Cardiology, The Affiliated Hospital of Shandong Medical University)
Abstract：Objective:To assess the changes of Ca2+ and Mg2+ in the myocytes of hibernating myocardium and their roles in hibernating myocardium.Metheds: A left anterior descending coronary artery stenosis was created in 22 dogs and mantained for(45.s±9.59)days toe reduce the diameter of coroanry artery by a means of 48% with severe regional myocardial systolic dysfunction, as documented by echocardiography, establishing the animal model of chronic hibernating my ocardium in 10 dogs.The contents of introcelluar Ca2+ and Mg2+ were measured.Results:1.The animal model of chronic hibernating myocardium were successful;2.The capacity of Ca2+ in ischemic myocardial cells was obronic higher than the mormal myocardium[(13.48±4.26)vs(9.47±2.32),P<0.05＝]and the capacity of Mg2+ was obviously lower than the normal myocardium[(19.37±5.62)vs(27.18±8.77),P<0.05].Conlcusion:The intracelluar Ca2+ overload and Mg2+ decrease were detected in the chronic hiberanting myocardium.
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Keywords：Hibernating myocardium;Calcium;Magnesium;Dogs 自从Rahimtoola[1，2]提出“冬眠心肌”(hibernatingmycocardium)的概念以来，学者们对心肌冬眠的发生机制进行了深入的探讨，但由于建立一个慢性心肌缺血而无坏死的动物模型非常困难，至今尚无公认的慢性心肌冬眠的动物模型，故对心肌冬眠的发生机制尚未明了。近年来，学者们对顿抑心肌细胞内存在Ca2+超载已达成共识，但对于冬眠心肌细胞内Ca2+含量的变化尚不明确。本研究旨在建立慢性心肌冬眠动物模型，观察冬眠心肌细胞内Ca2+及Mg2+含量变化，以探讨Ca2+及Mg2+在心肌冬眠发生机制中的作用。
1材料与方法
1.1实验动物随机选择健康杂种犬22只，雌雄不拘，其中雌性12只，雄性10只，体重8.0～17.5kg，平均(11.55±1.99)kg。
, 百拇医药 1.2方法
1.2.1慢性心肌冬眠动物模型的建立
以3%戊巴比妥(1mg/kg体重)静脉麻醉，无菌条件下开胸，暴露左心室及冠状动脉左前降支。利用美国惠普公司SONOS-5500型彩色多普勒超声心动图仪测定左室室壁运动、左室射血分数(LVEF)、左前降支内径和血流频谱，利用无损伤线缩窄左前降支，根据超声测得的冠脉内径进行调整，使左前降支内径减少50%，然后重复上述超声心动图检查。上述步骤完成后关胸，术中及术后3天给予肝素及青霉素治疗，待实验犬状态稳定后送回我院动物实验中心继续饲养。
第一次手术过程中及手术后，22只犬中有12只犬因室颤、呼吸衰竭、胸腔出血、感染等原因死亡。存活的10只犬(雌性8只，雄性2只，体重8～17.5kg，平均(12.85±2.80)kg)进行第二次手术，距第一次手术的间期为25～55天，平均(45.2±9.59)天。以与第一次手术相同的条件，经原切口开胸，暴露左心室及左前降支狭窄处，测定左室室壁运动、LVEF、狭窄左前降支内径和血流速度。实验结束后处死犬，立即取其心脏，在左前降支狭窄部的远心端注射伊文氏蓝，以显示狭窄冠脉支配的缺血区域，将左室自心尖至心底切成0.5cm厚的薄片，进行氯化三苯基四唑氮(TTC)染色，呈深红色区域为存活心肌，而未被TTC染色的区域为坏死心肌，并进行光镜和电镜检查。
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1.2.2心肌细胞内Ca2+及Mg2+浓度测定
分别于10只犬的正常区、缺血区、坏死区(限于4只有小灶性坏死的实验犬)取1cm×1cm×1cm大小全层心肌组织。称取一定数量的心肌组织，加入纯硝酸，加热溶解使体积浓缩，有机物质破坏后，加入纯氯酸，继续加热溶解，用纯水冲入试管中定容5ml体积，摇匀后利用三电极直流等离子体原子发射光电直读光谱仪进行测量，测量单位为mmol/L
1.3统计学分析
所在测值均以＝S表示，采用EXCEL及SPSS统计分析软件进行方差分析及配对t检验比较测值间有无显著性差异，P<0.05表示差异有显著性。
2结果
2.1慢性心肌冬眠动物模型
10只犬均顺利完成了所有实验步骤，术中3只犬出现室性早搏，未给予药物治疗即自行恢复，无其他严重并发症发生。
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第二次手术距第一次手术的间期为25～55天，平均(45.2±9.59)天；两次手术时的犬体重分别为：(11.55±1.99)kg及(12.85±2.80)kg，两者之间无显著性差异(P>0.05)；结扎前与结扎后冠脉内径分别为：(1.72±0.19)mmvs(0.84±0.14)mm，结扎后与结扎前冠脉内径比为：0.44～0.54，平均0.48±0.04。所有实验犬均出现并保持了节段性室壁运动异常，结扎前及结扎后LVEF分别为0.65±0.08和0.56±0.08，二者差异显著(P<0.05)；术后TTC染色显示：3只犬出现小灶性心肌坏死，分别占左前降支供血区域的3%、3%、4%，1只犬出现小灶性心内膜下(小于室壁厚度的50%)心肌坏死，占左前降支供血区域的2%，余6只犬均无心肌坏死发现，染色结果与光镜及电镜观察结果一致。表明本研究成功建立了慢性缺血而无坏死的动物模型。
2.2细胞内Ca2+、Mg2-含量测定
缺血心肌细胞内Ca2+含量明显高于正常心肌[(13.48±4.26)vs(9.47±2.32)，P<0.05]；而Mg2+含量明显低于正常心肌[(19.37±5.62)vs(27.18±8.77)，P<0.05]；坏死心肌细胞内Ca2+含量亦明显高于正常心肌[(13.90±6.40)vs(9.47±2.32)，P<0.05]；而Mg2+含量明显低于正常心肌[(10.94±1.23)vs(27.18±8.77)，P<0.05](见表1)。
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表1心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量测定结果(±s，c/mmol·L-1)
*P<0.05vs正常区域
3.讨论
3.1慢性心肌冬眠动物模型的建立
本实验中，我们使犬左前降支内径减少约50%，旨在导致长期节段性室壁运动异常而不发生心肌坏死。结果显示：①结扎后与结扎前冠脉内径比值为0.44～0.54，平均0.48±0.44，达到了实验设计要求；②两次手术的间隔时间为25～55天，平均(45.2±9.59)天，是目前慢性心肌缺血动物试验报道中较长者；③所有实验犬均出现并保持了节段性室壁运动异常，LVEF测值较冠脉结扎前明显降低，证明产生了足够大的缺血范围；④手术后TTC染色、光镜及电镜检查证实，3只犬出现小于缺血区5%的透壁性心肌坏死，1只犬出现面积为缺血区2%的心内膜下心肌坏死，余6只犬均无心肌坏死发生。以上结果表明：本研究建立的慢性心肌冬眠动物模型是成功的，这为我们进一步探讨心肌冬眠的发生机制提供了可靠的研究对象。
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3.2冬眠心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量的变化正常情况下，体内的Ca2+广泛分布于包括心肌细胞在内的各组织细胞中，细胞内外Ca2+的分布相差悬殊，正常细胞内游离Ca2+浓度为100nmol/L(10-8～10-7mol/L)，而细胞外Ca2+浓度为2mmol/L(10-3～10-2mol/L)，两者相差20000倍。生理状态下，细胞内Ca2+浓度远低于细胞外及线粒体和内质网，如此大的Ca2+电化学梯度的维持，有赖于细胞膜或细胞器膜对Ca2+的较低通透性和Ca2+转运系统的调节。Ca2+的转运主要包括两方面，即由低浓度的细胞内向高浓度的细胞外或细胞器内转运和由高浓度的细胞外或细胞器向胞浆内流或释放。在缺血和缺氧状态下，细胞膜的通透性增加，Ca2+通道开放，使得细胞外Ca2+大量内流入细胞；ATP减少，使Ca+-K+-ATP酶活性降低，细胞内Na+水平升高，Na+-Ca2+交换增加，使Ca2+内流增加；ATP减少还可使肌纤维膜上的Ca2+泵活性降低，使Ca2+逆浓度差泵到细胞外的功能障碍。所有这些改变，均导致细胞内Ca2+超载[3]。由于Mg2+是Ca2+的拮抗离子，因此细胞内Mg2+含量降低。
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冬眠心肌细胞内是否存在Ca2+超载仍未达成共识，一些学者提出，尽管顿抑心肌细胞内Ca2+含量是增加的，但冬眠心肌可能是一种细胞内低钙水平的低氧供-氧需状态[4]，其机制可能是由于反复发生的心肌顿抑导致心肌细胞收缩性持续减低，从而使肌原纤维细丝对Ca2+的敏感性降低和(或)内质网对Ca2+的贮存能力降低[5，6]所致。
在本研究中，我们测量了实验犬心肌缺血区和正常区的细胞内Ca2+和Mg2+，结果显示缺血心肌细胞内Ca2+含量明显高于正常心肌，而Mg2+则明显低于正常，这与大多数学者的发现一致[7]，从而证明慢性冬眠心肌细胞内Ca2+超载，支持细胞内Ca2+超载是慢性心肌冬眠的发生机制之一。
参考文献：
[1]NHLBI,workshop on surgery in the treatment of coronary agtery diseasv: September 6 and 7, 1984, Bethesda, Maryland. Braunwald E, Hollingsworth C, Passamani E, eds[J]. Circulation, 1985, (suppl V,December)
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[2]Rahimtoola S, et al. The hibernating myocardium [J]. Am Heart J,1989,117:211
[3]王迪浔主编，病理生理学[M].北京：人民卫生出版社，1994.5:840
[4]Clapham DE. Calcium signaling[J].Cell,1995,80:259
[5]Bakker a, Thone F, Borgers M, et al. Contact sites between the inner and outer mitochondrial membranes in stunned versus hibernating myocardium[J]. Cardiovas Pathol, 1995,4:195
[6]Chiarieello M, Perrone-Filardi P, Ambrosio G. Hibernating and stunned myocardium [J]. Cardioscience, 1993,4:63
[7]Marban E. Myocardial stunning and hibernation. The physlology behind the colloquialisms[J]. Circulation, 1991,83:681
收稿日期：1998-09-08, http://www.100md.com