p16蛋白在乳腺癌中的表达及其临床意义
作者：丁志杰 齐春莲 袁媛 高华
单位：丁志杰(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)；齐春莲(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)；袁媛(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)；高华(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)
关键词：p16蛋白；乳腺疾病；乳腺肿瘤；基因
中国医科大学学报000213 摘要 目的：探讨肿瘤抑制基因MTS1的产物p16蛋白在乳腺癌，乳腺良性疾病中的表达及其临床意义。方法：采用S-P免疫组织化学方法，检测p16蛋白在30例乳腺良性疾病及50例乳腺癌中的表达。结果：p16蛋白在乳腺良性疾病中100%高强度表达，在乳腺癌中仅有50%阳性表达率，且表达强度低。p16蛋白表达与乳腺癌的组织学分级、TNM分期、淋巴结转移及预后有关。结论：MTS1基因在抑制乳腺癌的发生发展过程中可能起重要作用。p16蛋白可作为乳腺癌的一种新的标志物。
, 百拇医药
Expression of p16 Protein and its Significance in Breast Benign Diseases and Breast Cancer
Ding Zhijie, Qi Chunlian, Yuan Yuan, Gao Hua
(Cancer Institute, China Medical University, Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:The purpose of this paper was to investigate the expression of p16 in breast cancer and its significance. Methods：By using S-P immunohistochemical staining technique, we studied 30 cases of breast benign diseases and 50 cases of primary breast cancers. Results:All benign specimens showed high level of p16 with strong staining, only 50% showed weak positive staining of p16 in breast cancer. Abnormal expression of p16 were correlated with several histological parameters, such as histological grading, TNM staging lymphnode meta-
, 百拇医药
stasis and clinical prognosis. Conclusion: MTS1 gene abnormalities may play a significant role in breast cancer progression. p16 might be a new marker of breast cancer.
KEY WORDS p16 protein; breast disease; breast neoplasms; gene expression
多肿瘤抑制基因MTS1是新近发现的一种新型抑癌基因[1]。据统计，在各种癌细胞系中有MTS1基因缺失和突变的占75%，其中在乳腺癌细胞系中为30%～60%[2～4]，但在原发性乳腺癌中该基因异常改变的频率却明显降低[2～6]。本实验采用S-P免疫组化技术检测MTS1基因表达产物p16蛋白在原发性乳腺癌及乳腺良性疾病中的表达情况，并探讨其临床意义。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
取中国医科大学肿瘤研究所1989～1990年12月间手术切除的原发性乳腺癌50例,按UICC*TNM标准分期。其中30例有明确的5年随访资料。乳腺良性疾病30例，分别为乳腺单纯增生、乳腺囊性增生病、乳腺腺纤维瘤各10例。
1.2 方法
每例取两张连续切片分别作HE及免疫组化染色，按全国乳腺癌协作组标准进行病理分类，按Bloom分级法进行组织学分级。
免疫组化染色采用S-P法，p16多克隆抗体及S-P免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术公司。方法按说明书进行。免疫组化结果判定阳性显色为棕黄色。实验中以胃粘膜阳性切片为阳性对照，用PBS替代一抗作为阴性对照。最后取p16蛋白染色阳性的切片在Luzex-F图象分析仪下对显色的p16蛋白进行定量分析，测其灰度值。统计学处理采用χ2及t检验。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 p16蛋白在乳腺良性疾病中均有表达，阳性率为100%(30/30)，主要位于细胞膜上和细胞浆内，以细胞膜上较多见(图1)。而在乳腺癌中表达阳性率仅为50%(25/50)，表达部位主要是细胞浆内和细胞核上，以细胞浆内为主(图2)。二者差异有极显著意义(P<0.01)。
图1 乳腺囊性增生病p16蛋白染色强阳性 ×200
Figure l p16 protein expression () in breast cystoid hyperplasia ×200
图2 乳腺导管内乳头状腺癌p16蛋白染色弱阳性 ×400
, 百拇医药
Figure 2 p16 protein expression (+) in breast intraductal papillary carcinoma ×400
2.2 p16蛋白表达在非浸润性癌中阳性率最高(87.5%)，在浸润性非特殊型癌中阳性率最低(41.2%)，二者比较有显著差异(P<0.05)。p16蛋白表达与乳腺癌的组织学分级、TNM分期、淋巴结转移呈负相关(P<0.05)，见表1。
表1 p16蛋白表达与乳腺癌临床病理的关系(例)
Table 1 p16 protein expression correlating with
clinical histologic features 病理因素
n
, http://www.100md.com
p16蛋白表达
阴性
阳性(%)
组织学类型
非浸润性癌
8
1
7(87.5)
早期浸润性癌
4
2
2(50)
浸润性特殊型癌
, http://www.100md.com
4
2
2(50)
浸润性非特殊型癌
34
20
14(41.2)*
组织学分级
Ⅰ级
12
3
9(75)
Ⅱ级
, http://www.100md.com
12
6
6(50)
Ⅲ级
10
8
2(20)
TNM分期
Ⅰ期
8
2
6(75)
Ⅱ期
, 百拇医药 30
15
15(50)
Ⅲ期
5
5
0
Ⅳ期
2
2
0
淋巴结转移
0
24
, http://www.100md.com
7
17(70.8)
1～5个
16
9
7(43.8)
>5个
10
10
0
* 与非浸润性癌相比P<0.05
2.3 乳腺良性疾病中p16蛋白染色深，灰度值低，表达强度高，乳腺癌中则相反。二者有极显著差异(P<0.01)。不同病理类型中，非浸润性癌的p16蛋白表达强度明显高于其他三类浸润性癌，且有统计学意义(P<0.05)，见表2。
, 百拇医药
表2 不同乳腺组织中p16蛋白表达的灰度值(
±s)
Table 2 Intensity of p16 protein expression in
different breast tissues (±s) 乳腺组织
n
灰度值
乳腺单纯增生
4
107.55±11.54**
, 百拇医药
乳腺囊性增生病
5
109.26± 5.00**
乳腺腺纤维瘤
6
109.03±10.00**
非浸润性癌
6
121.83± 7.75
早期浸润性癌
4
136.01± 8.16*
, http://www.100md.com
浸润性特殊型癌
4
145.25± 5.77*
浸润性非特殊型癌
12
148.23± 3.02*
** 与乳腺癌相比P<0.01；*与非浸润性癌相比P<0.05
2.4 p16蛋白表达与原发性乳腺癌患者的预后有关。30例随访患者中p16蛋白阳性表达者的5年生存率为100%，阴性表达者5年生存率为56%，二者差异显著(P<0.05)。
3 讨论
, 百拇医药
人类恶性肿瘤的发生同细胞增殖周期的失控密切相关。现已证明MTS1基因产物p16蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制因子[7]，直接参与细胞增殖周期的调节，因此该基因结构或功能上的缺失将会导致细胞异常地生长。Brenner等在24例乳腺癌研究中发现58%存在9p21—22的杂合缺失或等位基因丢失，但突变分析仅发现有1例MTS1基因突变[4]。Geradts等用免疫组化法测定87例乳腺癌中p16蛋白表达情况，结果43例部分或完全阴性，提示p16蛋白低表达(阴性)是乳腺癌异常现象之一[8]。 但也有学者持不同的观点， Lin Xu等用SSCP及Southern杂交法检测了37例原发性乳腺癌及5个乳腺癌细胞系中MTS1基因突变频率，结果表明，40%的细胞系有MTS1基因纯合缺失，而37例乳腺癌中无1例出现突变，提示在乳腺癌形成过程中，MTS1基因突变可能不是主要的基因水平上的变化[2]。随后Berns、Quesnel等的研究也表明，MTS1基因突变在乳腺癌中极少发生，似乎与乳腺癌进展无关[3，5]。
, 百拇医药
免疫组化技术是一种检测基因蛋白水平变化的有效方法，作者用S-P法检测到p16蛋白绝大部分位于乳腺癌细胞浆内，也有少部分位于细胞核和(或)细胞膜上，而且p16蛋白表达存在异质性。本文30例乳腺良性疾病中p16蛋白100%表达，表达强度高，而在原发性乳腺癌中仅有50%的阳性表达率，表达强度低，表明MTS1基因的改变与乳腺癌的发生发展有关。本实验的50%的阳性表达率与Geradts的研究结果一致。
另外，本实验也研究了p16蛋白表达与乳腺癌的临床病理特征及预后的关系。与Geradts的研究结果不同，本实验结果表明，p16蛋白在非浸润性癌中阳性率明显高于其他三类浸润性癌，而且该类型中4例乳腺增生恶性变者100%表达强阳性，其灰度值接近良性疾病，提示在早期非浸润性癌中，MTS1基因功能丧失较少。随着组织学分级的上升、TNM分期的增加以及淋巴结的转移，p16蛋白的阳性率逐渐下降，并且组间差异有显著性(P<0.05)，说明p16蛋白表达与乳腺癌的恶性程度、临床分期、淋巴结转移呈负相关。在恶性程度高、病期较晚的肿瘤中，p16蛋白多数不表达，在淋巴结转移数大于5个的肿瘤中，p16蛋白完全丧失，提示MTS1基因的失活对乳腺癌发展的进程以及最终使癌细胞获得浸润转移的潜能产生重要作用。p16蛋白表达阳性者的5年生存率明显高于阴性表达者，提示p16蛋白表达还与患者的预后有关，可作为临床上判定预后的一个新的指标。
, 百拇医药
参考文献
1，Kamb A, Gruis NA, Feldhaus JW, et al. A cell cycle regular potentically involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264(5157):436-440
2，Xu L, Sgroi D, Sterner CJ, et al. Mutational analysis of CD KN2 in human breast carcinoma. Cancer Res, 1994,54(20):5262-5264
3，Berns EM, Klijn JG, Smid M, et al. Infrequent CDKN2 gene alterations in human primary breast cancer. Br J Cancer, 1995,72(4):964-967
, http://www.100md.com
4，Brenner AJ, Aldaz CM. Chromosome 9p alleic loss and p16/CNKN2 in breast cancer and evidence of p16 inactivation in immortal breast epithelial cells. Cancer Res, 1995,55(13):2892-2895
5，Quesnel B, Fenaux P, Philippe N, et al. Analysis of p16 gene deletion and point mutation in breast carcinoma. Br J Cancer, 1995,72(2):351-354
6，Rush EB, Abouezzi Z, Borgen PI, et al. Analysis of MTS1/CDK4 in female breast carcinomas. Cancer Lett, 1995,89(2):223-226
7，Marx J. New tumor suppressor may rival p53. Science, 1994,264(5157):344-348
8，Geradts J, Wilson PA. High frequency of aberrant p16 expre-ssion in human breast cancer. Am J Pathology, 1996,149(1):15-19
(1999-03-09收稿), 百拇医药
单位：丁志杰(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)；齐春莲(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)；袁媛(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)；高华(中国医科大学肿瘤研究所，沈阳 110001)
关键词：p16蛋白；乳腺疾病；乳腺肿瘤；基因
中国医科大学学报000213 摘要 目的：探讨肿瘤抑制基因MTS1的产物p16蛋白在乳腺癌，乳腺良性疾病中的表达及其临床意义。方法：采用S-P免疫组织化学方法，检测p16蛋白在30例乳腺良性疾病及50例乳腺癌中的表达。结果：p16蛋白在乳腺良性疾病中100%高强度表达，在乳腺癌中仅有50%阳性表达率，且表达强度低。p16蛋白表达与乳腺癌的组织学分级、TNM分期、淋巴结转移及预后有关。结论：MTS1基因在抑制乳腺癌的发生发展过程中可能起重要作用。p16蛋白可作为乳腺癌的一种新的标志物。
, 百拇医药
Expression of p16 Protein and its Significance in Breast Benign Diseases and Breast Cancer
Ding Zhijie, Qi Chunlian, Yuan Yuan, Gao Hua
(Cancer Institute, China Medical University, Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:The purpose of this paper was to investigate the expression of p16 in breast cancer and its significance. Methods：By using S-P immunohistochemical staining technique, we studied 30 cases of breast benign diseases and 50 cases of primary breast cancers. Results:All benign specimens showed high level of p16 with strong staining, only 50% showed weak positive staining of p16 in breast cancer. Abnormal expression of p16 were correlated with several histological parameters, such as histological grading, TNM staging lymphnode meta-
, 百拇医药
stasis and clinical prognosis. Conclusion: MTS1 gene abnormalities may play a significant role in breast cancer progression. p16 might be a new marker of breast cancer.
KEY WORDS p16 protein; breast disease; breast neoplasms; gene expression
多肿瘤抑制基因MTS1是新近发现的一种新型抑癌基因[1]。据统计，在各种癌细胞系中有MTS1基因缺失和突变的占75%，其中在乳腺癌细胞系中为30%～60%[2～4]，但在原发性乳腺癌中该基因异常改变的频率却明显降低[2～6]。本实验采用S-P免疫组化技术检测MTS1基因表达产物p16蛋白在原发性乳腺癌及乳腺良性疾病中的表达情况，并探讨其临床意义。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
取中国医科大学肿瘤研究所1989～1990年12月间手术切除的原发性乳腺癌50例,按UICC*TNM标准分期。其中30例有明确的5年随访资料。乳腺良性疾病30例，分别为乳腺单纯增生、乳腺囊性增生病、乳腺腺纤维瘤各10例。
1.2 方法
每例取两张连续切片分别作HE及免疫组化染色，按全国乳腺癌协作组标准进行病理分类，按Bloom分级法进行组织学分级。
免疫组化染色采用S-P法，p16多克隆抗体及S-P免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术公司。方法按说明书进行。免疫组化结果判定阳性显色为棕黄色。实验中以胃粘膜阳性切片为阳性对照，用PBS替代一抗作为阴性对照。最后取p16蛋白染色阳性的切片在Luzex-F图象分析仪下对显色的p16蛋白进行定量分析，测其灰度值。统计学处理采用χ2及t检验。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 p16蛋白在乳腺良性疾病中均有表达，阳性率为100%(30/30)，主要位于细胞膜上和细胞浆内，以细胞膜上较多见(图1)。而在乳腺癌中表达阳性率仅为50%(25/50)，表达部位主要是细胞浆内和细胞核上，以细胞浆内为主(图2)。二者差异有极显著意义(P<0.01)。
图1 乳腺囊性增生病p16蛋白染色强阳性 ×200
Figure l p16 protein expression () in breast cystoid hyperplasia ×200
图2 乳腺导管内乳头状腺癌p16蛋白染色弱阳性 ×400
, 百拇医药
Figure 2 p16 protein expression (+) in breast intraductal papillary carcinoma ×400
2.2 p16蛋白表达在非浸润性癌中阳性率最高(87.5%)，在浸润性非特殊型癌中阳性率最低(41.2%)，二者比较有显著差异(P<0.05)。p16蛋白表达与乳腺癌的组织学分级、TNM分期、淋巴结转移呈负相关(P<0.05)，见表1。
表1 p16蛋白表达与乳腺癌临床病理的关系(例)
Table 1 p16 protein expression correlating with
clinical histologic features 病理因素
n
, http://www.100md.com
p16蛋白表达
阴性
阳性(%)
组织学类型
非浸润性癌
8
1
7(87.5)
早期浸润性癌
4
2
2(50)
浸润性特殊型癌
, http://www.100md.com
4
2
2(50)
浸润性非特殊型癌
34
20
14(41.2)*
组织学分级
Ⅰ级
12
3
9(75)
Ⅱ级
, http://www.100md.com
12
6
6(50)
Ⅲ级
10
8
2(20)
TNM分期
Ⅰ期
8
2
6(75)
Ⅱ期
, 百拇医药 30
15
15(50)
Ⅲ期
5
5
0
Ⅳ期
2
2
0
淋巴结转移
0
24
, http://www.100md.com
7
17(70.8)
1～5个
16
9
7(43.8)
>5个
10
10
0
* 与非浸润性癌相比P<0.05
2.3 乳腺良性疾病中p16蛋白染色深，灰度值低，表达强度高，乳腺癌中则相反。二者有极显著差异(P<0.01)。不同病理类型中，非浸润性癌的p16蛋白表达强度明显高于其他三类浸润性癌，且有统计学意义(P<0.05)，见表2。
, 百拇医药
表2 不同乳腺组织中p16蛋白表达的灰度值(
±s)Table 2 Intensity of p16 protein expression in
different breast tissues (
±s) 乳腺组织n
灰度值
乳腺单纯增生
4
107.55±11.54**
, 百拇医药
乳腺囊性增生病
5
109.26± 5.00**
乳腺腺纤维瘤
6
109.03±10.00**
非浸润性癌
6
121.83± 7.75
早期浸润性癌
4
136.01± 8.16*
, http://www.100md.com
浸润性特殊型癌
4
145.25± 5.77*
浸润性非特殊型癌
12
148.23± 3.02*
** 与乳腺癌相比P<0.01；*与非浸润性癌相比P<0.05
2.4 p16蛋白表达与原发性乳腺癌患者的预后有关。30例随访患者中p16蛋白阳性表达者的5年生存率为100%，阴性表达者5年生存率为56%，二者差异显著(P<0.05)。
3 讨论
, 百拇医药
人类恶性肿瘤的发生同细胞增殖周期的失控密切相关。现已证明MTS1基因产物p16蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制因子[7]，直接参与细胞增殖周期的调节，因此该基因结构或功能上的缺失将会导致细胞异常地生长。Brenner等在24例乳腺癌研究中发现58%存在9p21—22的杂合缺失或等位基因丢失，但突变分析仅发现有1例MTS1基因突变[4]。Geradts等用免疫组化法测定87例乳腺癌中p16蛋白表达情况，结果43例部分或完全阴性，提示p16蛋白低表达(阴性)是乳腺癌异常现象之一[8]。 但也有学者持不同的观点， Lin Xu等用SSCP及Southern杂交法检测了37例原发性乳腺癌及5个乳腺癌细胞系中MTS1基因突变频率，结果表明，40%的细胞系有MTS1基因纯合缺失，而37例乳腺癌中无1例出现突变，提示在乳腺癌形成过程中，MTS1基因突变可能不是主要的基因水平上的变化[2]。随后Berns、Quesnel等的研究也表明，MTS1基因突变在乳腺癌中极少发生，似乎与乳腺癌进展无关[3，5]。
, 百拇医药
免疫组化技术是一种检测基因蛋白水平变化的有效方法，作者用S-P法检测到p16蛋白绝大部分位于乳腺癌细胞浆内，也有少部分位于细胞核和(或)细胞膜上，而且p16蛋白表达存在异质性。本文30例乳腺良性疾病中p16蛋白100%表达，表达强度高，而在原发性乳腺癌中仅有50%的阳性表达率，表达强度低，表明MTS1基因的改变与乳腺癌的发生发展有关。本实验的50%的阳性表达率与Geradts的研究结果一致。
另外，本实验也研究了p16蛋白表达与乳腺癌的临床病理特征及预后的关系。与Geradts的研究结果不同，本实验结果表明，p16蛋白在非浸润性癌中阳性率明显高于其他三类浸润性癌，而且该类型中4例乳腺增生恶性变者100%表达强阳性，其灰度值接近良性疾病，提示在早期非浸润性癌中，MTS1基因功能丧失较少。随着组织学分级的上升、TNM分期的增加以及淋巴结的转移，p16蛋白的阳性率逐渐下降，并且组间差异有显著性(P<0.05)，说明p16蛋白表达与乳腺癌的恶性程度、临床分期、淋巴结转移呈负相关。在恶性程度高、病期较晚的肿瘤中，p16蛋白多数不表达，在淋巴结转移数大于5个的肿瘤中，p16蛋白完全丧失，提示MTS1基因的失活对乳腺癌发展的进程以及最终使癌细胞获得浸润转移的潜能产生重要作用。p16蛋白表达阳性者的5年生存率明显高于阴性表达者，提示p16蛋白表达还与患者的预后有关，可作为临床上判定预后的一个新的指标。
, 百拇医药
参考文献
1，Kamb A, Gruis NA, Feldhaus JW, et al. A cell cycle regular potentically involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264(5157):436-440
2，Xu L, Sgroi D, Sterner CJ, et al. Mutational analysis of CD KN2 in human breast carcinoma. Cancer Res, 1994,54(20):5262-5264
3，Berns EM, Klijn JG, Smid M, et al. Infrequent CDKN2 gene alterations in human primary breast cancer. Br J Cancer, 1995,72(4):964-967
, http://www.100md.com
4，Brenner AJ, Aldaz CM. Chromosome 9p alleic loss and p16/CNKN2 in breast cancer and evidence of p16 inactivation in immortal breast epithelial cells. Cancer Res, 1995,55(13):2892-2895
5，Quesnel B, Fenaux P, Philippe N, et al. Analysis of p16 gene deletion and point mutation in breast carcinoma. Br J Cancer, 1995,72(2):351-354
6，Rush EB, Abouezzi Z, Borgen PI, et al. Analysis of MTS1/CDK4 in female breast carcinomas. Cancer Lett, 1995,89(2):223-226
7，Marx J. New tumor suppressor may rival p53. Science, 1994,264(5157):344-348
8，Geradts J, Wilson PA. High frequency of aberrant p16 expre-ssion in human breast cancer. Am J Pathology, 1996,149(1):15-19
(1999-03-09收稿), 百拇医药