人宫颈癌细胞凋亡与Bcl-2表达的研究
作者：朱克修 李旭 陈葳 杨玉琮 程小丽
单位：(西安医科大学第一附属医院妇产科 西安 710061)
关键词：细胞凋亡；Bcl-2；宫颈癌细胞
西安医科大学学报000226摘要 目的 探明Bcl-2在宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法 采用60Co和顺铂处理体外培养的3株人宫颈癌细胞株Hela、SiHa、RJC, 24h后检测细胞凋亡和Bcl-2。结果 发现放射线60Co和顺铂均可以诱发宫颈癌细胞凋亡；它们都表达Bcl-2，其表达率随着细胞凋亡的出现而下降；两种因素联合应用后诱导细胞凋亡和降低Bcl-2表达的作用增强。结论 Bcl-2的表达可能参与了宫颈癌细胞凋亡的调节过程。
中图分类号 R737.31 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0162-02
, http://www.100md.com
Studies on apoptosis and the expression of Bcl-2 in human cervical carcinoma cells
Zhu Kexiu Li Xu Chen Wei
(Department of Obstetrics & Gynecology,First Affiliated Hospital, Xi′an Medical University, Xi′an 710061，China)
ABSTRACT Objective In order to study the function of Bcl-2 in the process of apoptosis in cervical carcinoma cells.Methods 60Co and cisplatin (CDDP) were used to treat 3 cultured human cervical cancer cell lines Hela, SiHa and RJC.The characteristic apoptotic changes and the expression of Bcl-2 were obsevred after 24 hours.Results Both 60 Co and cisplatin could induce apoptosis respectively.The expression of Bcl-2 was detected in all the cell lines and was decrased with apoptotic cell death.The function of initiating apoptosis and decreasing Bcl-2 expression was enhanced when 60 Co and cisplatin were applied in combination.Cnclusion These indicate that Bcl-2 is involved in regulation of apoptosis in human cervical carcinoma cells.
, 百拇医药
KEY WORDS apoptosis Bcl-2 cervical carcinoma cells
宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，放射治疗是其主要的治疗手段。研究证明，放射线可以引起DNA链的断裂，诱发细胞凋亡[1，2]。探明辐射诱导细胞凋亡的机理有助于充分发挥放射线对肿瘤的治疗作用。我们采用培养的人宫颈癌细胞为材料，观察60Co照射和(或)顺铂作用后细胞凋亡过程中Bcl-2蛋白的变化。
1 材料与方法
1.1 材料及仪器
1.1.1 材料 细胞株：人宫颈癌细胞株Hela 、SiHa和RJC由西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心提供。单克隆抗体：FITC标记的小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体购自丹麦Dako公司。顺铂由济南齐鲁制药厂生产。
, 百拇医药
1.1.2 仪器 流式细胞仪，美国Coulter公司产品。60Co照射机，加拿大原子能有限公司(ATOMIC ENERGY OF CANADA，LIMETD)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 宫颈癌细胞生长在含10%(v/v)新生小牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃，5%(v/v)CO2条件下传代培养。
1.2.2 细胞凋亡诱导 将指数生长期的宫颈癌细胞分为4组：①60Co照射组，分4Gy,8Gy和16Gy 3种强度；②顺铂组，选用1μmol/L,20μmol/L和30μmol/L 3种浓度；③联合处理组，加顺铂(30μmol/L)作用2h后，再用60Co(16Gy)对照；④对照组，不做任何处理的各组均于处理24h后收集细胞进行检测。
, 百拇医药
1.2.3 形态学观察 将生长在盖玻片上的处理组和对照组细胞用95%(V/V)乙醇固定，HE染色，光镜下观察。
1.2.4 Bcl-2测定 将经过16Gy照射，30μmol/L顺铂作用，联合处理以及对照组的细胞分别收集，用含10%(V/V)甲醛的PBS固定15min，PBS洗涤后再用70%(V/V)乙醇固定30min，再将细胞分为两组(每组1×106个细胞)，分别加入荧光标记的小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体和阴性对照抗体，4℃孵育30min后用流式细胞仪测定Bcl-2。
2 结 果
2.1 细胞形态学改变 3株宫颈癌细胞经过60Co照射或顺铂作用后均出现细胞皱缩，体积变小，染色质斑块状聚集在核膜下，并有凋亡小体(见附图)。这种改变随着照射剂量和药物浓度的增加更为明显，SiHa细胞在照射剂量为4Gy，顺铂浓度为1μmol/L就呈现细胞凋亡的变化，表现出以放射线和顺铂的高度敏感性。联合处理后，凋亡细胞的数量均明显比单一因素处理的增多。
, 百拇医药
附图 60Co照射SiHa细胞后凋亡小体(10×100)
2.2 Bcl-2的变化 Hela,BiHa和RJC细胞均可检测到Bcl-2的表达，以RJC细胞的阳性率最高，达75.4%。应用60Co照射和顺铂作用均可引起细胞Bcl-2表达改变。宫颈癌细胞凋亡明显时Bcl-2表达情况见附表。
附表 60Co和顺铂对宫颈癌细胞Bcl-2表达的影响 细胞
处理条件
Bcl-2阳
性率(%)
Hela
1.对照
, 百拇医药
32.4
2.60Co(16Gy)
28.0
3.顺铂(30μmol/L)
15.5
4.60Co(16Gy)+顺铂(30μmol/L)
14.0
SiHa
1.对照
29.0
2.60Co(16Gy)
, 百拇医药
15.3
3.顺铂(30μmol/L)
15.9
4.60Co(16Gy)+顺铂(30μmol/L)
6.5
RJC
1.对照
75.4
2.60Co(16Gy)
60.3
3.顺铂(30μmol/L)
, 百拇医药
40.5
4.60Co(16Gy)+顺铂(30μmol/L)
35.0
3 讨 论
电离辐射引起的DNA损伤和细胞周期紊乱可以导致细胞死亡。在辐射诱发的细胞凋亡过程中，Bcl-2、p53和C-myc基因可能影响细胞凋亡的过程和细胞对辐射的敏感性[3，4]。本实验的结果支持Bcl-2蛋白可以帮助细胞抵御各种有害损伤，如γ-射线、紫外线、质脂过氧化、地塞米松、细胞毒性药物、血清和细胞因子缺如等引起细胞凋亡的观点[5]。
Bcl-2基因产物定位于线粒体膜、核膜和内质网膜上，具有保障细胞存在的特性。过量表达的Bcl-2蛋白可以维持线粒体膜电位梯度，防止线粒体破坏，增加肿瘤细胞对各种化疗药物和放射线的抵抗性[6，7]。Bcl-2抑制细胞凋亡的主要途径有：抑制活性氧对细胞的损害；调节Ca2+流入细胞；影响线粒体膜的渗透性转换；调控凋亡执行蛋白caspase的激活因子，如细胞色素C和凋亡诱导因子的释放；抑制Apaf-1与caspase-9的终止，阻止因后者活化触发的细胞凋亡[8～10]。
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正常宫颈外口鳞状上皮的基底细胞、储备细胞和宫颈内口的柱状上皮细胞可有Bcl-2蛋白的表达，CINⅢ级中Bcl-2蛋白的过表达率高于宫颈癌[10]。我们使用的三种宫颈癌细胞株均表达Bcl-2蛋白，其中RJC的Bcl-2阳性细胞数量高。当它们接受60Co处理时，都表现了细胞凋亡的改变，同时伴有Bcl-2表达下降，以Bcl-2基础表达率低的SiHa和Hela细胞降低明显，表明Bcl-2的表达变化参与了放射线诱导的宫颈癌细胞凋亡。
单独应用顺铂，宫颈癌细胞同卵巢癌细胞一样，也发生细胞凋亡，Bcl-2蛋白的表达也降低[11]。当与放射线共同作用后，细胞凋亡的变化和Bcl-2的降低均更加显著，以SiHa细胞的变化最为明显。表明两者联合处理对抑制宫颈癌细胞生长有协同作用，宫颈癌细胞对影响细胞生长的化疗药物和放射线存在着敏感性差异。这些结果为临床上采用放、化疗联合治疗宫颈癌提供了理论依据，提示放疗前检测宫颈癌细胞对放射线的敏感性有重要的临床意义，Bcl-2表达可能是一个重要的预后指标。 参考文献
, http://www.100md.com
1，Zhivotovsky B,Nicotera P,Bellomo G et al.Ca2+ and endonuclease activation in radiation-induced lymphord cell death[J].Exp Cell Res,1993;207(1)∶163
2，朱克修，李旭，陈葳等.放射线诱导人宫颈癌细胞凋亡的研究[J].中国实用 妇科与产科杂志，1999；15(8)∶467
3，Chen M,Quintans J,Fuks 2 et al.Suppression of Bcl-2 messenger RN A pr oduction may mediate apoptosis after ionizing radiation, tumor necrosis factor α, and ceramide[J]. Cancer Res, 1995;55(5)∶991
, 百拇医药
4，夏寿萱主编.放射生物学[M].第1版，北京：军事医学科学出版社，1998∶20 9～212
5，Kane DJ,Sarafian TA, Anton P et al.Bcl-2 inhibition of neural de ath;d ecreased generation of reactive oxygen species[J].Science, 1993;262(5137)∶127 4
6，Zamzami N,Susin SA,Marchetti P et al.Mitochondrial control of nucl ear apoptosis [J].J Exp Med, 1996;183(4)∶1533
7，Fisher TC, Milner AE, Gregory CD et al.Bcl-2 modulation of apopt osis induced by anticancer drugs:Resistance to thymidylate stress is independent of c lassical resistance pathways[J].Cancer Res,1993;1993;53(8)∶3321
, 百拇医药
8，Green DR and Reed JC.Mitochoudria and Apoptosis[J].Science, 1998;28 1(5381)∶1309
9，Adams JM and Cory S.The Bcl-2 protein family:arbiters of cell surviv as[J].Science, 1998;281(5381)∶1322
10，Ter-Harmsel B, Smedts F, Kuijpers J et al.Bcl-2 immunoreactivi ty i ncreases with severity of of CIN:a study of normal cervical epithelia,CIN , and cervical carcinoma[J].J Pathol,1996;179(1)∶26
11，刘勤，陈葳，李旭等.顺铂诱导人卵巢癌AO10/17细胞凋亡的实验研究[J]. 中华妇产科杂志，1998；33(7)∶422
(1999-09-11收稿 1999-10-02修回), 百拇医药
单位：(西安医科大学第一附属医院妇产科 西安 710061)
关键词：细胞凋亡；Bcl-2；宫颈癌细胞
西安医科大学学报000226摘要 目的 探明Bcl-2在宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法 采用60Co和顺铂处理体外培养的3株人宫颈癌细胞株Hela、SiHa、RJC, 24h后检测细胞凋亡和Bcl-2。结果 发现放射线60Co和顺铂均可以诱发宫颈癌细胞凋亡；它们都表达Bcl-2，其表达率随着细胞凋亡的出现而下降；两种因素联合应用后诱导细胞凋亡和降低Bcl-2表达的作用增强。结论 Bcl-2的表达可能参与了宫颈癌细胞凋亡的调节过程。
中图分类号 R737.31 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0162-02
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Studies on apoptosis and the expression of Bcl-2 in human cervical carcinoma cells
Zhu Kexiu Li Xu Chen Wei
(Department of Obstetrics & Gynecology,First Affiliated Hospital, Xi′an Medical University, Xi′an 710061，China)
ABSTRACT Objective In order to study the function of Bcl-2 in the process of apoptosis in cervical carcinoma cells.Methods 60Co and cisplatin (CDDP) were used to treat 3 cultured human cervical cancer cell lines Hela, SiHa and RJC.The characteristic apoptotic changes and the expression of Bcl-2 were obsevred after 24 hours.Results Both 60 Co and cisplatin could induce apoptosis respectively.The expression of Bcl-2 was detected in all the cell lines and was decrased with apoptotic cell death.The function of initiating apoptosis and decreasing Bcl-2 expression was enhanced when 60 Co and cisplatin were applied in combination.Cnclusion These indicate that Bcl-2 is involved in regulation of apoptosis in human cervical carcinoma cells.
, 百拇医药
KEY WORDS apoptosis Bcl-2 cervical carcinoma cells
宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，放射治疗是其主要的治疗手段。研究证明，放射线可以引起DNA链的断裂，诱发细胞凋亡[1，2]。探明辐射诱导细胞凋亡的机理有助于充分发挥放射线对肿瘤的治疗作用。我们采用培养的人宫颈癌细胞为材料，观察60Co照射和(或)顺铂作用后细胞凋亡过程中Bcl-2蛋白的变化。
1 材料与方法
1.1 材料及仪器
1.1.1 材料 细胞株：人宫颈癌细胞株Hela 、SiHa和RJC由西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心提供。单克隆抗体：FITC标记的小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体购自丹麦Dako公司。顺铂由济南齐鲁制药厂生产。
, 百拇医药
1.1.2 仪器 流式细胞仪，美国Coulter公司产品。60Co照射机，加拿大原子能有限公司(ATOMIC ENERGY OF CANADA，LIMETD)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 宫颈癌细胞生长在含10%(v/v)新生小牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃，5%(v/v)CO2条件下传代培养。
1.2.2 细胞凋亡诱导 将指数生长期的宫颈癌细胞分为4组：①60Co照射组，分4Gy,8Gy和16Gy 3种强度；②顺铂组，选用1μmol/L,20μmol/L和30μmol/L 3种浓度；③联合处理组，加顺铂(30μmol/L)作用2h后，再用60Co(16Gy)对照；④对照组，不做任何处理的各组均于处理24h后收集细胞进行检测。
, 百拇医药
1.2.3 形态学观察 将生长在盖玻片上的处理组和对照组细胞用95%(V/V)乙醇固定，HE染色，光镜下观察。
1.2.4 Bcl-2测定 将经过16Gy照射，30μmol/L顺铂作用，联合处理以及对照组的细胞分别收集，用含10%(V/V)甲醛的PBS固定15min，PBS洗涤后再用70%(V/V)乙醇固定30min，再将细胞分为两组(每组1×106个细胞)，分别加入荧光标记的小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体和阴性对照抗体，4℃孵育30min后用流式细胞仪测定Bcl-2。
2 结 果
2.1 细胞形态学改变 3株宫颈癌细胞经过60Co照射或顺铂作用后均出现细胞皱缩，体积变小，染色质斑块状聚集在核膜下，并有凋亡小体(见附图)。这种改变随着照射剂量和药物浓度的增加更为明显，SiHa细胞在照射剂量为4Gy，顺铂浓度为1μmol/L就呈现细胞凋亡的变化，表现出以放射线和顺铂的高度敏感性。联合处理后，凋亡细胞的数量均明显比单一因素处理的增多。
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附图 60Co照射SiHa细胞后凋亡小体(10×100)
2.2 Bcl-2的变化 Hela,BiHa和RJC细胞均可检测到Bcl-2的表达，以RJC细胞的阳性率最高，达75.4%。应用60Co照射和顺铂作用均可引起细胞Bcl-2表达改变。宫颈癌细胞凋亡明显时Bcl-2表达情况见附表。
附表 60Co和顺铂对宫颈癌细胞Bcl-2表达的影响 细胞
处理条件
Bcl-2阳
性率(%)
Hela
1.对照
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32.4
2.60Co(16Gy)
28.0
3.顺铂(30μmol/L)
15.5
4.60Co(16Gy)+顺铂(30μmol/L)
14.0
SiHa
1.对照
29.0
2.60Co(16Gy)
, 百拇医药
15.3
3.顺铂(30μmol/L)
15.9
4.60Co(16Gy)+顺铂(30μmol/L)
6.5
RJC
1.对照
75.4
2.60Co(16Gy)
60.3
3.顺铂(30μmol/L)
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40.5
4.60Co(16Gy)+顺铂(30μmol/L)
35.0
3 讨 论
电离辐射引起的DNA损伤和细胞周期紊乱可以导致细胞死亡。在辐射诱发的细胞凋亡过程中，Bcl-2、p53和C-myc基因可能影响细胞凋亡的过程和细胞对辐射的敏感性[3，4]。本实验的结果支持Bcl-2蛋白可以帮助细胞抵御各种有害损伤，如γ-射线、紫外线、质脂过氧化、地塞米松、细胞毒性药物、血清和细胞因子缺如等引起细胞凋亡的观点[5]。
Bcl-2基因产物定位于线粒体膜、核膜和内质网膜上，具有保障细胞存在的特性。过量表达的Bcl-2蛋白可以维持线粒体膜电位梯度，防止线粒体破坏，增加肿瘤细胞对各种化疗药物和放射线的抵抗性[6，7]。Bcl-2抑制细胞凋亡的主要途径有：抑制活性氧对细胞的损害；调节Ca2+流入细胞；影响线粒体膜的渗透性转换；调控凋亡执行蛋白caspase的激活因子，如细胞色素C和凋亡诱导因子的释放；抑制Apaf-1与caspase-9的终止，阻止因后者活化触发的细胞凋亡[8～10]。
, http://www.100md.com
正常宫颈外口鳞状上皮的基底细胞、储备细胞和宫颈内口的柱状上皮细胞可有Bcl-2蛋白的表达，CINⅢ级中Bcl-2蛋白的过表达率高于宫颈癌[10]。我们使用的三种宫颈癌细胞株均表达Bcl-2蛋白，其中RJC的Bcl-2阳性细胞数量高。当它们接受60Co处理时，都表现了细胞凋亡的改变，同时伴有Bcl-2表达下降，以Bcl-2基础表达率低的SiHa和Hela细胞降低明显，表明Bcl-2的表达变化参与了放射线诱导的宫颈癌细胞凋亡。
单独应用顺铂，宫颈癌细胞同卵巢癌细胞一样，也发生细胞凋亡，Bcl-2蛋白的表达也降低[11]。当与放射线共同作用后，细胞凋亡的变化和Bcl-2的降低均更加显著，以SiHa细胞的变化最为明显。表明两者联合处理对抑制宫颈癌细胞生长有协同作用，宫颈癌细胞对影响细胞生长的化疗药物和放射线存在着敏感性差异。这些结果为临床上采用放、化疗联合治疗宫颈癌提供了理论依据，提示放疗前检测宫颈癌细胞对放射线的敏感性有重要的临床意义，Bcl-2表达可能是一个重要的预后指标。 参考文献
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5，Kane DJ,Sarafian TA, Anton P et al.Bcl-2 inhibition of neural de ath;d ecreased generation of reactive oxygen species[J].Science, 1993;262(5137)∶127 4
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8，Green DR and Reed JC.Mitochoudria and Apoptosis[J].Science, 1998;28 1(5381)∶1309
9，Adams JM and Cory S.The Bcl-2 protein family:arbiters of cell surviv as[J].Science, 1998;281(5381)∶1322
10，Ter-Harmsel B, Smedts F, Kuijpers J et al.Bcl-2 immunoreactivi ty i ncreases with severity of of CIN:a study of normal cervical epithelia,CIN , and cervical carcinoma[J].J Pathol,1996;179(1)∶26
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(1999-09-11收稿 1999-10-02修回), 百拇医药