原癌基因c-myc和白血病
作者：陈琳
单位：福建医科大学附属协和医院，福建省血液病研究所，福州 350001
关键词：原癌基因；蛋白质C-myc类；基因,myc；白血病；基因表达
福建医科大学学报000248
中图分类号:Q754;Q786;R733.7 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0202-03
近年研究表明，白血病的发生与细胞原癌基因的激活和抑癌基因的缺失或突变有着密切的关系。其中原癌基因c-myc是目前研究最为广泛的癌基因之一，其基因扩增和过度表达，可促进细胞增殖、抑制细胞分化。在某些因素引起细胞增殖停滞时，c-myc基因的持续表达还可促进细胞凋亡。并且发现c-myc在白血病中高度表达与白血病的发生、发展及预后有关。笔者就c-myc基因的结构、功能及其在白血病中的表达与意义作一综述。
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1.c-myc基因的结构和功能
myc基因家族成员有3个：cell-myc(c-myc)、human-myc(N-myc)和myc-related-gene(L-myc)。它们具有类似的结构和功能。人类c-myc原癌基因定位于8q24区，由3个外显子和2个内含子组成。第1外显子无编码序列，是转录控制区，只起调节作用。外显子2和3是转译区，编码包含439个氨基酸残基的蛋白质，分子量为49 kD。外显子1,2,3共同编码分子量为65 kD的蛋白质，定位于核内，为核转录调节因子。该蛋白质位于N端143个氨基酸区域富含脯氨酸、谷氨酸残基，为转录激活区(transcription activation domain，TAD)；第320-328氨基酸处含有将胞质中合成的Myc蛋白质转运至核内的信息，为核定位区；位于C端355～439位氨基酸，包含有形成二聚体的特征性结构，为二聚体形成结构域:包括碱性结构域(B)，螺旋一回转一螺旋结构域(HLH)及亮氨酸拉链区(LZP)。C-myc蛋白通常和细胞内其他蛋白质结合，其中最主要的是具有BHLHLZ结构的蛋白MAX。C-myc和MAX形成MYC-MAX异二聚体，在核内通过和具有CACGTG核心序列的靶基因结合，反式激活靶基因的转录[1]，从而发挥c-myc作用。
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近年发现的具有类似结构的蛋白MAD1和MAD2(MXIL1)也能和MAX形成异二聚体[2]，竞争MAX与MYC的结合，对MYC-MAX异二聚体具有拮抗作用，从而调节MYC的功能[3]。
2.c-myc在造血细胞发育及白血病发生中的作用
c-myc原癌基因编码的转录产物C-myc蛋白与细胞周期密切相关，参与DNA聚合酶的活性，并调节细胞的增殖和分化[4]。在正常细胞的静止状态和终末分化后，C-myc表达受抑，mRNA水平降低；正常细胞增殖时，C-myc表达一过性激活，并在蛋白质合成开始前受到抑制。如正常人淋巴细胞和成纤维细胞在受到ConA、LPS、PHA及PDGF等丝裂原刺激后，c-myc的mRNA水平迅速升高20～40倍，并在1～3 h内达到高峰，然后下降，1～2天后降至原来基线水平[5]。c-myc只是在正常细胞的增殖早期发挥着一定生理作用，使细胞从G0期或G1期进入S期[6]。研究表明，鼠MEL，HL60，U937等细胞株的体外分化过程中伴随着C-myc表达下降[4～6]。类似的研究也说明C-myc的表达与造血细胞的分化成负相关。当HL60细胞受诱导分化剂作用向成熟粒细胞或单核细胞分化时，C-myc的表达减弱[7]。
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c-myc基因以重排，扩增与高表达方式，使C-myc蛋白异常升高。在白血病的发生中，其异常表达与其他调控机制及多种癌基因协同作用下，通过促进DNA合成与转录，缩短细胞倍增时间，同时抑制细胞分化，促进细胞增殖，最终导致白血病的发生。
C-myc表达和白血病发生有关，因为(1)C-myc表达与白血病预后有关；(2)白血病复发时C-myc表达增高；(3)CML急变时C-myc高表达。用反义技术也证明这一点。1988年Wickstrom[8]和Holt[9]分别合成15个碱基长度的c-myc mRNA的反义寡聚脱氧核苷酸ASODN在体外与HL60细胞共培养后，有效地抑制c-myc的表达，细胞生长受到抑制，同时抑制白血病细胞集落的形成。研究认为c-myc反义核酸对白血病细胞生长的抑制是通过抑制c-myc基因表达实现的，同时也表明c-myc基因在白血病发生中起重要的作用。
3.c-myc基因在白血病中的表达及其在检测残留白血病中的意义
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c-myc原癌基因在多种人类肿瘤细胞中均有扩增和高表达。1982年Collins等[10]首次报道了HL60细胞株和早幼粒细胞白血病病人的白血病细胞中c-myc基因高表达。Gopal等[11]研究进一步表明，急性淋巴细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病C-myc表达最强，慢粒(CML)、骨髓增殖异常综合症(MDS)和多发性骨髓瘤(MM)C-myc蛋白表达远低于急性白血病，但明显高于正常对照，淋巴瘤的C-myc表达最低，可能是由于瘤细胞很少累及骨髓所致。C-myc的异常表达与急性白血病的FAB分型无相关性，但c-myc mRNA和蛋白表达水平的检测对白血病的病程演进，疗效评价和预后估计均有一定意义[12]。Venturelli等[13]发现化疗有效的白血病患者在化疗开始24 h后c-myc mRNA水平就明显降低，若化疗无效或不缓解常可检测到c-myc mRNA和蛋白表达呈持续高水平。缓解后复发的患者在未出现其他临床征象之前就可查到骨髓中有C-myc的高水平表达。Harvey等[12]应用Northern Blot分析急非淋白血病患者化疗前后骨髓中c-myc mRNA水平变化的研究中发现白血病细胞c-myc mRNA高表达的患者很难在化疗药物的诱导下达到完全缓解，即使已诱导缓解，其缓解期也明显短暂，反之c-myc表达水平越低，患者的完全缓解率越高，无病生存期也越长。慢粒慢性期患者骨髓或外周血中c-myc高表达常预示病情将向急变期发展。Evinger-Hodges等[14]用myc探针在10例白血病短期缓解的病人中检测到7例有c-myc高表达，其中5例在半年内复发，而长期存活者(缓解期14～78个月)均无c-myc的高表达。这可能是由于C-myc高水平表达与白血病细胞自我更新能力提高和/或对化疗反应诱导分化不敏感有关所致。这些研究结果均表明，检测白血病c-myc基因的表达水平是反映白血病细胞恶性程度判断预后的重要指标之一。
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c-myc几乎在各型的白血病中均有表达，在单个白血病原始细胞中c-myc基因表达量显著高于分化水平与之一致的正常骨髓细胞，故c-myc探针也可作为检测残留白血病的特异性指标。
急性白血病化疗和骨髓移植中最主要的问题是不能明确完全缓解期和骨髓移植后白血病细胞被杀伤的程度以及残留白血病细胞的量。组化检测的限度为1%-5%。PCR技术已被用来检测残留白血病细胞。虽然PCR的检出率为10-4～10-5，但只能用来检测那些肿瘤特异性基因标记，如慢粒bcr/abl基因及M3 PML/RARα基因，应用范围窄。由于c-myc在各种类型白血病中的表达均增加，用RT-PCR法定量检测c-myc的表达以检测微小残留病变(MRD)，几乎可用于各种类型的白血病，对早期预测复发及判定预后、制定个体化疗方案有一定的临床意义。
4.C-myc与白血病细胞凋亡
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C-myc蛋白既可推进细胞周期，促进细胞增殖，抑制细胞分化，又可介导细胞凋亡PCD的发生。Freytag等[15]研究发现C-myc蛋白的增殖功能和凋亡功能有密切关系。C-myc蛋白参与转录调节，DNA结合异二聚体形成的功能区都是它发挥凋亡功能所必须的，因此C-myc对于凋亡和增殖调节的基本机制是一致的[15]。Evan[16]报道，用小鼠IL-3依赖性髓细胞(32D)进行培养，发现去除IL-3后，c-myc基因立即下调，结果细胞停止于G1期。将携带c-myc基因的载体转染32D细胞，获得稳定表达c-myc基因的32D细胞克隆。这种细胞去除IL-3后不停止于G1期，而是启动凋亡。这个实验说明一旦细胞增殖停滞，c-myc基因会启动凋亡。为什么c-myc基因既可促进细胞增殖，同时又可促进凋亡呢？目前认为由于C-myc蛋白中促进细胞凋亡与促进细胞增殖的功能区是同一个区，C-myc的表达只提供一个启动细胞增殖或凋亡的信号，需有第二个生长信号刺激后才能抑制细胞凋亡，促进细胞进入增殖状态，若没有第二个信号则自动进入凋亡。C-myc起介导凋亡的作用，可能主要影响凋亡的启动。C-myc先和MAX结合成异二聚体MYC-MAX，再经MYC-MAX和DNA结合通过控制诱导凋亡所需要的转录而对C-myc诱导的细胞凋亡进行调控[17]。近年来，许多学者报告C-myc能直接或间接地诱导或抑制多种基因的表达。其中，受C-myc抑制的基因包括Ⅱ类MHC、胶原、LFA-1α、细胞周期蛋白D1和c/EBPα以及C-myc自身等。C-myc也诱导多种基因表达如鸟氨酸脱羧酶(ODC)、α-prothymosin、ECA39、elF4E、elF2α、细胞周期蛋白A和E、hsp70以及乳酸脱氢酶(LDH)等。关于这些靶基因在C-myc诱导细胞凋亡中的作用已有广泛研究。例如，像C-myc基因一样，ODC基因高表达足以诱导凋亡。使用ODC活性抑制剂DFMO可抑制C-myc诱导细胞凋亡的活性。但是ODC诱导凋亡的作用没有C-myc大，DFMO也只是部分地抑制C-myc诱导凋亡的作用[18]。研究还发现，C-myc诱导的成纤维细胞凋亡需要P53,并且和P53的稳定性有关。然而，这种效应可能具有细胞特异性。此外，C-myc诱导的细胞凋亡可被抗氧化剂和Bcl-2抑制，而且Bcl-2也具有抗氧化特性。因而推测，ROS(活性氧)或某些活性氧产物增加可能导致凋亡发生。
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1992年Evan等[16]发现以不同方式在细胞周期的不同阶段急剧降低鼠细胞中的myc蛋白的水平会诱导细胞凋亡。在低血清培养条件下培养表达不同水平的myc蛋白的细胞亚克隆，发现myc蛋白的含量越高对低血清培养越敏感，出现细胞凋亡早，程度也严重。低血清培养中有丝分裂因子减少，可使细胞的C-myc表达降低。因此推论急剧降低C-myc水平可导致C-myc高表达的肿瘤细胞进入凋亡，而对C-myc表达量很低的正常细胞则不产生明显的影响。1995年Kimura等[19]发现应用反义核酸持续抑制C-myc的表达能诱导HL60细胞的凋亡，去除c-myc反义核酸后，c-myc表达上调，凋亡细胞数由原来的3.5%上升至32%。Thompson等[20]类似研究应用糖皮质激素处理淋巴瘤细胞使得瘤细胞的C-myc转录快速下调而引起凋亡。以上研究表明细胞的凋亡是由于C-myc蛋白的不当表达所引起，在c-myc基因表达发生急剧变化时可诱导细胞凋亡。
5.c-myc反义技术在白血病基因治疗中的应用
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c-myc基因做为靶基因，是反义技术用于抑制癌基因表达研究最早也是最多的癌基因。包括反义DNA，反义RNA，Ribozyme及三股螺旋DNA-Triplex等。
5.1 反义DNA 80年代末期Heikkila等[21]首先合成了人c-myc基因的反义核酸，作用于人T淋巴细胞，发现AS-ODN可抑制PHA刺激的T细胞C-myc蛋白表达，同时阻止细胞进入S期。其后Wickstrom和Holt等[8，9]分别用人工合成的与c-myc第二外显子起始转录序列互补的15 mer AS-ODN阻断人早幼粒细胞性白血病细胞株HL60中c-myc原癌基因的表达，结果发现它能抑制瘤细胞的增殖，并诱导终末分化，且其作用效应与其作用浓度存在一定的相关性。1995年Kimura[19]等类似研究报道亦证实了上述现象，并且发现c-myc AS-ODN持续抑制c-myc的表达能诱导HL60细胞凋亡，而一旦撤去这种抑制，却能诱导更多的HL60细胞进入凋亡。
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5.2 反义RNA 80年代末，Lachman[22]等将鼠的myc cDNA片段(1.36 kb，含c-myc编码序列及5'端，3'端非编码序列)以顺式和反式方向克隆入鼠MT-1基因启动子下游，构建了重组质粒PMT-myc，并转染入鼠红白血病细胞株MEL，结果发现由反式插入的重组质粒转染的MEL细胞c-myc mRNA表达被阻断，细胞向终末分化。日本学者Yokoyama等[23]将c-myc反义核酸的重组质粒用原生质体融合方法转入HL60细胞，观察到6个月内HL60可表达高水平反义c-myc，HL60细胞生长抑制，向单核细胞终末分化，c-myc基因转录抑制，且C-myc蛋白表达水平降低70%以上。
5.3 三股螺旋 当反义核酸碱基进入双链DNA后与其形成稳定的不可逆的三维螺旋结构，竞争抑制激活转录的蛋白与基因启动子结合，干扰基因的转录。Cooney等[24]在体外实验中通过三维螺旋体的方法抑制了c-myc的转录。
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5.4 核酶 核酶是具有催化活性的RNA分子，能序列特异地切割靶RNA。核酶通过两侧的引导序列与底物以碱基互补形成杂交链，具有更高的底物特异性。核酶切割完靶RNA后即从杂交链上解离下来，对新的靶RNA进行切割。核酶技术已成为近年来基因治疗的一种新方法，栾荣华等[25]根据c-myc癌基因第二外显子作为核酶的靶RNA区设计能特异性地切割大鼠c-myc癌基因mRNA的锤头状核酶，在理论上具有一定的生物活性。
Skorski等[26]体外单用或同时使用BCR/ABL和c-myc反义核酸处理CML原始细胞，结果表明同时使用BCR/ABL和c-myc反义核酸引起基因表达下调，抗CML细胞增殖作用明显强于各自单独使用，而对正常骨髓克隆的形成无影响。将BCR/ABL和/或c-myc反义核酸处理过的CML原始细胞注射入SCID小鼠，用流式细胞仪、RT-PCR等技术分析鼠组织细胞悬液的白血病细胞，发现两种反义核酸同时处理的小鼠病程延缓，生存期延长，效果比单用者明显。葛乐等通过c-myc和/或bcl-2基因的反义核酸对HL60和原代白血病细胞的影响研究也发现针对多癌基因反义核酸在逆转白血病细胞恶性表型，抑制癌细胞恶性生长方面表现出协同效应。因此，我们认为，针对多个有协同作用癌基因的多种反义核酸同时应用，在ABMT体外净化和白血病治疗中具有广阔的前景。
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作者简介:陈 琳(1970～)，女，主治医师，医学硕士.
参考文献:
[1]Amati B,Brooks,MW,Levy N,et al.Oncogenic activity of the c-myc protein requires dimerization with Max[J].Cell,1993,72(2): 233～245.
[2]Zervos AS,Gyuris J,Brent R，et al.Mxil,a protein that specifically interacts with Max to bind Myc-Max recognition sites[J].Cell,1993,72:223～232.
[3]Ayer DE,Kretzner L,Eisenman RN,et al.Mad: a heterodimeric partner for Max that antagonizes Myc transcriptional activity[J].Cell,1993,72:211～222.
, 百拇医药
[4]Spencer CA,Groudine M.Control of c-myc regulation in normal and neoplastic cells[J].Adv Cancer Res，1991,56:1～48.
[5]Blick M,Westin E,Gutterman J,et al.Oncogene expression in human leukemia[J].Blood,1984,64:1234～1239.
[6]Mc Clain KL.Expression of oncogenes in human leukemias[J].Cancer Res,1984,44:5382～5389.
[7]Bino GD,Li X,Traganos F,et al.Altered susceptibility of differentiating HL-60 cells to apoptosis induced by antitumor drugs[J].Leukemia,1994,8:281～288.
, 百拇医药
[8]Wickstrom EL,Bacon TA,Gonzalez A,et al.Human promyelocytic leukemia HL-60 cell proliferation and c-myc protein expression are inhibited by an antisense pentadecadeoxynucleotide targeted against c-myc mRNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:1028～1032.
[9]Holt JT,Redner RL,Nienhuis AW,et al.An oligomer complementary to c-myc mRNA inhibits proliferation of HL-60 promyelocytic cells and induces differentiation[J].Mol cell Biol,1988,8(3):963～973.
, 百拇医药
[10]Collins S.Amplification of endogenous myc-related DNA sequences in a human myeloid leukaemia cell line[J].Nature,1982,298:679～681.
[11]Gopal V,Hulette B,Li Yaqin,et al.C-myc and C-myb expression in acute myelogenous leukemia[J].Leuk Res,1992,16(10):1003～1011.
[12]Preisler HD，Raza A，Larson R,et al.Protooncogene expression and the clinical characteristics of acute nonlymphocytic leukemia: a leukemia intergroup pilot study[J].Blood,1989,73:255～262.
, http://www.100md.com
[13]Venturelli D,Lange B,Narni F,et al.Prognostic significance of "short-term" effects of chemotherapy on myc and histone H3 mRNA levels in acute leukemia patients[J].Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:3590～3594.
[14]Evinger-Hodges M J et al.Myc and sis expression in acute myelogenous leukemia[J].Leukemia,1988,2:45.
[15]Freytag SO.Definition of the activities and properties of c-myc required to inhibit cell differentiation[J].Cell Growth Differ,1990,1:339.
, 百拇医药
[16]Evan GI,Wyllie AH,Gilbert CS,et al.Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein[J].Cell,1992,69(1):119～128.
[17]Bissonnette RP,McGahon A,Mahboubi A,et al.Functional Myc-Max heterodimer is required for activation-induced apoptosis in T cell hybridomas[J].J Exp Med,1994,180(6):2413～2418.
[18]Packham G,Cleveland JL,et al.Ornithine decarboxylase is a mediator of C-myc-induced apoptosis[J].Mol Cell Biol,1994,14(9):5741～5747.
, 百拇医药
[19]Kimura S,Maekawa T,Hirakawak,et al.Alterations of c-myc expression by antisense oligodeoxynucleotides enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells[J].Cancer Res,1995,55:1379～1384.
[20]Thompson EB et al.Glucocoreticoid antagonist RU486 reverses agonist induced apoptosis and c-myc retression in human leukemic CEM-C7 cells[J].Ann NY Acad Sci,1995,12:761:261.
[21]Heikkila R,Schwab G,Wickstrom E,et al.A c-myc antisense oligodeoxynucleotide inhibits entry into S phase but not progress from G0 to G1[J].Nature,1987,328:445～449.
, 百拇医药
[22]Lachman HM,Cheng G,Skoultchi AI.Transfection of mouse erythroleukemia cells with myc sequences changes the rate of induced commitment to differentiate[J].PNAS USA,1986,83:6480～6484.
[23]Yokoyama K,Imamoto F.Transcriptional control of the endogenous myc proto oncogene by antisense RNA[J].PNAS USA,1987,84:7363～7367.
[24]Cooney M,Czernuszewicz G,Postel EH,et al.Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro[J].Science,1988,241:456～459.
, 百拇医药
[25]栾荣华,贾国良,连建奇,等.特异性切割大鼠c-myc癌基因mRNA核酶的设计[J].第四军医大学学报,1998,19(2):228～229.
[26]Skorski T,Nieborowska SM,Campbell K,et al.Leukemia treatment in severe combined immunodeficiency mice by antisense oligodeoxynucleotides targeting cooperation oncogenes[J].J Exp Med,1995,182(6):1645～1653.
收稿日期:1999-12-16, 百拇医药
单位：福建医科大学附属协和医院，福建省血液病研究所，福州 350001
关键词：原癌基因；蛋白质C-myc类；基因,myc；白血病；基因表达
福建医科大学学报000248
中图分类号:Q754;Q786;R733.7 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0202-03
近年研究表明，白血病的发生与细胞原癌基因的激活和抑癌基因的缺失或突变有着密切的关系。其中原癌基因c-myc是目前研究最为广泛的癌基因之一，其基因扩增和过度表达，可促进细胞增殖、抑制细胞分化。在某些因素引起细胞增殖停滞时，c-myc基因的持续表达还可促进细胞凋亡。并且发现c-myc在白血病中高度表达与白血病的发生、发展及预后有关。笔者就c-myc基因的结构、功能及其在白血病中的表达与意义作一综述。
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1.c-myc基因的结构和功能
myc基因家族成员有3个：cell-myc(c-myc)、human-myc(N-myc)和myc-related-gene(L-myc)。它们具有类似的结构和功能。人类c-myc原癌基因定位于8q24区，由3个外显子和2个内含子组成。第1外显子无编码序列，是转录控制区，只起调节作用。外显子2和3是转译区，编码包含439个氨基酸残基的蛋白质，分子量为49 kD。外显子1,2,3共同编码分子量为65 kD的蛋白质，定位于核内，为核转录调节因子。该蛋白质位于N端143个氨基酸区域富含脯氨酸、谷氨酸残基，为转录激活区(transcription activation domain，TAD)；第320-328氨基酸处含有将胞质中合成的Myc蛋白质转运至核内的信息，为核定位区；位于C端355～439位氨基酸，包含有形成二聚体的特征性结构，为二聚体形成结构域:包括碱性结构域(B)，螺旋一回转一螺旋结构域(HLH)及亮氨酸拉链区(LZP)。C-myc蛋白通常和细胞内其他蛋白质结合，其中最主要的是具有BHLHLZ结构的蛋白MAX。C-myc和MAX形成MYC-MAX异二聚体，在核内通过和具有CACGTG核心序列的靶基因结合，反式激活靶基因的转录[1]，从而发挥c-myc作用。
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近年发现的具有类似结构的蛋白MAD1和MAD2(MXIL1)也能和MAX形成异二聚体[2]，竞争MAX与MYC的结合，对MYC-MAX异二聚体具有拮抗作用，从而调节MYC的功能[3]。
2.c-myc在造血细胞发育及白血病发生中的作用
c-myc原癌基因编码的转录产物C-myc蛋白与细胞周期密切相关，参与DNA聚合酶的活性，并调节细胞的增殖和分化[4]。在正常细胞的静止状态和终末分化后，C-myc表达受抑，mRNA水平降低；正常细胞增殖时，C-myc表达一过性激活，并在蛋白质合成开始前受到抑制。如正常人淋巴细胞和成纤维细胞在受到ConA、LPS、PHA及PDGF等丝裂原刺激后，c-myc的mRNA水平迅速升高20～40倍，并在1～3 h内达到高峰，然后下降，1～2天后降至原来基线水平[5]。c-myc只是在正常细胞的增殖早期发挥着一定生理作用，使细胞从G0期或G1期进入S期[6]。研究表明，鼠MEL，HL60，U937等细胞株的体外分化过程中伴随着C-myc表达下降[4～6]。类似的研究也说明C-myc的表达与造血细胞的分化成负相关。当HL60细胞受诱导分化剂作用向成熟粒细胞或单核细胞分化时，C-myc的表达减弱[7]。
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c-myc基因以重排，扩增与高表达方式，使C-myc蛋白异常升高。在白血病的发生中，其异常表达与其他调控机制及多种癌基因协同作用下，通过促进DNA合成与转录，缩短细胞倍增时间，同时抑制细胞分化，促进细胞增殖，最终导致白血病的发生。
C-myc表达和白血病发生有关，因为(1)C-myc表达与白血病预后有关；(2)白血病复发时C-myc表达增高；(3)CML急变时C-myc高表达。用反义技术也证明这一点。1988年Wickstrom[8]和Holt[9]分别合成15个碱基长度的c-myc mRNA的反义寡聚脱氧核苷酸ASODN在体外与HL60细胞共培养后，有效地抑制c-myc的表达，细胞生长受到抑制，同时抑制白血病细胞集落的形成。研究认为c-myc反义核酸对白血病细胞生长的抑制是通过抑制c-myc基因表达实现的，同时也表明c-myc基因在白血病发生中起重要的作用。
3.c-myc基因在白血病中的表达及其在检测残留白血病中的意义
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c-myc原癌基因在多种人类肿瘤细胞中均有扩增和高表达。1982年Collins等[10]首次报道了HL60细胞株和早幼粒细胞白血病病人的白血病细胞中c-myc基因高表达。Gopal等[11]研究进一步表明，急性淋巴细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病C-myc表达最强，慢粒(CML)、骨髓增殖异常综合症(MDS)和多发性骨髓瘤(MM)C-myc蛋白表达远低于急性白血病，但明显高于正常对照，淋巴瘤的C-myc表达最低，可能是由于瘤细胞很少累及骨髓所致。C-myc的异常表达与急性白血病的FAB分型无相关性，但c-myc mRNA和蛋白表达水平的检测对白血病的病程演进，疗效评价和预后估计均有一定意义[12]。Venturelli等[13]发现化疗有效的白血病患者在化疗开始24 h后c-myc mRNA水平就明显降低，若化疗无效或不缓解常可检测到c-myc mRNA和蛋白表达呈持续高水平。缓解后复发的患者在未出现其他临床征象之前就可查到骨髓中有C-myc的高水平表达。Harvey等[12]应用Northern Blot分析急非淋白血病患者化疗前后骨髓中c-myc mRNA水平变化的研究中发现白血病细胞c-myc mRNA高表达的患者很难在化疗药物的诱导下达到完全缓解，即使已诱导缓解，其缓解期也明显短暂，反之c-myc表达水平越低，患者的完全缓解率越高，无病生存期也越长。慢粒慢性期患者骨髓或外周血中c-myc高表达常预示病情将向急变期发展。Evinger-Hodges等[14]用myc探针在10例白血病短期缓解的病人中检测到7例有c-myc高表达，其中5例在半年内复发，而长期存活者(缓解期14～78个月)均无c-myc的高表达。这可能是由于C-myc高水平表达与白血病细胞自我更新能力提高和/或对化疗反应诱导分化不敏感有关所致。这些研究结果均表明，检测白血病c-myc基因的表达水平是反映白血病细胞恶性程度判断预后的重要指标之一。
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c-myc几乎在各型的白血病中均有表达，在单个白血病原始细胞中c-myc基因表达量显著高于分化水平与之一致的正常骨髓细胞，故c-myc探针也可作为检测残留白血病的特异性指标。
急性白血病化疗和骨髓移植中最主要的问题是不能明确完全缓解期和骨髓移植后白血病细胞被杀伤的程度以及残留白血病细胞的量。组化检测的限度为1%-5%。PCR技术已被用来检测残留白血病细胞。虽然PCR的检出率为10-4～10-5，但只能用来检测那些肿瘤特异性基因标记，如慢粒bcr/abl基因及M3 PML/RARα基因，应用范围窄。由于c-myc在各种类型白血病中的表达均增加，用RT-PCR法定量检测c-myc的表达以检测微小残留病变(MRD)，几乎可用于各种类型的白血病，对早期预测复发及判定预后、制定个体化疗方案有一定的临床意义。
4.C-myc与白血病细胞凋亡
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C-myc蛋白既可推进细胞周期，促进细胞增殖，抑制细胞分化，又可介导细胞凋亡PCD的发生。Freytag等[15]研究发现C-myc蛋白的增殖功能和凋亡功能有密切关系。C-myc蛋白参与转录调节，DNA结合异二聚体形成的功能区都是它发挥凋亡功能所必须的，因此C-myc对于凋亡和增殖调节的基本机制是一致的[15]。Evan[16]报道，用小鼠IL-3依赖性髓细胞(32D)进行培养，发现去除IL-3后，c-myc基因立即下调，结果细胞停止于G1期。将携带c-myc基因的载体转染32D细胞，获得稳定表达c-myc基因的32D细胞克隆。这种细胞去除IL-3后不停止于G1期，而是启动凋亡。这个实验说明一旦细胞增殖停滞，c-myc基因会启动凋亡。为什么c-myc基因既可促进细胞增殖，同时又可促进凋亡呢？目前认为由于C-myc蛋白中促进细胞凋亡与促进细胞增殖的功能区是同一个区，C-myc的表达只提供一个启动细胞增殖或凋亡的信号，需有第二个生长信号刺激后才能抑制细胞凋亡，促进细胞进入增殖状态，若没有第二个信号则自动进入凋亡。C-myc起介导凋亡的作用，可能主要影响凋亡的启动。C-myc先和MAX结合成异二聚体MYC-MAX，再经MYC-MAX和DNA结合通过控制诱导凋亡所需要的转录而对C-myc诱导的细胞凋亡进行调控[17]。近年来，许多学者报告C-myc能直接或间接地诱导或抑制多种基因的表达。其中，受C-myc抑制的基因包括Ⅱ类MHC、胶原、LFA-1α、细胞周期蛋白D1和c/EBPα以及C-myc自身等。C-myc也诱导多种基因表达如鸟氨酸脱羧酶(ODC)、α-prothymosin、ECA39、elF4E、elF2α、细胞周期蛋白A和E、hsp70以及乳酸脱氢酶(LDH)等。关于这些靶基因在C-myc诱导细胞凋亡中的作用已有广泛研究。例如，像C-myc基因一样，ODC基因高表达足以诱导凋亡。使用ODC活性抑制剂DFMO可抑制C-myc诱导细胞凋亡的活性。但是ODC诱导凋亡的作用没有C-myc大，DFMO也只是部分地抑制C-myc诱导凋亡的作用[18]。研究还发现，C-myc诱导的成纤维细胞凋亡需要P53,并且和P53的稳定性有关。然而，这种效应可能具有细胞特异性。此外，C-myc诱导的细胞凋亡可被抗氧化剂和Bcl-2抑制，而且Bcl-2也具有抗氧化特性。因而推测，ROS(活性氧)或某些活性氧产物增加可能导致凋亡发生。
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1992年Evan等[16]发现以不同方式在细胞周期的不同阶段急剧降低鼠细胞中的myc蛋白的水平会诱导细胞凋亡。在低血清培养条件下培养表达不同水平的myc蛋白的细胞亚克隆，发现myc蛋白的含量越高对低血清培养越敏感，出现细胞凋亡早，程度也严重。低血清培养中有丝分裂因子减少，可使细胞的C-myc表达降低。因此推论急剧降低C-myc水平可导致C-myc高表达的肿瘤细胞进入凋亡，而对C-myc表达量很低的正常细胞则不产生明显的影响。1995年Kimura等[19]发现应用反义核酸持续抑制C-myc的表达能诱导HL60细胞的凋亡，去除c-myc反义核酸后，c-myc表达上调，凋亡细胞数由原来的3.5%上升至32%。Thompson等[20]类似研究应用糖皮质激素处理淋巴瘤细胞使得瘤细胞的C-myc转录快速下调而引起凋亡。以上研究表明细胞的凋亡是由于C-myc蛋白的不当表达所引起，在c-myc基因表达发生急剧变化时可诱导细胞凋亡。
5.c-myc反义技术在白血病基因治疗中的应用
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c-myc基因做为靶基因，是反义技术用于抑制癌基因表达研究最早也是最多的癌基因。包括反义DNA，反义RNA，Ribozyme及三股螺旋DNA-Triplex等。
5.1 反义DNA 80年代末期Heikkila等[21]首先合成了人c-myc基因的反义核酸，作用于人T淋巴细胞，发现AS-ODN可抑制PHA刺激的T细胞C-myc蛋白表达，同时阻止细胞进入S期。其后Wickstrom和Holt等[8，9]分别用人工合成的与c-myc第二外显子起始转录序列互补的15 mer AS-ODN阻断人早幼粒细胞性白血病细胞株HL60中c-myc原癌基因的表达，结果发现它能抑制瘤细胞的增殖，并诱导终末分化，且其作用效应与其作用浓度存在一定的相关性。1995年Kimura[19]等类似研究报道亦证实了上述现象，并且发现c-myc AS-ODN持续抑制c-myc的表达能诱导HL60细胞凋亡，而一旦撤去这种抑制，却能诱导更多的HL60细胞进入凋亡。
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5.2 反义RNA 80年代末，Lachman[22]等将鼠的myc cDNA片段(1.36 kb，含c-myc编码序列及5'端，3'端非编码序列)以顺式和反式方向克隆入鼠MT-1基因启动子下游，构建了重组质粒PMT-myc，并转染入鼠红白血病细胞株MEL，结果发现由反式插入的重组质粒转染的MEL细胞c-myc mRNA表达被阻断，细胞向终末分化。日本学者Yokoyama等[23]将c-myc反义核酸的重组质粒用原生质体融合方法转入HL60细胞，观察到6个月内HL60可表达高水平反义c-myc，HL60细胞生长抑制，向单核细胞终末分化，c-myc基因转录抑制，且C-myc蛋白表达水平降低70%以上。
5.3 三股螺旋 当反义核酸碱基进入双链DNA后与其形成稳定的不可逆的三维螺旋结构，竞争抑制激活转录的蛋白与基因启动子结合，干扰基因的转录。Cooney等[24]在体外实验中通过三维螺旋体的方法抑制了c-myc的转录。
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5.4 核酶 核酶是具有催化活性的RNA分子，能序列特异地切割靶RNA。核酶通过两侧的引导序列与底物以碱基互补形成杂交链，具有更高的底物特异性。核酶切割完靶RNA后即从杂交链上解离下来，对新的靶RNA进行切割。核酶技术已成为近年来基因治疗的一种新方法，栾荣华等[25]根据c-myc癌基因第二外显子作为核酶的靶RNA区设计能特异性地切割大鼠c-myc癌基因mRNA的锤头状核酶，在理论上具有一定的生物活性。
Skorski等[26]体外单用或同时使用BCR/ABL和c-myc反义核酸处理CML原始细胞，结果表明同时使用BCR/ABL和c-myc反义核酸引起基因表达下调，抗CML细胞增殖作用明显强于各自单独使用，而对正常骨髓克隆的形成无影响。将BCR/ABL和/或c-myc反义核酸处理过的CML原始细胞注射入SCID小鼠，用流式细胞仪、RT-PCR等技术分析鼠组织细胞悬液的白血病细胞，发现两种反义核酸同时处理的小鼠病程延缓，生存期延长，效果比单用者明显。葛乐等通过c-myc和/或bcl-2基因的反义核酸对HL60和原代白血病细胞的影响研究也发现针对多癌基因反义核酸在逆转白血病细胞恶性表型，抑制癌细胞恶性生长方面表现出协同效应。因此，我们认为，针对多个有协同作用癌基因的多种反义核酸同时应用，在ABMT体外净化和白血病治疗中具有广阔的前景。
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作者简介:陈 琳(1970～)，女，主治医师，医学硕士.
参考文献:
[1]Amati B,Brooks,MW,Levy N,et al.Oncogenic activity of the c-myc protein requires dimerization with Max[J].Cell,1993,72(2): 233～245.
[2]Zervos AS,Gyuris J,Brent R，et al.Mxil,a protein that specifically interacts with Max to bind Myc-Max recognition sites[J].Cell,1993,72:223～232.
[3]Ayer DE,Kretzner L,Eisenman RN,et al.Mad: a heterodimeric partner for Max that antagonizes Myc transcriptional activity[J].Cell,1993,72:211～222.
, 百拇医药
[4]Spencer CA,Groudine M.Control of c-myc regulation in normal and neoplastic cells[J].Adv Cancer Res，1991,56:1～48.
[5]Blick M,Westin E,Gutterman J,et al.Oncogene expression in human leukemia[J].Blood,1984,64:1234～1239.
[6]Mc Clain KL.Expression of oncogenes in human leukemias[J].Cancer Res,1984,44:5382～5389.
[7]Bino GD,Li X,Traganos F,et al.Altered susceptibility of differentiating HL-60 cells to apoptosis induced by antitumor drugs[J].Leukemia,1994,8:281～288.
, 百拇医药
[8]Wickstrom EL,Bacon TA,Gonzalez A,et al.Human promyelocytic leukemia HL-60 cell proliferation and c-myc protein expression are inhibited by an antisense pentadecadeoxynucleotide targeted against c-myc mRNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:1028～1032.
[9]Holt JT,Redner RL,Nienhuis AW,et al.An oligomer complementary to c-myc mRNA inhibits proliferation of HL-60 promyelocytic cells and induces differentiation[J].Mol cell Biol,1988,8(3):963～973.
, 百拇医药
[10]Collins S.Amplification of endogenous myc-related DNA sequences in a human myeloid leukaemia cell line[J].Nature,1982,298:679～681.
[11]Gopal V,Hulette B,Li Yaqin,et al.C-myc and C-myb expression in acute myelogenous leukemia[J].Leuk Res,1992,16(10):1003～1011.
[12]Preisler HD，Raza A，Larson R,et al.Protooncogene expression and the clinical characteristics of acute nonlymphocytic leukemia: a leukemia intergroup pilot study[J].Blood,1989,73:255～262.
, http://www.100md.com
[13]Venturelli D,Lange B,Narni F,et al.Prognostic significance of "short-term" effects of chemotherapy on myc and histone H3 mRNA levels in acute leukemia patients[J].Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:3590～3594.
[14]Evinger-Hodges M J et al.Myc and sis expression in acute myelogenous leukemia[J].Leukemia,1988,2:45.
[15]Freytag SO.Definition of the activities and properties of c-myc required to inhibit cell differentiation[J].Cell Growth Differ,1990,1:339.
, 百拇医药
[16]Evan GI,Wyllie AH,Gilbert CS,et al.Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein[J].Cell,1992,69(1):119～128.
[17]Bissonnette RP,McGahon A,Mahboubi A,et al.Functional Myc-Max heterodimer is required for activation-induced apoptosis in T cell hybridomas[J].J Exp Med,1994,180(6):2413～2418.
[18]Packham G,Cleveland JL,et al.Ornithine decarboxylase is a mediator of C-myc-induced apoptosis[J].Mol Cell Biol,1994,14(9):5741～5747.
, 百拇医药
[19]Kimura S,Maekawa T,Hirakawak,et al.Alterations of c-myc expression by antisense oligodeoxynucleotides enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells[J].Cancer Res,1995,55:1379～1384.
[20]Thompson EB et al.Glucocoreticoid antagonist RU486 reverses agonist induced apoptosis and c-myc retression in human leukemic CEM-C7 cells[J].Ann NY Acad Sci,1995,12:761:261.
[21]Heikkila R,Schwab G,Wickstrom E,et al.A c-myc antisense oligodeoxynucleotide inhibits entry into S phase but not progress from G0 to G1[J].Nature,1987,328:445～449.
, 百拇医药
[22]Lachman HM,Cheng G,Skoultchi AI.Transfection of mouse erythroleukemia cells with myc sequences changes the rate of induced commitment to differentiate[J].PNAS USA,1986,83:6480～6484.
[23]Yokoyama K,Imamoto F.Transcriptional control of the endogenous myc proto oncogene by antisense RNA[J].PNAS USA,1987,84:7363～7367.
[24]Cooney M,Czernuszewicz G,Postel EH,et al.Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro[J].Science,1988,241:456～459.
, 百拇医药
[25]栾荣华,贾国良,连建奇,等.特异性切割大鼠c-myc癌基因mRNA核酶的设计[J].第四军医大学学报,1998,19(2):228～229.
[26]Skorski T,Nieborowska SM,Campbell K,et al.Leukemia treatment in severe combined immunodeficiency mice by antisense oligodeoxynucleotides targeting cooperation oncogenes[J].J Exp Med,1995,182(6):1645～1653.
收稿日期:1999-12-16, 百拇医药