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编号:10224150
家兔食管粘膜下肿瘤光动力学诊断的实验研究
http://www.100md.com 《中国激光医学杂志》 2000年第2期
     作者:伊力亚尔.夏合丁 会泽胜夫 加藤治文

    单位:伊力亚尔.夏合丁(新疆医科大学第一附属医院胸外科,乌鲁木齐市,830000);会泽胜夫(东京医科大学第二生理);加藤治文(东京医科大学第一外科)

    关键词:食管肿瘤;荧光;NPe6;光动力学诊断

    中华激光医学杂志000202摘要 目的 探讨利用光敏剂单天门冬酰胺二氢卟酚e6(NPe6)的长波长区吸光谱对较深部食管肿瘤作光动力学诊断的可能性,以及NPe6的理想剂量和照光时间。方法 雄性日本纯种白兔12只,在全麻下开腹,将VX2肿瘤细胞混悬液 (5×106细胞/ml)0.1 ml种植于食管粘膜下。1周后将家兔随机分成4组(每组3只),1组作为对照组,其余3组分别按1.0、2.5和5.0 mg/kg耳缘静脉注射NPe6,给药后2、4、6和8 h用半导体激光内镜荧光观测系统对食管粘膜下肿瘤及周围正常组织中的NPe6荧光进行观察,并计算肿瘤组织/正常组织相对荧光强度(T/N)比值。结果 各给药组家兔给药后不同时间在食管肿瘤部位发射出较强的NPe6荧光,与邻近正常食管呈鲜明对照。食管肿瘤与周围正常组织中NPe6荧光强度随给药后时间增加而减弱,但在给药后2~6 h,T/N比值随时间增加而增大。5.0 mg/kg组T/N比值在给药后4~8 h明显高于其他2组(P<0.05),于6 h时显示最大值(3.49±0.32)。而其他2组间差异无显著意义(P>0.05)。对照组家兔的肿瘤及正常组织均未检测出荧光。结论 利用NPe6长波长区吸光谱,对较深部食管肿瘤作光动力学诊断是可行的,给药剂量为5.0 mg/kg、给药后6 h进行诊断较为适宜。
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    中图分类号: R730.49;R735.1 文献标识码: A

    文章编号: 1003-9430(2000)02-0073-04

    Photodynamic Diagnostic Study on Submucosal Esophageal Tumor in Rabbits

    Ilyar SHEYHEDIN

    (Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China)

    AIZAWA Katsuo

    (Second Department of Physiology, Tokyo Medical University)
, 百拇医药
    KATO Harubumi

    (First Department of Surgery, Tokyo Medical University)

    ABSTRACT Objective To explore the proper dosage of mono-L-aspartyl chlorin e6 (NPe6) and proper irradiation time for photodynamic diagnosis of deep-seated esophageal tumor, and the possiblity with a long wavelength photodynamic excitation.

    Methods Japanese white male rabbits were used. After laparotomy under nembutal anesthesia, 0.1 ml of tumor cell suspension consisting of 5×106 VX2 cells was injected from the esophageal tunica adventitia into the submucosa of the lower thoracic esophagus in rabbits. A week later, the implanted tumors were 3-5 mm in lateral dimension and 3-4 mm in thickness. The twelve tumor-bearing rabbits were divided into four groups (3 in each group). The control group was not treated and the other three were injected i.v. with 1.0, 2.5 and 5.0 mg/kg NPe6, respectively. The fluorescence (675 nm) image was recorded every 2 h up to 8 h by a newly developed diode laser endoscopic fluorescence imaging system after excitation with a 664 nm laser beam (10 mW, 10 s). The fluorescence intensity of tumor and surrounding normal mucosa was analyzed with NIH Image 1.57 software.Results Using the diode laser endoscopic fluorescence imaging system it was able to selectively detect fluorescence from submucosal tumor by comparison with the surrounding normal mucosa after NPe6 injection. The fluorescence intensity correlated with NPe6 dosage. The fluorescence accumulated selectively in the tumor tissue and its relative intensity peaked at 6 h after injection. No fluorescence image was detected in controls.
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    Conclusions NPe6 given intravenously at a dosage of 5 mg/kg and excited with a 664 nm wavelength laser beam 6 h after i.v. injection may induce definitely deep-seated esophageal tumor in rabbits, using an endoscopic fluorescence imaging system.

    Key words Esophageal neoplasms; Fluorescence; NPe6; Photodynamic diagnosis

    以前国内外较常用的肿瘤光动力学诊断法, 主要是针对光敏剂400 nm附近的最强吸光谱进行激发[1-4]。但此光谱区激发光的组织穿透性差[5],对较深部肿瘤的定位诊断效果不理想。我们采用在600 nm以上光谱区具有较强吸光波峰(664 nm)的二氢卟酚类光敏剂单天门冬酰胺二氢卟酚e6 (mono-L-aspartyl chlorin e6, NPe6),利用半导体激光内镜荧光观测系统,对家兔食管粘膜下种植肿瘤进行荧光观测获得成功,为食管较深部肿瘤的光动力学诊断提供了一种新的途径。
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    材料和方法

    一、材料

    1.光敏剂 NPe6是一个在四吡咯环的C环上天门冬氨酸盐通过酰胺结合的二氢卟吩类化合物(图1)[6]。 相对分子质量为799.70。 在pH 7.4的磷酸缓冲液中,NPe6的吸光谱在398和654 nm处具有两个较强的波峰;对其吸光谱进行激发,可在658 nm处观测到其荧光光谱(图2)[7]。该光敏剂由日本明治制药会社提供。t7401.gif (3556 bytes)

    图1 NPe6的化学结构图[6]

    Fig.1 The chemical struture of NPe6[6] t7402.gif (4361 bytes)
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    图2 NPe6的吸光谱与荧光光谱图[7]

    Fig.2 The absorption and fluorescence spectra of NPe6[7]

    2.实验动物 体重2.5~3.0 kg的雄性纯种日本白兔12只。

    3.半导体激光内镜荧光观测系统 由东京医科大学和日本松下公司共同研制。由光源装置(日本产业机器株式会社提供)、内镜装置(Olympus BP-1T30)和荧光观察装置(日本产业机器株式会社提供)3部分组成(图3)。光源装置由半导体激光发射器(波长664 nm,输出功率150 mW)和白色照明灯(电压100 V,输出功率150 W)组成。工作原理:将激光和照明光合成,经纤维内镜光通道输入,从内镜前端将激光和照明光向病灶交替进行连续照射。从病灶发射的NPe6荧光(波长675 nm),通过置于内镜和CCD受光器(VW-BP100)间的滤光片(阻断波长664 nm,阻断范围15 nm以内,Kaiser Optical Systems公司制造),输入到录像机,并把图像显示在监视器屏幕上,对病灶进行观察和录存。t7403.gif (6025 bytes)
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    图3 半导体激光内镜荧光观测系统示意图

    Fig.3 A diagram of the diode laser endoscopic fluorescence imaging system

    二、实验方法

    1.动物模型制备 在无菌操作下摘取家兔大腿肌肉内传代保持的VX2肿瘤组织,除去坏死部分,将新鲜部分剪成小碎块,加入适量盐水研磨后,用80号白金滤网过滤,制成5×106细胞/ml的肿瘤细胞混悬液。在全麻下正中切开家兔腹腔,贲门部前壁剪开浆膜,游离下段食管约4 cm,然后用细针头经食管外膜将肿瘤细胞混悬液0.1 ml种植在食管粘膜下层,1周后作为食管粘膜下肿瘤动物模型用于实验。

    2.荧光观察和强度测定 12只模型家兔随机分成4组,每组3只。1组为不给药对照组;另3组为给药组,自耳缘静脉注射NPe6溶液,剂量分别为1.0、2.5和5.0 mg/kg。各给药组于给药后2、4、6和8 h在经耳缘静脉间断给戊巴比妥持续麻醉下,经口插入内镜,对食管病灶进行观察,并行激光照射(内镜前端输出功率10 mW,照射时间10 s)。照射的同时,通过荧光观察装置,对肿瘤及周围正常食管组织的发射荧光进行观察和录存。对录存的荧光图像用Macintosh计算机NIH Image/68 K软件作荧光强度检测,即在肿瘤和肿瘤两侧同一水平正常食管部各取直径2 mm圆圈,测出其单位面积内平均荧光强度值,并计算肿瘤组织/正常食管组织相对荧光强度(T/N)比值。最后家兔用过量麻药致死,开腹摘取食管,行组织病理学检查。
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    3.统计学处理 所得结果以xx1.gif (49 bytes)±s表示,采用One-way ANOVA检验方法分析检测数据。

    结 果

    一、荧光观察

    1.对照组 食管肿瘤及周围正常组织没有观察到荧光发射。

    2.给药组 在白色光源照射下,各给药组家兔肿瘤种植部位食管粘膜隆起,略显苍白色(图4A);用波长664 nm半导体激光照射时,食管肿瘤部位发射出较强荧光,与邻近正常食管呈鲜明对照(图4B)。

    二、肿瘤组织中NPe6相对荧光强度

, http://www.100md.com     给药后,各给药组家兔食管肿瘤组织与正常食管组织中NPe6的荧光强度随时间增加而减弱,但在给药后2~6 h,各组T/N比值均随时间增加而增大(表1)。不同给药剂量的3组之间比较,5.0 mg/kg组给药后4~8 h T/N比值高于1.0和2.5 mg/kg组(P<0.05),于6 h时显示最大值;而1.0 mg/kg组和2.5 mg/kg组之间的差异无显著意义(P>0.05)。t7501.gif (3817 bytes)t7502].gif (2932 bytes)

    图4 静脉注射NPe6(5.0 mg/kg)6 h后家兔食管粘膜下种植肿瘤的内镜图像:A.内镜白色照明光图像 B.用664 nm半导体激光光源照射时的荧光图像
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    Fig.4 Endoscopic photographs showed the white light image (A) and fluorescence image (B) of the esophagus of rabbits at 6 h after administration of 5.0 mg/kg NPe6 on excitation with a 664 nm laser beam.

    表1 给药后不同时间各组家兔食管肿瘤组织/正常组织NPe6相对荧光强度比值变化(xx1.gif (49 bytes)±s)

    Tab.1 The relative fluorescence intensity ratios of NPe6 in esophageal tumor at different intervals after drug injection at different doses (xx1.gif (49 bytes)±s) NPe6剂量
, 百拇医药
    NPe6 dosage

    (mg/kg)

    兔数

    Rabbit

    number

    2 h

    4 h

    6 h

    8 h

    1.0

    3

    1.28

    ±0.01
, 百拇医药
    1.58

    ±0.12

    1.92

    ±0.20

    1.78

    ±0.13

    2.5

    3

    1.62

    ±0.01

    1.72

    ±0.15

    1.98
, 百拇医药
    ±0.05

    1.79

    ±0.17

    5.0

    3

    1.72

    ±0.15

    2.51

    ±0.34*

    3.49

    ±0.32*

    3.15
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    ±0.48*

    * 与1.0和2.5 mg/kg组比较 Compared with the 1.0 and 2.5mg/kg, P<0.05讨 论

    肿瘤光动力学诊断法是利用光敏剂与肿瘤具有亲和性的特性,通过激发光的光动力学效应对肿瘤进行诊断的方法。通常光动力学诊断法主要用光敏剂400 nm附近的最强吸光谱波长进行激发[1-4]。由于此光谱区有体内血红蛋白及许多内源性荧光物质的吸光谱[8,9],因此激发光穿透组织浅[5],另有自体荧光的干扰,故对较深部肿瘤及微小病变定位不理想。有实验证明,随着波长增加,激发光在组织中的衰减降低,穿透深度增加[5]。这意味着利用长波长区光谱激发,可避开体内血红蛋白和内源性荧光物质的吸光谱,提高激发光的组织穿透性,使之能够激发积聚于较深部肿瘤的光敏剂,从而提高肿瘤光动力学诊断的效果。
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    本研究采用的NPe6具有肿瘤亲和性强、在体内代谢快、副作用小等特点[10]。我们针对NPe6的长波长区吸光谱,用组织穿透性强的波长664 nm半导体激光激发,对发射波长675 nm为中心的NPe6荧光进行观察,获得鲜明的家兔食管粘膜下肿瘤的荧光图像。表明利用长波长激光激发在长波长区具有较强吸光谱的光敏剂,对较深部肿瘤作光动力学诊断是可能的。

    光敏剂的用药剂量和用药后的T/N比值直接影响肿瘤的光动力学诊断效果。本研究表明,给药后不同时间各给药组家兔食管肿瘤组织中NPe6的荧光强度均高于周围正常食管组织,并且T/N比值在给药后2~6 h随时间增加而增大,尤以5.0 mg/kg组明显,在给药后6 h达3.49±0.32。较大的T/N比值有利于提高肿瘤光动力学诊断的分辨率和阳性率。因此,我们认为食管肿瘤的光动力学诊断以NPe6给药量为5.0 mg/kg、给药后6 h进行较为适宜。

    本研究获得的成功效果,为提高较深部肿瘤的光动力学诊断效果提供了一种新的途径和方法。
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    作者简介:伊力亚尔.夏合丁(1958-),男(维吾尔族),新疆乌鲁木齐人,新疆医科大学第一附属医院胸外科副主任医师,医学博士,主要从事胸外科临床工作和肿瘤光动力学诊断及治疗的研究。

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    (收稿日期:1999-08-20), 百拇医药