快速测定组织、血浆中谷氨酰胺及其临床意义
作者：董光龙 王为忠 尚刚伟 蒋永培
单位：董光龙 王为忠(第四军医大学西京医院胃肠外科，陕西西安 710032)；尚刚伟 蒋永培(第四军医大学西京医院解放军临床药理基地，陕西西安 710032)
关键词：反相高效液相色谱；柱前衍生；谷氨酰胺；组织；血浆
肠外与肠内营养000213摘 要：目的：为基础研究和临床应用研究建立快速、准确、经济的测定大鼠血浆及小肠、肝和肌肉组织内谷氨酰胺水平的方法。 方法：采用反相高效液相色谱柱前衍生荧光法(RP-HPLC)，衍生剂为邻苯二甲醛和3-巯基丙酸，流动相为磷酸缓冲液-乙腈(V/V，94∶6)，Lichrosorb C18柱，样品与衍生剂按4∶1进行衍生反应，激发波长=230 nm,荧光检测波长=389 nm，流速为2.0 ml/min。 结果：谷氨酰胺的保留时间为3.158 min，检测限为25 μmol/L(S/N=3.5)。线性范围50～3 200 μmol/L,r=0.999 6。日间精密度RSD值均不大于6.97%。 结论：应用RP-HPLC能准确、快速、灵敏地测定正常及辐射性肠粘膜损伤的大鼠血浆及组织的谷氨酰胺水平，为肠粘膜屏障损伤的防治研究提供了有效的实验室测定指标。
, http://www.100md.com
分类号：R446.6 文献标识码：B
文章编号：1007-810X(2000)02-0093-03
Rapid determination of glutamine in rat plasma and tissue and its clinical implication
DONG Guang-long WANG Wei-zhong
(Department of Gastroenterological Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Shanxi Xi'an 710032,China)
SHANG Gang-wei JIANG Yong-pei
, 百拇医药
(Clinical Pharmacology Laboratory of PLA in Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Shanxi Xi'an 710032,China)
Abstract：Objectives:To establish a rapid,sensitive and economical method for determination of glutamine in rat plasma and tissue using reversephase high performance liquid chromatography with fluorescence detection. Methods:The glutamine was pre-column derivatized with o-phthaladehyde and 3-mercaptopropionic acid under an alkaline condition and separated by HPLC on a Lichrosorb C18 column.The mobile phase was consisted of phosphate buffer-acetonitrile(V/V,94/6) with a flow rate of 2.0 ml/min.The volume ratio of sample and derivatization reagent solution was 4∶1(V/V).The excited and emitted wavelength were selected at 230 nm and 389 nm respectively. Results:The retention time of glutamine was 3.158 min and the detection limit of glutamine was 25 μmol/L(S/N=3.5),and the regression equation was A=16.940 5C+179.933 9,r=0.999 6 at the linear range of 50～3 200 μmol/L.The day -to-day deviation(RSD)<6.97%. Conclusions:This method is sufficiently sensitive,accurate and precise and can support pre-clinical or clinical studies and application.
, 百拇医药
Key words：Pre-volume derivatization; Reversed-phase high performance liquid chromatography; Glutamine; Tissue; Plasma▲
0 引言
谷氨酰胺是促进小肠粘膜等上皮细胞生长、分化和增殖的主要能源物质，特别在高代谢状态时，如缺血、辐射损伤、烧伤等，需求量显著增加[1，2]。经研究表明，小肠是利用谷氨酰胺的主要器官之一，骨骼肌是谷氨酰胺合成的主要场所，而肝则具有合成和利用谷氨酰胺的双重作用[3，4]。因而，快速、准确地测定血浆及主要代谢组织器官中的谷氨酰胺水平，对于谷氨酰胺代谢和肠粘膜损伤等防治的基础研究和临床应用都具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 大鼠放射性肠炎TPN模型的建立 雄性SD大鼠(本校实验动物研究中心提供)体重210～260 g，共35只，随机分为四组。A组为正常对照组(n=8)，仅接受颈部虚拟手术。其余三组均为实验组。实验组腹部接受单剂9.5 Gy60Co照射(abdominal radiation,AR)，上至胸骨剑突，下至耻骨联合，中心距钴源为170 cm,9.5 Gy剂量用8 min 58 s照完，钴源以16次/min速率自转，使大鼠腹部得到一均匀的辐射场。身体其余部位用5 cm铅块屏蔽。实验组根据处理分为B组：AR+chow(n=9)；C组：AR+TPN(n=9)；D组：AR+TPN+EGF(n=9)。TPN大鼠用氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，颈左侧切口，分离颈内静脉，插入1 mm硅胶管至上腔静脉内，远端沿皮下隧道到颈背部，连接旋转装置。大鼠分别置代谢笼内可自由活动。微量输液泵控制输液量，持续24 h均匀输入。输入速度为1.5 ml/(100 g.h)。A、B两组虚拟手术仅作左侧颈内静脉结扎。表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)(本校病理学教研室提供)用量为100 μg/kg,2次/d，皮下注射。
, 百拇医药
1.2 谷氨酰胺的检测 实验第七天，存活大鼠活杀取材。大鼠腹腔氯胺酮(100 mg/kg)麻醉后，腹部正中切口。无菌状态下取门静脉、腹主动脉血1 ml及肝、骨骼肌、小肠(刮取粘膜)0.5 g，参照Teerlink等[5]方法处理后，柱前衍生，于高效液相色谱仪测定谷氨酰胺水平，并计算小肠谷氨酰胺摄取率。
仪器及试剂：SHIMADZU LC-6A高效液相色谱系统，RF-503荧光检测仪，CTD-6A色谱柱箱，7125型进样器，C-R3A数据处理仪。衍生试剂的配制：取25 mg OPA溶于0.5 ml甲醇中，加0.5 mol/L(pH 10.4)硼酸缓冲液4.5 ml，混匀后加25 μl MPA,混匀后于4℃冰箱中备用。谷氨酰胺标准溶液配制的浓度为50、100、200、400、800、1 600、3 200 μmol/L。样品的衍生：取40 μl待测上清液，加入10 μl衍生剂，涡流2 min后取20 μl供色谱分析。用Lichrosorh C18柱，流动相为50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)-乙腈(V/V，94/6)，流速2.0 ml/min，激发波长=230 nm和荧光检测波长=389 nm，柱温(23±1)℃，外标法定量。
, 百拇医药
1.3 肠系膜淋巴结细菌移位及肠粘膜组织学检测 取回肠系膜淋巴结组织0.5 g,加1 ml无菌等渗盐水匀浆后放入TSB培养基内观察细菌移位情况。取距Treitz韧带2 cm的小肠，10%福马林溶液固定，用于光镜及图像分析(EMIAS医学真彩图像分析仪)，观察绒毛高度、绒毛面积改变。
1.4 统计与分析 数据用第四军医大学统计教研室SPLM软件进行统计分析处理，t检验，P<0.05为差异显著。
2 结果
2.1 肠粘膜形态和肠系膜淋巴结细菌生长情况 ①绒毛高度：与对照组比较，B组下降显著(P<0.05)，C组下降非常显著(P<0.01)，D组下降不显著。②绒毛面积：与对照组比较，B组明显下降(P<0.05)，C组下降非常显著(P<0.01)，而D组轻度下降，相关不显著。肠系膜淋巴结对照组无细菌生长，B组为25%，C组为83.3%，D组为12.5%。
, 百拇医药
2.2 线性关系 对标准溶液衍生化后进行测定，以谷氨酰胺峰面积A(μV.s)对浓度C(μmol/L)作回归，求得方程为A=16.940 5 C+179.933 5,r=0.999 6(n=6)。
2.2.1 精密度与检出限 分别取高中低浓度的谷氨酰胺标准液，按样品的预处理和衍生后进行测定，日间精密度为连续3天的测定值，结果见表1。当S/N值为3.5时，谷氨酰胺标准品的最低检出量为25 μmol/L。按上述方法衍生，测得最低检出浓度为50 μmol/L。
表1 谷氨酰胺测定精确度试验(n=6)
Table 1 Precision of Gultamine(n=6) 加入量(μmol/L)
测得量(μmol/L)
日间精密度(%)
, http://www.100md.com
50.00
49.06±2.44
6.97
200.00
200.55±8.44
5.28
800.00
817.00±8.73
2.43
3 200.00
3 152.80±79.34
3.64
, http://www.100md.com
2.2.2 特异性试验 由图1可见，肠粘膜内源性物质、谷氨酰胺、氨基酸均能很好地分离。谷氨酰胺的保留时间为3.158 min，在正常组大鼠的组织样品中加入少量标准谷氨酰胺后，5号峰为唯一显著增高的峰，故确认其为谷氨酰胺峰。
图1 标准谷氨酰胺和大鼠组织样品经衍生后的色谱图
Figure 1 Chromatograms of standard of glutamine level
in tissue after derivatization
a:standard glutamine;b:SD rats tissue homogenate;
C:SD rats tissue homogenate and standard glutamine;No.5:the peak of Number 5
, 百拇医药
2.2.3 样品与衍生剂定量反应试验 取0.5 ml谷氨酰胺标准品(3 200 μmol/L)与衍生剂按不同配比进行衍生反应后，进样20 μl，由谷氨酰胺色谱峰面积A结果(图2)可知，从A1起随着衍生剂的增加，衍生剂对生成的衍生物影响较小，对检测影响也较小，只受体积的变化而改变。当二者配比为8 μl∶1 μl时，A值最大，但样品取样量也较大。而4 μl∶1 μl时荧光强度已能满足检测要求，故以4∶1配比，20 μl进样分析较适当，配比反应如图2所示。谷氨酰胺浓度见表2。
图2 谷氨酰胺与衍生剂配比反应
Figure 2 Graph of fluorescence intensity of the
reaction of glutamine and derivatization reagent
, http://www.100md.com
表2 大鼠血浆和组织中谷氨酰胺水平(μmmol/L or g)
Table 2 Gultamine content in plasma(μmol/L) and tissues(μmol/g) 分组
n
动脉血浆
肠粘膜
肝
骨骼肌
A
8
572±59
2.85±0.31
, 百拇医药
7.16±0.39
7.44±0.41
B
7
466±31a
2.22±0.24a
7.15±0.28
6.13±0.32a
C
7
477±51a
, 百拇医药
1.96±0.35a
5.93±0.24a
5.98±0.18a
D
8
536±64
2.81±0.32
6.97±0.43
6.26±0.32a
a P<0.05, vs A组
3 讨论
, 百拇医药
本实验所建立的放射性肠炎长期TPN模型，其死亡率、组织形态学、生化指标均稳定及适合放射性肠炎治疗研究的需要。
肠道受辐射损伤致放射性肠炎，粘膜屏障破坏，细菌移位，死亡率较高[6]。传统的TPN虽可明显改善营养状况及使肠道得到充分休息，促进创伤愈合，但同时可使肠粘膜萎缩，细菌移位增加，血及组织中谷氨酰胺含量及小肠对谷氨酰胺的摄取下降,放射性肠炎的死亡率并没有显著下降[7]。谷氨酰胺是胃肠道粘膜等生长活跃的上皮细胞生长、增殖、分化不可缺少的能源物质，对促进胃肠粘膜损伤的修复起重要作用，而且在高代谢状态时，如创伤、放射性肠炎、烧伤等，对谷氨酰胺的需求显著增加[1，8]。Fox等[2]已注意到在放射性肠炎时，谷氨酰胺的利用与肠粘膜损伤的修复密切相关。供给外源性谷氨酰胺可保护肠粘膜或促进损伤的愈合[9]。EGF是一种无论在体内或体外都与多种细胞的生长、增殖、分化和组织修复等相关的重要因子，对消化道粘膜细胞的保护起重要作用，并参与调节小肠对谷氨酰胺的运输和利用[10，11]。因此，对血浆及组织中谷氨酰胺水平进行快速、准确和经济的检测，对于肠粘膜屏障损伤防治的基础研究和临床应用具有十分重要的意义。
, 百拇医药
目前，对谷氨酰胺的检测多采用酶法和全氨基酸色谱分析法[12]，尽管近年有关于利用液相色谱法测定血浆和肌肉中的谷氨酰胺[5]，但这些方法较复杂，有成本较高、程序复杂、费时等不足。本方法具有衍生步骤简单、灵敏度高、特异性强、时间和费用都节约等优点。以OPA-3-MPA代替OPA-巯基乙醇，生成稳定的衍生剂。谷氨酰胺溶液在常温下极不稳定，本法样品预处理快速，保留时间较短(仅3.158 min)，且样品均在低温下进行，从而确保检测的准确可靠和快捷。
本研究的数据显示，长期常规TPN与血谷氨酰胺水平及小肠对谷氨酰胺的摄取率显著下降相关联。EGF提高血浆及肝、骨骼肌组织中的谷氨酰胺浓度，提高小肠对谷氨酰胺的摄取率，从而对谷氨酰胺的合成和利用产生有益的影响，可加速肠粘膜屏障损伤的修复。■
作者简介：董光龙(1962-),男,浙江绍兴人,主治医师,讲师,博士研究生,从事胃肠外科专业
, 百拇医药
参考文献：
[1]Souba WW.Glutamine metabolism in catabolic state:Role of the intestinal tract[D].Boston,Mass:Department of Nutritional Biochemistry.Harvard School of Public Health,1984,Thesis.
[2]Fox AD,Kripks SA,Berman JR et al.Reduction of the severity of enterocolitis by glutamine-supplemtnted enteral diets[J].Surg Forum,1987,38:43.
[3]Arola L,Paliu A,Remesar X et al.Glutaine Synthetase activity in the organs of fed and 24 hours fasted rats[J].Hom Metab Res,1981,13:199.
, 百拇医药
[4]Kovacevic Z,Day SH,Collett V et al.Activation of hepatic glutaminase by spermine[J].Biochem J,1995,305:837.
[5]Teerlink T,Hennekes MWT,Leeuwen PAM et al.Rapid detrmination of glutamine in biological sample by high performance liquid chromatrography[J].Clin Chim Acta,1993,218:195.
[6]Guzmay G,Bonsack M,Liberty J et al.Abdominal radiation causes bacterial transloction[J].J Surg Res,1989,46:104.
, 百拇医药 [7]Silvain C,Besson I,Ingrand P et al.Long-term outcome of severe radiation enteritis treated by total parenteral nutrition[J].Dig Dis Sci,1992,37(7):1065.
[8]Souba WW,Smith TE,Wilmore DW.Glutamine metabolism by the intestinal tract[J].JPEN,1985,9:608.
[9]McArdle AH.Protection from radiation injury by elemental diet:does added glutamine chang the effect[J]?Gut,1994,1:s60～s64.
[10]Rabin M,Salloum RM,Stevens BR et al.Regulation of small intestinal glutamine transport by epidermal growth factor[J].Surgery,1993,113:552.
, 百拇医药
[11]Lamaroon A,Tait B,Diewert VM.Cell proliferation and expression of EGF,EGF-alpha,and EGF receptor in the developing primary palate[J].J Dent Res,1996,75(8):1534.
[12]Deyl Z,Hyanek J,Horakova M.Profiling of amino acids in body fluid and tissue by means of liquid chromatography[J].J Chromatogr,1986,20(379):177.
收稿日期：1999-07-22
修稿日期：2000-03-01, http://www.100md.com
单位：董光龙 王为忠(第四军医大学西京医院胃肠外科，陕西西安 710032)；尚刚伟 蒋永培(第四军医大学西京医院解放军临床药理基地，陕西西安 710032)
关键词：反相高效液相色谱；柱前衍生；谷氨酰胺；组织；血浆
肠外与肠内营养000213摘 要：目的：为基础研究和临床应用研究建立快速、准确、经济的测定大鼠血浆及小肠、肝和肌肉组织内谷氨酰胺水平的方法。 方法：采用反相高效液相色谱柱前衍生荧光法(RP-HPLC)，衍生剂为邻苯二甲醛和3-巯基丙酸，流动相为磷酸缓冲液-乙腈(V/V，94∶6)，Lichrosorb C18柱，样品与衍生剂按4∶1进行衍生反应，激发波长=230 nm,荧光检测波长=389 nm，流速为2.0 ml/min。 结果：谷氨酰胺的保留时间为3.158 min，检测限为25 μmol/L(S/N=3.5)。线性范围50～3 200 μmol/L,r=0.999 6。日间精密度RSD值均不大于6.97%。 结论：应用RP-HPLC能准确、快速、灵敏地测定正常及辐射性肠粘膜损伤的大鼠血浆及组织的谷氨酰胺水平，为肠粘膜屏障损伤的防治研究提供了有效的实验室测定指标。
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分类号：R446.6 文献标识码：B
文章编号：1007-810X(2000)02-0093-03
Rapid determination of glutamine in rat plasma and tissue and its clinical implication
DONG Guang-long WANG Wei-zhong
(Department of Gastroenterological Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Shanxi Xi'an 710032,China)
SHANG Gang-wei JIANG Yong-pei
, 百拇医药
(Clinical Pharmacology Laboratory of PLA in Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Shanxi Xi'an 710032,China)
Abstract：Objectives:To establish a rapid,sensitive and economical method for determination of glutamine in rat plasma and tissue using reversephase high performance liquid chromatography with fluorescence detection. Methods:The glutamine was pre-column derivatized with o-phthaladehyde and 3-mercaptopropionic acid under an alkaline condition and separated by HPLC on a Lichrosorb C18 column.The mobile phase was consisted of phosphate buffer-acetonitrile(V/V,94/6) with a flow rate of 2.0 ml/min.The volume ratio of sample and derivatization reagent solution was 4∶1(V/V).The excited and emitted wavelength were selected at 230 nm and 389 nm respectively. Results:The retention time of glutamine was 3.158 min and the detection limit of glutamine was 25 μmol/L(S/N=3.5),and the regression equation was A=16.940 5C+179.933 9,r=0.999 6 at the linear range of 50～3 200 μmol/L.The day -to-day deviation(RSD)<6.97%. Conclusions:This method is sufficiently sensitive,accurate and precise and can support pre-clinical or clinical studies and application.
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Key words：Pre-volume derivatization; Reversed-phase high performance liquid chromatography; Glutamine; Tissue; Plasma▲
0 引言
谷氨酰胺是促进小肠粘膜等上皮细胞生长、分化和增殖的主要能源物质，特别在高代谢状态时，如缺血、辐射损伤、烧伤等，需求量显著增加[1，2]。经研究表明，小肠是利用谷氨酰胺的主要器官之一，骨骼肌是谷氨酰胺合成的主要场所，而肝则具有合成和利用谷氨酰胺的双重作用[3，4]。因而，快速、准确地测定血浆及主要代谢组织器官中的谷氨酰胺水平，对于谷氨酰胺代谢和肠粘膜损伤等防治的基础研究和临床应用都具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 大鼠放射性肠炎TPN模型的建立 雄性SD大鼠(本校实验动物研究中心提供)体重210～260 g，共35只，随机分为四组。A组为正常对照组(n=8)，仅接受颈部虚拟手术。其余三组均为实验组。实验组腹部接受单剂9.5 Gy60Co照射(abdominal radiation,AR)，上至胸骨剑突，下至耻骨联合，中心距钴源为170 cm,9.5 Gy剂量用8 min 58 s照完，钴源以16次/min速率自转，使大鼠腹部得到一均匀的辐射场。身体其余部位用5 cm铅块屏蔽。实验组根据处理分为B组：AR+chow(n=9)；C组：AR+TPN(n=9)；D组：AR+TPN+EGF(n=9)。TPN大鼠用氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，颈左侧切口，分离颈内静脉，插入1 mm硅胶管至上腔静脉内，远端沿皮下隧道到颈背部，连接旋转装置。大鼠分别置代谢笼内可自由活动。微量输液泵控制输液量，持续24 h均匀输入。输入速度为1.5 ml/(100 g.h)。A、B两组虚拟手术仅作左侧颈内静脉结扎。表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)(本校病理学教研室提供)用量为100 μg/kg,2次/d，皮下注射。
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1.2 谷氨酰胺的检测 实验第七天，存活大鼠活杀取材。大鼠腹腔氯胺酮(100 mg/kg)麻醉后，腹部正中切口。无菌状态下取门静脉、腹主动脉血1 ml及肝、骨骼肌、小肠(刮取粘膜)0.5 g，参照Teerlink等[5]方法处理后，柱前衍生，于高效液相色谱仪测定谷氨酰胺水平，并计算小肠谷氨酰胺摄取率。
仪器及试剂：SHIMADZU LC-6A高效液相色谱系统，RF-503荧光检测仪，CTD-6A色谱柱箱，7125型进样器，C-R3A数据处理仪。衍生试剂的配制：取25 mg OPA溶于0.5 ml甲醇中，加0.5 mol/L(pH 10.4)硼酸缓冲液4.5 ml，混匀后加25 μl MPA,混匀后于4℃冰箱中备用。谷氨酰胺标准溶液配制的浓度为50、100、200、400、800、1 600、3 200 μmol/L。样品的衍生：取40 μl待测上清液，加入10 μl衍生剂，涡流2 min后取20 μl供色谱分析。用Lichrosorh C18柱，流动相为50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)-乙腈(V/V，94/6)，流速2.0 ml/min，激发波长=230 nm和荧光检测波长=389 nm，柱温(23±1)℃，外标法定量。
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1.3 肠系膜淋巴结细菌移位及肠粘膜组织学检测 取回肠系膜淋巴结组织0.5 g,加1 ml无菌等渗盐水匀浆后放入TSB培养基内观察细菌移位情况。取距Treitz韧带2 cm的小肠，10%福马林溶液固定，用于光镜及图像分析(EMIAS医学真彩图像分析仪)，观察绒毛高度、绒毛面积改变。
1.4 统计与分析 数据用第四军医大学统计教研室SPLM软件进行统计分析处理，t检验，P<0.05为差异显著。
2 结果
2.1 肠粘膜形态和肠系膜淋巴结细菌生长情况 ①绒毛高度：与对照组比较，B组下降显著(P<0.05)，C组下降非常显著(P<0.01)，D组下降不显著。②绒毛面积：与对照组比较，B组明显下降(P<0.05)，C组下降非常显著(P<0.01)，而D组轻度下降，相关不显著。肠系膜淋巴结对照组无细菌生长，B组为25%，C组为83.3%，D组为12.5%。
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2.2 线性关系 对标准溶液衍生化后进行测定，以谷氨酰胺峰面积A(μV.s)对浓度C(μmol/L)作回归，求得方程为A=16.940 5 C+179.933 5,r=0.999 6(n=6)。
2.2.1 精密度与检出限 分别取高中低浓度的谷氨酰胺标准液，按样品的预处理和衍生后进行测定，日间精密度为连续3天的测定值，结果见表1。当S/N值为3.5时，谷氨酰胺标准品的最低检出量为25 μmol/L。按上述方法衍生，测得最低检出浓度为50 μmol/L。
表1 谷氨酰胺测定精确度试验(n=6)
Table 1 Precision of Gultamine(n=6) 加入量(μmol/L)
测得量(μmol/L)
日间精密度(%)
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50.00
49.06±2.44
6.97
200.00
200.55±8.44
5.28
800.00
817.00±8.73
2.43
3 200.00
3 152.80±79.34
3.64
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2.2.2 特异性试验 由图1可见，肠粘膜内源性物质、谷氨酰胺、氨基酸均能很好地分离。谷氨酰胺的保留时间为3.158 min，在正常组大鼠的组织样品中加入少量标准谷氨酰胺后，5号峰为唯一显著增高的峰，故确认其为谷氨酰胺峰。
图1 标准谷氨酰胺和大鼠组织样品经衍生后的色谱图
Figure 1 Chromatograms of standard of glutamine level
in tissue after derivatization
a:standard glutamine;b:SD rats tissue homogenate;
C:SD rats tissue homogenate and standard glutamine;No.5:the peak of Number 5
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2.2.3 样品与衍生剂定量反应试验 取0.5 ml谷氨酰胺标准品(3 200 μmol/L)与衍生剂按不同配比进行衍生反应后，进样20 μl，由谷氨酰胺色谱峰面积A结果(图2)可知，从A1起随着衍生剂的增加，衍生剂对生成的衍生物影响较小，对检测影响也较小，只受体积的变化而改变。当二者配比为8 μl∶1 μl时，A值最大，但样品取样量也较大。而4 μl∶1 μl时荧光强度已能满足检测要求，故以4∶1配比，20 μl进样分析较适当，配比反应如图2所示。谷氨酰胺浓度见表2。
图2 谷氨酰胺与衍生剂配比反应
Figure 2 Graph of fluorescence intensity of the
reaction of glutamine and derivatization reagent
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表2 大鼠血浆和组织中谷氨酰胺水平(μmmol/L or g)
Table 2 Gultamine content in plasma(μmol/L) and tissues(μmol/g) 分组
n
动脉血浆
肠粘膜
肝
骨骼肌
A
8
572±59
2.85±0.31
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7.16±0.39
7.44±0.41
B
7
466±31a
2.22±0.24a
7.15±0.28
6.13±0.32a
C
7
477±51a
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1.96±0.35a
5.93±0.24a
5.98±0.18a
D
8
536±64
2.81±0.32
6.97±0.43
6.26±0.32a
a P<0.05, vs A组
3 讨论
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本实验所建立的放射性肠炎长期TPN模型，其死亡率、组织形态学、生化指标均稳定及适合放射性肠炎治疗研究的需要。
肠道受辐射损伤致放射性肠炎，粘膜屏障破坏，细菌移位，死亡率较高[6]。传统的TPN虽可明显改善营养状况及使肠道得到充分休息，促进创伤愈合，但同时可使肠粘膜萎缩，细菌移位增加，血及组织中谷氨酰胺含量及小肠对谷氨酰胺的摄取下降,放射性肠炎的死亡率并没有显著下降[7]。谷氨酰胺是胃肠道粘膜等生长活跃的上皮细胞生长、增殖、分化不可缺少的能源物质，对促进胃肠粘膜损伤的修复起重要作用，而且在高代谢状态时，如创伤、放射性肠炎、烧伤等，对谷氨酰胺的需求显著增加[1，8]。Fox等[2]已注意到在放射性肠炎时，谷氨酰胺的利用与肠粘膜损伤的修复密切相关。供给外源性谷氨酰胺可保护肠粘膜或促进损伤的愈合[9]。EGF是一种无论在体内或体外都与多种细胞的生长、增殖、分化和组织修复等相关的重要因子，对消化道粘膜细胞的保护起重要作用，并参与调节小肠对谷氨酰胺的运输和利用[10，11]。因此，对血浆及组织中谷氨酰胺水平进行快速、准确和经济的检测，对于肠粘膜屏障损伤防治的基础研究和临床应用具有十分重要的意义。
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目前，对谷氨酰胺的检测多采用酶法和全氨基酸色谱分析法[12]，尽管近年有关于利用液相色谱法测定血浆和肌肉中的谷氨酰胺[5]，但这些方法较复杂，有成本较高、程序复杂、费时等不足。本方法具有衍生步骤简单、灵敏度高、特异性强、时间和费用都节约等优点。以OPA-3-MPA代替OPA-巯基乙醇，生成稳定的衍生剂。谷氨酰胺溶液在常温下极不稳定，本法样品预处理快速，保留时间较短(仅3.158 min)，且样品均在低温下进行，从而确保检测的准确可靠和快捷。
本研究的数据显示，长期常规TPN与血谷氨酰胺水平及小肠对谷氨酰胺的摄取率显著下降相关联。EGF提高血浆及肝、骨骼肌组织中的谷氨酰胺浓度，提高小肠对谷氨酰胺的摄取率，从而对谷氨酰胺的合成和利用产生有益的影响，可加速肠粘膜屏障损伤的修复。■
作者简介：董光龙(1962-),男,浙江绍兴人,主治医师,讲师,博士研究生,从事胃肠外科专业
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收稿日期：1999-07-22
修稿日期：2000-03-01, http://www.100md.com