米非司酮药物流产后蜕膜血管内皮细胞生长因子Mrna及蛋白的表达
作者：黄丽丽 石一复
单位：(310006 杭州，浙江大学医学院附属妇产科医院)
关键词：
中华医学杂志000217
米非司酮配伍米索前列醇抗早孕已广泛用于临床，但药物流产后子宫出血时间长的副反应给妇女带来生活上的不便，并易导致感染、贫血的发生，影响了药物流产的安全性和可接受性。大量研究发现，血管内皮生长因子(VEGF)能促进新生血管形成，参与伤口修复、肿瘤转移、子宫内膜的周期性变化等生理和病理过程[1]。我们拟通过对药物流产后子宫蜕膜的VEGF mRNA及蛋白表达的观察，探讨VEGF在药物流产后子宫出血中的作用。
一、对象及方法
1.对象：选择1997年1月～3月本院门诊确诊为早孕、要求终止妊娠的妇女45例，均符合以下条件：(1)年龄21～39岁；(2)停经≤49 d；(3)平时月经规律，经量正常；(4)半年内未服用激素类药物及抗前列腺素药物；(5)无生殖系统炎症及肿瘤。45例受试者采用随机排列表的方法分成3组：(1)米非司酮米索组：口服米非司酮片(浙江省仙居制药厂生产)25 mg，每d 2次，共3 d，首次量加倍，总量150 mg。48 h后加服米索前列醇片(英国Seare药厂生产)0.6 mg。孕囊排出后，在常规消毒下刮取子宫蜕膜组织，液氮速冻后-80℃冰箱保存。(2)米非司酮组：米非司酮用法同上，48 h后行负压吸引术终止妊娠，同时收集蜕膜组织。标本保存同上。(3)正常蜕膜组：采用常规负压吸引术终止妊娠，同时收集蜕膜组织，保存同上。
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2.方法：(1)试剂：总RNA提取试剂盒(TRIzol为美国Gibco公司产品)，逆转录酶(AMV)、dNTPs、耐热性DNA聚合酶(Taq DNA酶)为美国Promega公司产品；DNA marker为上海华美公司产品；VEGF引物[2]：5'-TGGATCCATGAACTT-TCTGCTGTC-3'，5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3'及内参照(β-微球蛋白，β-MG)引物：5'-CACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'，5'-CATCTTCAAACCTCCATGACG-3'均为上海生物工程公司合成。人VEGF ELISA试剂盒为美国R&D Systems公司产品。(2)RT-PCR法：蜕膜组织总RNA抽提严格按试剂盒说明书进行，并行甲醛变性胶电泳，DU640紫外分光光度仪测A值，以确定RNA完整性及含量。每个样本均取5 μg总RNA进行逆转录，反应体系如下：2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl、0.1 mol/L DTT 2.0 μl、RNasin 20 U、50 pmol/L VEGF，上游引物及β-MG上游引物各1 μl、逆转录缓冲液4 ml、AMV 10 U，加灭菌水至终体积20 μl。37℃反应1 h，合成cDNA。取4 μl逆转录产物进行PCR，反应体系如下：2.5 mmol/L dNTPs 5 μl、10×缓冲液5 μl、25 mmol/L MgCl2 3 μl、25 pmol/L VEGF，上下游引物及β-MG上下游引物各2 μl、Taq酶1.0 U，加灭菌水至终体积50 μl。95℃预变性5 min，在PCR扩增仪(Perkin Elmer 480)上进行30个周期扩增。循环条件为94℃变性30 s、58℃退火1 min、72℃延伸1 min，最后72℃延伸2 min。取13 μl PCR 产物在0.02 kg/L琼脂糖凝胶上电泳。电泳结果经Gel Doc 1000型成像仪输入电脑，应用Molecular Analyst图象分析软件(Bio-Rad Laboratories产品)对条带进行吸光度峰值下面积积分(S)，VEGF与β-MG积分之比，即为VEGF mRNA相对水平。(3)ELISA法：称取蜕膜组织200 mg，加三乙醇胺缓冲盐溶液1 ml均浆，15 000 r/min 4℃下离心1 h。取上清，并在DU640型紫外分光光度仪上行蛋白定量。VEGF测定严格按试剂盒说明书操作。(4)统计学处理：采用秩和检验。
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二、结果
1.蜕膜VEGF mRNA表达：本研究中所用VEGF引物扩增的mRNA序列为4种VEGF共有，PCR后DNA片段长度：VEGF121为452 bp、VEGF165为584 bp、VEGF189为656 bp、VEGF206为707 bp[2]。正常早孕蜕膜、服米非司酮后蜕膜和米非司酮配伍米索药物流产后蜕膜均仅见452 bp的VEGF121 mRNA条带表达(图1)。3组间VEGF mRNA表达的相对水平：米非司酮-米索组为1.01±0.21，米非司酮组为0.88±0.20，正常蜕膜组为0.90±0.24。3组间差异无显著意义(H=0.663，P>0.05)。
M：DNA标准相对分子质量，PGEM-7ZF(+)/Hae Ⅲ；
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1，2：米非司酮配伍米索药物流产后蜕膜组织；3，4：服米非司酮后蜕膜组织；5，6：
正常早孕蜕膜组织
图1 蜕膜VEGF mRNA表达的电泳图
2.蜕膜VEGF蛋白表达水平：3组蜕膜VEGF蛋白相对含量分别为：米非司酮-米索组0.24±0.21，米非司酮组0.30±0.28，正常蜕膜组0.18±0.17。组间差异无显著意义(H=3.374，P>0.05)。
三、讨论
1.人早孕蜕膜VEGF mRNA的表达：本研究结果表明，正常早孕蜕膜、服米非司酮后蜕膜及米非司酮配伍米索前列醇药物流产后蜕膜中，均有VEGF mRNA表达，且均为VEGF121。目前已知，在人体中，VEGF基因可转录4种不同的VEGF mRNA，从而编码4种氨基酸个数、序列不同的VEGF： VEGF206、VEGF189、VEGF165及VEGF121。Salman等[1]研究发现，在大鼠子宫中，主要是VEGF165和VEGF121。猴的子宫内膜VEGF121 mRNA表达最高[3]。但对人早孕子宫蜕膜中VEGF mRNA表达情况的研究尚少见报道。本结果提示人早孕蜕膜中VEGF mRNA表达与灵长类月经周期内膜相似，主要表达VEGF121。
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2.药物流产与蜕膜VEGF：近年来许多研究发现，VEGF能促进血管内皮细胞的有丝分裂、细胞增殖；增加微血管内皮细胞的通透性，促进血管的生成[4]。人子宫内膜是一种有周期性脱落、需周期性再生修复的组织，对其VEGF的研究发现，VEGF mRNA及其蛋白含量增生期明显高于分泌期；但以月经期内膜腺上皮中为最高[5]，提示高含量的VEGF有利月经期内膜的修复。而给猴肌注米非司酮后子宫内膜VEGF免疫组织化学染色强度及mRNA表达水平明显降低[4]。我们以往的研究也发现，米非司酮配伍米索药物流产后蜕膜血管密度、血管总载面积低于正常蜕膜组[6]。所以我们设想，米非司酮配伍米索前列醇药物流产后子宫蜕膜中VEGF水平下降，子宫内膜血管再生障碍，内膜难以修复而致子宫出血时间长。但本研究结果并不支持以上的假设，无论是单用米非司酮组蜕膜还是米非司酮配伍米索药物流产组蜕膜，VEGF mRNA及蛋白表达水平的改变差异均无显著意义。对此我们认为：(1)体内血管生成受众多因素的调节[7]，除VEGF外，现已证明成纤维生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)-α、肿瘤坏死因子(TNF)-α等均能促进血管生成。米非司酮米索前列醇可能经其它途径影响早孕蜕膜血管。(2)本研究中蜕膜样本获取在用药后48 h，有可能此时药物尚未影响到VEGF mRNA及蛋白的表达。进一步的动态观察将有待于今后的研究。
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参考文献
[1]Salman MH, George MS, Constance C, et al. Uterine expression of vascular endothelial growth factor is increased by estradiol and tamoxifen. Cancer Res, 1996, 56:3954-3960.
[2]Wizigmann-Voos S, Breier G, Risau W, et al. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res, 1995, 55:1358-1364.
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[3]Greb RR, Heikinheimo O, Williams RF, et al. Vascular endothelial growth factor in primate endometrium is regulated by oestrogen-receptor and progesterone-receptor ligands in vivo. Hum Reprod, 1997, 12:1280-1292.
[4]Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis. Am J Pathol, 1995, 146:1029-1039.
[5]Charnock-Jones DS, Sharkey AM, Rajput-Williams J, et al. Identification and localization of alternately spliced mRNAs for vascular endothelial growth factor in human uterus and estrogen regulation in endometrial carcinoma cell lines. Biol Reprod. 1993, 48:1120-1128.
[6]黄丽丽，石一复，黄荷凤，等. RU486抗早孕蜕膜血管形态计量学研究. 现代妇产科进展， 1997， 6:11-12.
[7]Luo JC, Yamaguchi S, Shinkai A, et al. Significant Expression of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in mouse ascites tumors. Cancer Res, 1998, 58:2652-2660.
收稿日期：1999-03-26, 百拇医药
单位：(310006 杭州，浙江大学医学院附属妇产科医院)
关键词：
中华医学杂志000217
米非司酮配伍米索前列醇抗早孕已广泛用于临床，但药物流产后子宫出血时间长的副反应给妇女带来生活上的不便，并易导致感染、贫血的发生，影响了药物流产的安全性和可接受性。大量研究发现，血管内皮生长因子(VEGF)能促进新生血管形成，参与伤口修复、肿瘤转移、子宫内膜的周期性变化等生理和病理过程[1]。我们拟通过对药物流产后子宫蜕膜的VEGF mRNA及蛋白表达的观察，探讨VEGF在药物流产后子宫出血中的作用。
一、对象及方法
1.对象：选择1997年1月～3月本院门诊确诊为早孕、要求终止妊娠的妇女45例，均符合以下条件：(1)年龄21～39岁；(2)停经≤49 d；(3)平时月经规律，经量正常；(4)半年内未服用激素类药物及抗前列腺素药物；(5)无生殖系统炎症及肿瘤。45例受试者采用随机排列表的方法分成3组：(1)米非司酮米索组：口服米非司酮片(浙江省仙居制药厂生产)25 mg，每d 2次，共3 d，首次量加倍，总量150 mg。48 h后加服米索前列醇片(英国Seare药厂生产)0.6 mg。孕囊排出后，在常规消毒下刮取子宫蜕膜组织，液氮速冻后-80℃冰箱保存。(2)米非司酮组：米非司酮用法同上，48 h后行负压吸引术终止妊娠，同时收集蜕膜组织。标本保存同上。(3)正常蜕膜组：采用常规负压吸引术终止妊娠，同时收集蜕膜组织，保存同上。
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2.方法：(1)试剂：总RNA提取试剂盒(TRIzol为美国Gibco公司产品)，逆转录酶(AMV)、dNTPs、耐热性DNA聚合酶(Taq DNA酶)为美国Promega公司产品；DNA marker为上海华美公司产品；VEGF引物[2]：5'-TGGATCCATGAACTT-TCTGCTGTC-3'，5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3'及内参照(β-微球蛋白，β-MG)引物：5'-CACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'，5'-CATCTTCAAACCTCCATGACG-3'均为上海生物工程公司合成。人VEGF ELISA试剂盒为美国R&D Systems公司产品。(2)RT-PCR法：蜕膜组织总RNA抽提严格按试剂盒说明书进行，并行甲醛变性胶电泳，DU640紫外分光光度仪测A值，以确定RNA完整性及含量。每个样本均取5 μg总RNA进行逆转录，反应体系如下：2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl、0.1 mol/L DTT 2.0 μl、RNasin 20 U、50 pmol/L VEGF，上游引物及β-MG上游引物各1 μl、逆转录缓冲液4 ml、AMV 10 U，加灭菌水至终体积20 μl。37℃反应1 h，合成cDNA。取4 μl逆转录产物进行PCR，反应体系如下：2.5 mmol/L dNTPs 5 μl、10×缓冲液5 μl、25 mmol/L MgCl2 3 μl、25 pmol/L VEGF，上下游引物及β-MG上下游引物各2 μl、Taq酶1.0 U，加灭菌水至终体积50 μl。95℃预变性5 min，在PCR扩增仪(Perkin Elmer 480)上进行30个周期扩增。循环条件为94℃变性30 s、58℃退火1 min、72℃延伸1 min，最后72℃延伸2 min。取13 μl PCR 产物在0.02 kg/L琼脂糖凝胶上电泳。电泳结果经Gel Doc 1000型成像仪输入电脑，应用Molecular Analyst图象分析软件(Bio-Rad Laboratories产品)对条带进行吸光度峰值下面积积分(S)，VEGF与β-MG积分之比，即为VEGF mRNA相对水平。(3)ELISA法：称取蜕膜组织200 mg，加三乙醇胺缓冲盐溶液1 ml均浆，15 000 r/min 4℃下离心1 h。取上清，并在DU640型紫外分光光度仪上行蛋白定量。VEGF测定严格按试剂盒说明书操作。(4)统计学处理：采用秩和检验。
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二、结果
1.蜕膜VEGF mRNA表达：本研究中所用VEGF引物扩增的mRNA序列为4种VEGF共有，PCR后DNA片段长度：VEGF121为452 bp、VEGF165为584 bp、VEGF189为656 bp、VEGF206为707 bp[2]。正常早孕蜕膜、服米非司酮后蜕膜和米非司酮配伍米索药物流产后蜕膜均仅见452 bp的VEGF121 mRNA条带表达(图1)。3组间VEGF mRNA表达的相对水平：米非司酮-米索组为1.01±0.21，米非司酮组为0.88±0.20，正常蜕膜组为0.90±0.24。3组间差异无显著意义(H=0.663，P>0.05)。
M：DNA标准相对分子质量，PGEM-7ZF(+)/Hae Ⅲ；
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1，2：米非司酮配伍米索药物流产后蜕膜组织；3，4：服米非司酮后蜕膜组织；5，6：
正常早孕蜕膜组织
图1 蜕膜VEGF mRNA表达的电泳图
2.蜕膜VEGF蛋白表达水平：3组蜕膜VEGF蛋白相对含量分别为：米非司酮-米索组0.24±0.21，米非司酮组0.30±0.28，正常蜕膜组0.18±0.17。组间差异无显著意义(H=3.374，P>0.05)。
三、讨论
1.人早孕蜕膜VEGF mRNA的表达：本研究结果表明，正常早孕蜕膜、服米非司酮后蜕膜及米非司酮配伍米索前列醇药物流产后蜕膜中，均有VEGF mRNA表达，且均为VEGF121。目前已知，在人体中，VEGF基因可转录4种不同的VEGF mRNA，从而编码4种氨基酸个数、序列不同的VEGF： VEGF206、VEGF189、VEGF165及VEGF121。Salman等[1]研究发现，在大鼠子宫中，主要是VEGF165和VEGF121。猴的子宫内膜VEGF121 mRNA表达最高[3]。但对人早孕子宫蜕膜中VEGF mRNA表达情况的研究尚少见报道。本结果提示人早孕蜕膜中VEGF mRNA表达与灵长类月经周期内膜相似，主要表达VEGF121。
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2.药物流产与蜕膜VEGF：近年来许多研究发现，VEGF能促进血管内皮细胞的有丝分裂、细胞增殖；增加微血管内皮细胞的通透性，促进血管的生成[4]。人子宫内膜是一种有周期性脱落、需周期性再生修复的组织，对其VEGF的研究发现，VEGF mRNA及其蛋白含量增生期明显高于分泌期；但以月经期内膜腺上皮中为最高[5]，提示高含量的VEGF有利月经期内膜的修复。而给猴肌注米非司酮后子宫内膜VEGF免疫组织化学染色强度及mRNA表达水平明显降低[4]。我们以往的研究也发现，米非司酮配伍米索药物流产后蜕膜血管密度、血管总载面积低于正常蜕膜组[6]。所以我们设想，米非司酮配伍米索前列醇药物流产后子宫蜕膜中VEGF水平下降，子宫内膜血管再生障碍，内膜难以修复而致子宫出血时间长。但本研究结果并不支持以上的假设，无论是单用米非司酮组蜕膜还是米非司酮配伍米索药物流产组蜕膜，VEGF mRNA及蛋白表达水平的改变差异均无显著意义。对此我们认为：(1)体内血管生成受众多因素的调节[7]，除VEGF外，现已证明成纤维生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)-α、肿瘤坏死因子(TNF)-α等均能促进血管生成。米非司酮米索前列醇可能经其它途径影响早孕蜕膜血管。(2)本研究中蜕膜样本获取在用药后48 h，有可能此时药物尚未影响到VEGF mRNA及蛋白的表达。进一步的动态观察将有待于今后的研究。
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参考文献
[1]Salman MH, George MS, Constance C, et al. Uterine expression of vascular endothelial growth factor is increased by estradiol and tamoxifen. Cancer Res, 1996, 56:3954-3960.
[2]Wizigmann-Voos S, Breier G, Risau W, et al. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res, 1995, 55:1358-1364.
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[3]Greb RR, Heikinheimo O, Williams RF, et al. Vascular endothelial growth factor in primate endometrium is regulated by oestrogen-receptor and progesterone-receptor ligands in vivo. Hum Reprod, 1997, 12:1280-1292.
[4]Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis. Am J Pathol, 1995, 146:1029-1039.
[5]Charnock-Jones DS, Sharkey AM, Rajput-Williams J, et al. Identification and localization of alternately spliced mRNAs for vascular endothelial growth factor in human uterus and estrogen regulation in endometrial carcinoma cell lines. Biol Reprod. 1993, 48:1120-1128.
[6]黄丽丽，石一复，黄荷凤，等. RU486抗早孕蜕膜血管形态计量学研究. 现代妇产科进展， 1997， 6:11-12.
[7]Luo JC, Yamaguchi S, Shinkai A, et al. Significant Expression of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in mouse ascites tumors. Cancer Res, 1998, 58:2652-2660.
收稿日期：1999-03-26, 百拇医药