同型半胱氨酸促平滑肌细胞增殖的内信号传递途径
作者：田清平 刘乃奎 汤健 唐朝枢 朱国英 高炜
单位：(100083 北京医科大学心血管研究所)
关键词：
中华医学杂志000231 同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢过程中的重要中间产物。实验研究和临床观察表明，血中Hcy升高可引起动脉粥样硬化和血栓形成[1-3]。Tsai等[4]报道Hcy可刺激大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖，然而，Hcy诱导VSMC增殖的机制至今尚不清楚。我们在培养的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠VSMC上, 观察Hcy的促细胞增殖效应及其与蛋白激酶C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)、cAMP、Ca2+等的关系，探讨Hcy促VSMC增殖的细胞内信号转导途径。
一、材料与方法
, 百拇医药
1. VSMC培养：取WKY大鼠胸主动脉，按Ross方法[5]分离和传代培养VSMC，实验采用第4代培养细胞。
2. VSMC3H-TdR掺入：将1×105/ml细胞悬液接种于24孔板，贴壁后使细胞同步化于G0期，每孔分别处理后，加入37 kBq3H-TdR，培养24 h后终止反应，在Millipore上经微孔滤膜收集细胞，并用6%三氯醋酸处理，滤膜置于闪烁瓶中，在β液闪计数仪上测定3H-TdR的放射活性。
3.MAPK活性测定：将1×105/ml细胞接种于24孔板，按照李田昌等[6]的方法测定MAPK的活性。
4.Ca2+内流的测定：将1×106细胞/ml接种于24孔板，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，每孔加入37kBq45Ca，37℃孵育15 min后以无Ca2+2 mmol/L EDTA PBS(4℃)洗2次，终止45Ca的摄取，以Millipore抽滤，在β液闪计数仪上测定45Ca的放射活性。
, 百拇医药
5.cAMP的测定：将1×106/ml细胞接种于培养瓶，使细胞同步化于G0期，1 h后以冷PBS洗2次，50 mmol/L醋酸缓冲液洗1次，每管加入50 mmol/L醋酸缓冲液0.5 ml，超声破碎5s，反复冻融2次，3 000 r/min离心10 min，取上清用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，另取上清，用上海中医学院提供的125I标记的cAMP放免药盒cAMP含量。
6.统计学处理：统计结果以均数±标准差(
±s)表示，两组之间比较用组间t检验，多组间比较用方差分析组间q检验。
二、结果
1.Hcy对VSMC增殖的影响：如图1所示。Hcy可使VSMC3H-TdR掺入明显增加。
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图1 Hcy对VSMC增殖的影响
2.Hcy增加MAPK活性：具有剂量效应关系。且与Hcy诱导VSMC增殖明显相关，其相关系数为0.98，差异有非常显著性意义(图2)。
图2 Hcy对MAPK活性的影响
3.PD098059可以抑制Hcy所诱导的VSMC增殖[可以使3H-TdR的掺入下降52.1%(P<0.01)]。Nicardiping抑制了Hcy的促VSMC增殖作用，使3H-TdR掺入下降46.2%。PKC特异性阻断剂Polymycin B和H7均可阻断Hcy的促VSMC增殖作用，分别使3H-TdR掺入下降29.3%和58.8%(表1)。表1 MAPK，PKC及钙通道阻断剂对Hcy诱导的
, 百拇医药
VSMC增殖的影响(±s) 组别
标本数
3H-TdR(cpm/well)
对照组
6
7 869±1 091
Hcy(1.0 mmol/L)
6
17 343±942*
Hcy+PD098059
, 百拇医药
6
10 776±948△
Hcy+Nicardipine
6
9 324±1 256△
Hcy+H7
6
7 136±1 568△
Hcy+Polymycin B
6
12 260±2 746△
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与对照比较*P<0.01；与Hcy比较△P<0.01
研究还发现Hcy(1.0 mmol/L)可使VSMC cAMP含量下降44%，差异有非常显著意义。对照组为1.68 pmol/mg±0.76 pmol/mg；实验组为0.94 pmol/mg±0.34 pmol/mg，(P<0.01)。
三、讨论
Hcy诱导VSMC增殖的机制至今尚不清楚。MAPK被认为是细胞外信号引起细胞增殖反应的细胞内信号传递的共同通路或汇聚点[7]。本实验结果发现，Hcy促进VSMC增殖且具有剂量依赖性。并且Hcy增加MAPK活性的作用与其促进VSMC增殖的作用呈正相关(r=0.98)。在加入MAPK的阻断剂PD098059以后，明显抑制了Hcy所诱导的VSMC增殖，使3H-TdR掺入减少了52.1%，提示Hcy促进VSMC增殖的作用可能是通过增加MAPK活性实现的。
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培养基中加入PKC阻断剂Polymycin B和H7后，分别使VSMC3H-TdR的掺入减少了29.3%和58.8%，提示PKC被阻断后，抑制了Hcy的促VSMC增殖作用，说明Hcy的促VSMC增殖作用亦可能与激活PKC有关。
VSMC的肌浆网和线粒体不发达，细胞内钙浓度主要取决于钙内流，而细胞内钙对细胞增殖有重要意义。在本实验中，Hcy使钙内流增加,应用钙通道阻断剂可以抑制其促增殖作用，表明Hcy的促增殖作用可能与影响钙内流有关。
参考文献
[1]Velend PM, Refsum H. Plasma homocysteine, a risk factor for vascular disease: Plasma levels in health,disease and drug therapy. J Lab Med,1989,114:473-501.
, http://www.100md.com
[2]Malinow MR. Hyperhomocyst(e)inemia: A common and easily reversible risk factor for occlusive atherosclerosis. Circulation,1990,81:2004-2006.
[3]杨立华，田清平，唐朝枢，等.同型半胱氨酸致动脉粥样硬化的机制.北京医科大学学报，1998，30：115.
[4]Tsai JC, Perrella MA, Yoshizumi M. Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine: a link to atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci,1994,91:6369-6373.
[5]Ross R. The growth of smooth muscle cell in culture and formation of elastic fibers. J Cell Biol,1991,50:172-186.
[6]李田昌，胡大一，唐朝枢.丝裂素活化蛋白激酶活性的测定.基础医学与临床，1996，16：78-80.
[7]Pelech SL, Sanghera JS. MAP kinases: charting the regulatery pathways. Science,1993,257:1355-1356.
收稿日期：1999-02-10, http://www.100md.com
单位：(100083 北京医科大学心血管研究所)
关键词：
中华医学杂志000231 同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢过程中的重要中间产物。实验研究和临床观察表明，血中Hcy升高可引起动脉粥样硬化和血栓形成[1-3]。Tsai等[4]报道Hcy可刺激大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖，然而，Hcy诱导VSMC增殖的机制至今尚不清楚。我们在培养的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠VSMC上, 观察Hcy的促细胞增殖效应及其与蛋白激酶C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)、cAMP、Ca2+等的关系，探讨Hcy促VSMC增殖的细胞内信号转导途径。
一、材料与方法
, 百拇医药
1. VSMC培养：取WKY大鼠胸主动脉，按Ross方法[5]分离和传代培养VSMC，实验采用第4代培养细胞。
2. VSMC3H-TdR掺入：将1×105/ml细胞悬液接种于24孔板，贴壁后使细胞同步化于G0期，每孔分别处理后，加入37 kBq3H-TdR，培养24 h后终止反应，在Millipore上经微孔滤膜收集细胞，并用6%三氯醋酸处理，滤膜置于闪烁瓶中，在β液闪计数仪上测定3H-TdR的放射活性。
3.MAPK活性测定：将1×105/ml细胞接种于24孔板，按照李田昌等[6]的方法测定MAPK的活性。
4.Ca2+内流的测定：将1×106细胞/ml接种于24孔板，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，每孔加入37kBq45Ca，37℃孵育15 min后以无Ca2+2 mmol/L EDTA PBS(4℃)洗2次，终止45Ca的摄取，以Millipore抽滤，在β液闪计数仪上测定45Ca的放射活性。
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5.cAMP的测定：将1×106/ml细胞接种于培养瓶，使细胞同步化于G0期，1 h后以冷PBS洗2次，50 mmol/L醋酸缓冲液洗1次，每管加入50 mmol/L醋酸缓冲液0.5 ml，超声破碎5s，反复冻融2次，3 000 r/min离心10 min，取上清用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，另取上清，用上海中医学院提供的125I标记的cAMP放免药盒cAMP含量。
6.统计学处理：统计结果以均数±标准差(
±s)表示，两组之间比较用组间t检验，多组间比较用方差分析组间q检验。二、结果
1.Hcy对VSMC增殖的影响：如图1所示。Hcy可使VSMC3H-TdR掺入明显增加。
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图1 Hcy对VSMC增殖的影响
2.Hcy增加MAPK活性：具有剂量效应关系。且与Hcy诱导VSMC增殖明显相关，其相关系数为0.98，差异有非常显著性意义(图2)。
图2 Hcy对MAPK活性的影响
3.PD098059可以抑制Hcy所诱导的VSMC增殖[可以使3H-TdR的掺入下降52.1%(P<0.01)]。Nicardiping抑制了Hcy的促VSMC增殖作用，使3H-TdR掺入下降46.2%。PKC特异性阻断剂Polymycin B和H7均可阻断Hcy的促VSMC增殖作用，分别使3H-TdR掺入下降29.3%和58.8%(表1)。表1 MAPK，PKC及钙通道阻断剂对Hcy诱导的
, 百拇医药
VSMC增殖的影响(
±s) 组别标本数
3H-TdR(cpm/well)
对照组
6
7 869±1 091
Hcy(1.0 mmol/L)
6
17 343±942*
Hcy+PD098059
, 百拇医药
6
10 776±948△
Hcy+Nicardipine
6
9 324±1 256△
Hcy+H7
6
7 136±1 568△
Hcy+Polymycin B
6
12 260±2 746△
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与对照比较*P<0.01；与Hcy比较△P<0.01
研究还发现Hcy(1.0 mmol/L)可使VSMC cAMP含量下降44%，差异有非常显著意义。对照组为1.68 pmol/mg±0.76 pmol/mg；实验组为0.94 pmol/mg±0.34 pmol/mg，(P<0.01)。
三、讨论
Hcy诱导VSMC增殖的机制至今尚不清楚。MAPK被认为是细胞外信号引起细胞增殖反应的细胞内信号传递的共同通路或汇聚点[7]。本实验结果发现，Hcy促进VSMC增殖且具有剂量依赖性。并且Hcy增加MAPK活性的作用与其促进VSMC增殖的作用呈正相关(r=0.98)。在加入MAPK的阻断剂PD098059以后，明显抑制了Hcy所诱导的VSMC增殖，使3H-TdR掺入减少了52.1%，提示Hcy促进VSMC增殖的作用可能是通过增加MAPK活性实现的。
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培养基中加入PKC阻断剂Polymycin B和H7后，分别使VSMC3H-TdR的掺入减少了29.3%和58.8%，提示PKC被阻断后，抑制了Hcy的促VSMC增殖作用，说明Hcy的促VSMC增殖作用亦可能与激活PKC有关。
VSMC的肌浆网和线粒体不发达，细胞内钙浓度主要取决于钙内流，而细胞内钙对细胞增殖有重要意义。在本实验中，Hcy使钙内流增加,应用钙通道阻断剂可以抑制其促增殖作用，表明Hcy的促增殖作用可能与影响钙内流有关。
参考文献
[1]Velend PM, Refsum H. Plasma homocysteine, a risk factor for vascular disease: Plasma levels in health,disease and drug therapy. J Lab Med,1989,114:473-501.
, http://www.100md.com
[2]Malinow MR. Hyperhomocyst(e)inemia: A common and easily reversible risk factor for occlusive atherosclerosis. Circulation,1990,81:2004-2006.
[3]杨立华，田清平，唐朝枢，等.同型半胱氨酸致动脉粥样硬化的机制.北京医科大学学报，1998，30：115.
[4]Tsai JC, Perrella MA, Yoshizumi M. Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine: a link to atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci,1994,91:6369-6373.
[5]Ross R. The growth of smooth muscle cell in culture and formation of elastic fibers. J Cell Biol,1991,50:172-186.
[6]李田昌，胡大一，唐朝枢.丝裂素活化蛋白激酶活性的测定.基础医学与临床，1996，16：78-80.
[7]Pelech SL, Sanghera JS. MAP kinases: charting the regulatery pathways. Science,1993,257:1355-1356.
收稿日期：1999-02-10, http://www.100md.com