转移生长因子β调节人成骨细胞血小板衍生生长因子受体的表达
作者：陈建庭 杨德鸿 景宗森 武大林 金大地
单位：陈建庭 杨德鸿 景宗森 金大地(510515 广州，第一军医大学南方医院骨科)；武大林(第一军医大学南方医院外科实验室)
关键词：
中华医学杂志000227 血小板衍生生长因子(PDGF)和转移生长因子β(TGF-β) 是骨组织中广泛存在的骨代谢调节因子，二者共同参与调节成骨细胞的增殖和分化。有研究表明，TGF-β可通过改变成骨肉瘤MG63细胞株的PDGF受体(PDGFR)的表达来调节PDGF对该细胞的促增殖作用[1]。但是TGF-β对正常成骨细胞的PDGFR的影响目前尚不清楚。本实验通过培养人胚成骨细胞，旨在探讨TGF-β对人成骨细胞PDGFR的调节作用及其机制。
一、材料与方法
, 百拇医药 1.成骨细胞的分离培养： 细胞的分离、培养和鉴定方法见文献[2]。
2.3H-TdR掺入细胞实验：将细胞以5×103/孔接种入96孔培养板， 6 h见细胞完全贴壁，移去完全培养基，用含1%胎牛血清(FBS)的培养液培养24 h，然后以每组3孔分成5组继续实验：(1)对照组：含1%FBS的培养液继续培养48 h；(2)PDGF-AA组：1%FBS培养24 h后,换入40 ng/ml PDGF-AA(美国Oncogene公司，1%FBS的培养液配制，其余因子同法配成)培养细胞24 h。(3)先TGF-β后PDGF-AA联合组：4 ng/ml TGF-β(美国Oncogene公司)培养24 h后移出培养液，PBS洗涤贴壁细胞，再换用PDGF-AA培养24 h。(4)PDGF-BB组：1%FBS培养24 h后,换用40 ng/ml PDGF-BB(美国Oncogene公司)培养细胞24 h。(5)先TGF-β后PDGF-BB组： 4 ng/ml TGF-β培养24 h后移出培养液，PBS洗涤贴壁细胞，再换用PDGF-BB培养24 h。培养终止前4 h加入3H-TdR(北京原子能研究院同位素所)，浓度为7.4kBq/ml.上述各组细胞均经PBS洗涤,10%三氯醋酸固定，0.3 mol/L NaOH裂解，闪烁计数仪计数。方差分析(ANOVA)和SNK方法统计数据(SPSS 7.5)。
, 百拇医药
3.PDGFR表达的免疫荧光检测：(1)PDGFR-α：3个实验组。第1、2组1%FBS培养液培养48 h，第3组1%FBS培养液培养24 h后，4 ng/ml TGF-β培养24 h。各组培养终止时TE酶消化获得细胞悬液，1%多聚甲醛固定。第1组不加一抗为阴性对照，第2、3组加100 ng/ml的PDGFR-α单克隆抗体(丹麦DAKO公司)各组4℃保存12 h，然后加入FITC标记的二抗(美国Sigma公司)37℃孵育1 h，操作完毕后用PBS洗涤细胞，流式细胞仪(Elite,Coulter,Corp.美国)计数5 000个细胞，统计细胞携带荧光量,荧光量间接反映细胞膜上受体量。(2)PDGFR-β：所用一抗为PDGFR-β单克隆抗体(DAKO公司,丹麦。20 ng/ml),操作步骤同上。
4.RNA斑点杂交：将106细胞接种到培养瓶中，6 h后见细胞完全贴壁,换用1%FBS全培培养，24 h后加入TGF-β 4 ng/ml,对照组不加因子。再过6 h后TE酶消化取得细胞悬液，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA。将提取的样品甲醛变性后，点在硝酸纤维素膜(浙江黄岩四青生化材料厂)上，室温凉干，80℃干烤2 h。PDGFR-α/β的寡核苷酸探针由Gibco公司合成。探针用[r-32P]ATP(北京亚辉生物工程公司，比活度>185 000 000 kBq/mmol，370 kBq/μl水溶液)标记。样品膜用标记好的探针杂交。放射自显影。薄层扫描仪扫描杂交斑点的辉度。
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二、结果
1.3H-TdR掺入细胞实验：闪烁计数仪本底46 cmp±3 cpm，对照组285±12 cpm。其余见表1。统计分析表明，各处理组细胞摄取3H-TdR量明显高于未加因子组(P<0.01)。表明PDGF-AA、PDGF-BB以及它们同TGF-β的组合均能有效促进成骨细胞增殖。成骨细胞经TGF-β预先培养24 h再换入PDGF-AA培养，细胞摄取3H-TdR量明显低于PDGF-AA单独培养组(P<0.05),即TGF-β预处理细胞可减弱PDGF-AA对该成骨细胞促增殖作用。而以TGF-β预培养细胞后换入PDGF-BB培养， 细胞摄取3H-TdR的量与PDGF-BB单独使用无差别(P>0.05)，即TGF-β预处理不能改变PDGF-BB对成骨细胞的促增殖作用。上述可进一步体现：TGF-β对不同构型的PDGF有不同的调节作用。
表1 各组细胞摄取3H-TdR量的比较(cpm,
±s) 分组
, 百拇医药
标本数
处理因素
3H-TdR掺入量
1组
3
未加因子
285±12
2组
3
PAGF-AA
435±15△
3组
, 百拇医药 3
先TGF-β后PDGF-AA
366±15△*
4组
3
PDGF-BB
499±53△
5组
3
先TGF-β后PDGF-BB
512±16△
注：与第1组比△P<0.01，与第2组比P<0.01
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2.PDGFR-α和PDGFR-β表达的免疫荧光测定：(1)TGF-β作用24 h后，细胞的荧光分布曲线左移，表示细胞携带的荧光减少，TGF-β引起细胞表面PDGFR-α数量下降。同时仪器显示TGF-β使荧光标记细胞的百分率下降20%。(2)TGF-β作用相同时间后， 细胞荧光分布曲线继续右移， 表示细胞携带荧光量升高，细胞膜上PDGFR-β增多。仪器显示TGF-β使荧光标记细胞的百分率上升11%。
3.斑点杂交：TGF-β组PDGFR-α探针杂交斑点辉度(59 971.92)较对照组(87 478.60)降低；TGF-β组PDGFR-β探针杂交斑点辉度(99 403.74)较对照(80 551.92)增强。表明在基因转录水平上，TGF-β抑制PDGFR-α mRNA的表达，促进PDGFR-β mRNA表达。
三、讨论
局部细胞因子是组织代谢的直接调节因素，TGF-β和PDGF在骨组织中含量较多，研究它们的作用及其相互关系对于解释骨质疏松等骨代谢疾病的发病机制，研究促进骨折愈合的措施有重要意义。
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本研究结果直接反映TGF-β预处理成骨细胞可以降低该细胞对PDGF-AA的反应性，表现PDGF-AA促增殖能力的降低。但TGF-β预培养对PDGF-BB的促增殖作用无明显影响。TGF-β预处理使不同构型的PDGF具有不同的表现，PDGF-AA的作用受到制约，PDGF-BB的作用无明显改变。
免疫荧光检测表明，TGF-β引起成骨细胞膜上PDGFR-α的数量下降，PDGFR-β的数量升高。核酸分子杂交检测发现，TGF-β使PDGFR-α mRNA表达减弱， PDGFR-β mRNA表达增强。本结果表明蛋白水平和分子水平的变化一致， 尽管从mRNA到蛋白之间存在复杂的转换过程，目前认为mRNA水平是蛋白水平的决定性因素，因此可认为TGF-β通过调控PDGFR基因的转录来调节成骨细胞PDGFR的表达。已知，PDGFR-α是PDGF-AA唯一的高亲和力受体，而PDGF-BB可以同时和PDGFR-α、PDGFR-β结合。细胞膜上PDGFR-α量的减少使PDGF-AA与细胞的结合位点减少，细胞摄取利用PDGF-AA减少，从而TGF-β抑制了PDGF-AA的促增殖效应。PDGF-BB可以同时与PDGFR-α和PDGFR-β紧密结合，PDGFR-α量的下降和PDGFR-β量的同时升高可能不引起PDGF-BB效果的变化。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500175)
参考文献
[1]Hung LM, Tsai CH, Chen JK, et al. TGF-beta selectively suppresses PDGF receptor signaling pathways in MG-63 human osteosarcoma cell. Life Sci, 1997,61:685-693.
[2]杨德鸿，陈建庭，金大地.骨组织工程研究(Ⅰ)：人成骨细胞培养及成骨特性观察. 第一军医大学学报,1999,19:287.
收稿日期：1999-02-14, http://www.100md.com
单位：陈建庭 杨德鸿 景宗森 金大地(510515 广州，第一军医大学南方医院骨科)；武大林(第一军医大学南方医院外科实验室)
关键词：
中华医学杂志000227 血小板衍生生长因子(PDGF)和转移生长因子β(TGF-β) 是骨组织中广泛存在的骨代谢调节因子，二者共同参与调节成骨细胞的增殖和分化。有研究表明，TGF-β可通过改变成骨肉瘤MG63细胞株的PDGF受体(PDGFR)的表达来调节PDGF对该细胞的促增殖作用[1]。但是TGF-β对正常成骨细胞的PDGFR的影响目前尚不清楚。本实验通过培养人胚成骨细胞，旨在探讨TGF-β对人成骨细胞PDGFR的调节作用及其机制。
一、材料与方法
, 百拇医药 1.成骨细胞的分离培养： 细胞的分离、培养和鉴定方法见文献[2]。
2.3H-TdR掺入细胞实验：将细胞以5×103/孔接种入96孔培养板， 6 h见细胞完全贴壁，移去完全培养基，用含1%胎牛血清(FBS)的培养液培养24 h，然后以每组3孔分成5组继续实验：(1)对照组：含1%FBS的培养液继续培养48 h；(2)PDGF-AA组：1%FBS培养24 h后,换入40 ng/ml PDGF-AA(美国Oncogene公司，1%FBS的培养液配制，其余因子同法配成)培养细胞24 h。(3)先TGF-β后PDGF-AA联合组：4 ng/ml TGF-β(美国Oncogene公司)培养24 h后移出培养液，PBS洗涤贴壁细胞，再换用PDGF-AA培养24 h。(4)PDGF-BB组：1%FBS培养24 h后,换用40 ng/ml PDGF-BB(美国Oncogene公司)培养细胞24 h。(5)先TGF-β后PDGF-BB组： 4 ng/ml TGF-β培养24 h后移出培养液，PBS洗涤贴壁细胞，再换用PDGF-BB培养24 h。培养终止前4 h加入3H-TdR(北京原子能研究院同位素所)，浓度为7.4kBq/ml.上述各组细胞均经PBS洗涤,10%三氯醋酸固定，0.3 mol/L NaOH裂解，闪烁计数仪计数。方差分析(ANOVA)和SNK方法统计数据(SPSS 7.5)。
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3.PDGFR表达的免疫荧光检测：(1)PDGFR-α：3个实验组。第1、2组1%FBS培养液培养48 h，第3组1%FBS培养液培养24 h后，4 ng/ml TGF-β培养24 h。各组培养终止时TE酶消化获得细胞悬液，1%多聚甲醛固定。第1组不加一抗为阴性对照，第2、3组加100 ng/ml的PDGFR-α单克隆抗体(丹麦DAKO公司)各组4℃保存12 h，然后加入FITC标记的二抗(美国Sigma公司)37℃孵育1 h，操作完毕后用PBS洗涤细胞，流式细胞仪(Elite,Coulter,Corp.美国)计数5 000个细胞，统计细胞携带荧光量,荧光量间接反映细胞膜上受体量。(2)PDGFR-β：所用一抗为PDGFR-β单克隆抗体(DAKO公司,丹麦。20 ng/ml),操作步骤同上。
4.RNA斑点杂交：将106细胞接种到培养瓶中，6 h后见细胞完全贴壁,换用1%FBS全培培养，24 h后加入TGF-β 4 ng/ml,对照组不加因子。再过6 h后TE酶消化取得细胞悬液，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA。将提取的样品甲醛变性后，点在硝酸纤维素膜(浙江黄岩四青生化材料厂)上，室温凉干，80℃干烤2 h。PDGFR-α/β的寡核苷酸探针由Gibco公司合成。探针用[r-32P]ATP(北京亚辉生物工程公司，比活度>185 000 000 kBq/mmol，370 kBq/μl水溶液)标记。样品膜用标记好的探针杂交。放射自显影。薄层扫描仪扫描杂交斑点的辉度。
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二、结果
1.3H-TdR掺入细胞实验：闪烁计数仪本底46 cmp±3 cpm，对照组285±12 cpm。其余见表1。统计分析表明，各处理组细胞摄取3H-TdR量明显高于未加因子组(P<0.01)。表明PDGF-AA、PDGF-BB以及它们同TGF-β的组合均能有效促进成骨细胞增殖。成骨细胞经TGF-β预先培养24 h再换入PDGF-AA培养，细胞摄取3H-TdR量明显低于PDGF-AA单独培养组(P<0.05),即TGF-β预处理细胞可减弱PDGF-AA对该成骨细胞促增殖作用。而以TGF-β预培养细胞后换入PDGF-BB培养， 细胞摄取3H-TdR的量与PDGF-BB单独使用无差别(P>0.05)，即TGF-β预处理不能改变PDGF-BB对成骨细胞的促增殖作用。上述可进一步体现：TGF-β对不同构型的PDGF有不同的调节作用。
表1 各组细胞摄取3H-TdR量的比较(cpm,
±s) 分组, 百拇医药
标本数
处理因素
3H-TdR掺入量
1组
3
未加因子
285±12
2组
3
PAGF-AA
435±15△
3组
, 百拇医药 3
先TGF-β后PDGF-AA
366±15△*
4组
3
PDGF-BB
499±53△
5组
3
先TGF-β后PDGF-BB
512±16△
注：与第1组比△P<0.01，与第2组比P<0.01
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2.PDGFR-α和PDGFR-β表达的免疫荧光测定：(1)TGF-β作用24 h后，细胞的荧光分布曲线左移，表示细胞携带的荧光减少，TGF-β引起细胞表面PDGFR-α数量下降。同时仪器显示TGF-β使荧光标记细胞的百分率下降20%。(2)TGF-β作用相同时间后， 细胞荧光分布曲线继续右移， 表示细胞携带荧光量升高，细胞膜上PDGFR-β增多。仪器显示TGF-β使荧光标记细胞的百分率上升11%。
3.斑点杂交：TGF-β组PDGFR-α探针杂交斑点辉度(59 971.92)较对照组(87 478.60)降低；TGF-β组PDGFR-β探针杂交斑点辉度(99 403.74)较对照(80 551.92)增强。表明在基因转录水平上，TGF-β抑制PDGFR-α mRNA的表达，促进PDGFR-β mRNA表达。
三、讨论
局部细胞因子是组织代谢的直接调节因素，TGF-β和PDGF在骨组织中含量较多，研究它们的作用及其相互关系对于解释骨质疏松等骨代谢疾病的发病机制，研究促进骨折愈合的措施有重要意义。
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本研究结果直接反映TGF-β预处理成骨细胞可以降低该细胞对PDGF-AA的反应性，表现PDGF-AA促增殖能力的降低。但TGF-β预培养对PDGF-BB的促增殖作用无明显影响。TGF-β预处理使不同构型的PDGF具有不同的表现，PDGF-AA的作用受到制约，PDGF-BB的作用无明显改变。
免疫荧光检测表明，TGF-β引起成骨细胞膜上PDGFR-α的数量下降，PDGFR-β的数量升高。核酸分子杂交检测发现，TGF-β使PDGFR-α mRNA表达减弱， PDGFR-β mRNA表达增强。本结果表明蛋白水平和分子水平的变化一致， 尽管从mRNA到蛋白之间存在复杂的转换过程，目前认为mRNA水平是蛋白水平的决定性因素，因此可认为TGF-β通过调控PDGFR基因的转录来调节成骨细胞PDGFR的表达。已知，PDGFR-α是PDGF-AA唯一的高亲和力受体，而PDGF-BB可以同时和PDGFR-α、PDGFR-β结合。细胞膜上PDGFR-α量的减少使PDGF-AA与细胞的结合位点减少，细胞摄取利用PDGF-AA减少，从而TGF-β抑制了PDGF-AA的促增殖效应。PDGF-BB可以同时与PDGFR-α和PDGFR-β紧密结合，PDGFR-α量的下降和PDGFR-β量的同时升高可能不引起PDGF-BB效果的变化。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500175)
参考文献
[1]Hung LM, Tsai CH, Chen JK, et al. TGF-beta selectively suppresses PDGF receptor signaling pathways in MG-63 human osteosarcoma cell. Life Sci, 1997,61:685-693.
[2]杨德鸿，陈建庭，金大地.骨组织工程研究(Ⅰ)：人成骨细胞培养及成骨特性观察. 第一军医大学学报,1999,19:287.
收稿日期：1999-02-14, http://www.100md.com