结直肠癌IGF-I mRNA表达与浸润转移的关系
作者：李晴 孔宪国 郝杰民 叶世会
单位：李晴(上海铁道大学医学院附属铁路医院外科，上海 200072)；孔宪国(上海铁道大学医学院附属铁路医院外科，上海 200072)；郝杰民(上海铁道大学医学院附属铁路医院外科，上海 200072)；叶世会(上海铁道大学医学院附属铁路医院外科，上海 200072)
关键词：结直肠癌；IGF-I；RT-PCR
癌症000216
【摘 要】目的：探讨IGF-I mRNA在结直肠癌组织中的表达。方法：采用RT-PCR方法检测28例结直肠癌组织及癌周正常组织IGF-I mRNA的表达。结果：28例结直肠癌中，IGFImRNA表达阳性者20例，癌周组织仅3例阳性，癌组织中的表达率明显高于癌周组织(P<0.01);C、D期癌表达率明显高于A、B期癌(P<0.01)。结论：IGF-I在结直肠癌组织中存在广泛的表达，IGF-I mRNA的表达与结直肠癌的转移有关。
, 百拇医药
中图分类号：R735.34 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)02-0153-03
Expression of IGF-I mRNA in colorectal carcinomas and its relationship with the presence of metastasis
LI Qing KONG Xian-guo HAO Jie-min et al
(Department of General Surgery, Railway Hospital, Shanghai Tiedao University，Shanghai 200072,P.R.China)
【Abstract】 Objective：To investigate the expression of IGF-I mRNA in colorectal carcinoma tissues. Method： RT-PCR was used to determine the IGF-I mRNA expression in 28 cases of colorectal carcinomas tissues and the normal tissues around the cancer. Results： The results showed that IGF-I mRNA was positively expressed in 20 of 28 cases of cancer, whereas it was positively expressed only in 3 cases of normal tissues. The expression rate in cancers was significantly higher than that in normal tissues (P<0.01). And the expression rate in stage C and D cancers was significantly higher than that in stage A and B cancers (P< 0.01). Conclusion： IGF-I is widely expressed in colorectal carcinoma tissues, and the expression of IGF-I mRNA is associated with the presence of metastasi of colorectal carcinomas.
, 百拇医药
Key words：Colorectal carcinoma; IGF-I; RT-PCR
为探讨胰岛素样生长因子(insulin-like growth factorI，IGF-I)在国人结直肠癌组织中的表达状况,我们采用RT-PCR技术检测28例结直肠癌及其癌周IGF-I mRNA的表达，并探讨IGF-I mRNA表达与结直肠癌浸润转移的关系。结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 病例资料和组织标本
结直肠癌标本28例取自手术切除标本。手术后，立即取癌组织及癌周正常组织(切端正常组织，病理证实无肿瘤浸润)各一块，经液氮速冻后，放入80℃冰箱中保存。其中男17例，女11例，年龄36～78岁，中位年龄62岁，所有病例均经病理证实。按临床Dukes分期：A期3例，B期10例，C期11例，D期4例。
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1.2 主要试剂
Qiagen RNA抽提试剂盒为德国Qiagen公司产品，Taq酶、oligodT、AMV逆转录酶、dNTP等购自美国promega公司。
1.3 引物序列及合成
根据IGF-I cDNA序列设计IGF-I引物，由加拿大sangon公司上海分公司合成，扩增片段长度为296bp，引物序列如下：
正义：5’CTAGGCACTCTGCTTGC 3’
反义：5’CTTGGGCATGTCAGTGTGGC 3’
同时设计β-Actin内参照引物一对，由中科院上海植物生理研究所合成，扩增片段长度为776bp，引物序列如下：
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正义：5’CTATTGGCAACGAGCGGTTC 3’
反义：5’CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT 3’
1.4 组织总RNA抽提
按试剂盒说明进行。
1.5 RNA含量及质量鉴定
抽提出的RNA经凝胶电泳鉴定RNA质量，紫外分光光度计测定RNA含量。
1.6 逆转录合成cDNA
20μl逆转录反应体系包含总RNA2μg，AMV逆转录酶20u，4种dNTP(10mmol/L)2μl，oligodT1μl，Rnasin20u，Buffer4μl，双蒸水加至20μl。混匀后，42℃反应45分钟，95℃加热5分钟以灭活逆转录酶，放入80℃冰箱中备用。
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1.7 PCR扩增及电泳、结果判定
25μlPCR反应体系包含cDNA2μl，dNTP(2mmol/L)2.5μl，正、反向引物各25pmol，Taq酶2u，PCRbuffer2.5μl，双蒸去离子水加至25μl。混匀后，置PCR仪上，IGFI的反应条件为：94℃变性50秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分钟，30个循环后，再72℃延伸7分钟。β-Actin的反应条件为：94℃变性50秒，55℃退火1分15秒，72℃延伸1分15秒，30个循环后再72℃延伸7分钟。其中不加cDNA模板者作为阴性对照。取PCR扩增产物8μl在2%琼脂糖凝胶电泳80v30分钟，溴化乙锭染色，紫外灯下观察记录照相。
1.8 统计学处理
采用χ2检验或四格表确切概率法。
2 结果
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2.1 RNA质量及含量鉴定
提取出的RNA经琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s、28s三条RNA电泳带，RNA经紫外分光光度计测定吸光度260与280比值大于1.8。
2.2 结直肠癌及癌周IGF-ImRNA的表达
IGF-ImRNA经RTPCR扩增后，其产物电泳图见图1，被扩增的片断长度为296bp，产物经测序与欲扩增片断DNA序列一致。内标基因β-Actin同时电泳作为内部对照，所有组织标本均有表达。阴性对照均为阴性。
图1 IGF-I mRNA RT-PCR产物电泳图
注：M：PCR Marker;1、3、5、7：
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癌组织阳性表达;2、4、6、8：癌周组织阴性表达
2.3 IGF-ImRNA在结直肠癌及癌周组织表达的差异
28例结直肠癌组织中，20例有表达。而癌周组织中，仅3例有表达。两组表达率有显著性差异(P<0.01)(见表1)。
表1 结直肠癌及癌周IGF-I mRNA表达的差异 组别
n
阳性
阴性
P值
结直肠癌
28
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20
8
<0.01
癌周
28
3
25
合计
56
23
33
χ2=18.88
2.4 IGF-I mRNA在A、B期癌及C、D期癌表达的差异
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A、B期癌13例，IGFImRNA有表达者5例;C、D期癌15例，全部有IGFImRNA的表达，两组表达率有显著性差异(P<0.01)(见表2)。
表2 A、B期癌与C、D期癌IGF-m RNA表达差异 组别
n
阳性
阴性
P值
A、B期
13
5
8
<0.01
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C、D期
15
15
0
合计
28
20
8
3 讨论
胰岛素样生长因子(IGF)是目前已知的几个生长因子中十分重要的一个，因其与胰岛素具有结构同源性而得名[1]。有两种IGF多肽被证实：IGF-I及IGF-Ⅱ。IGF与肿瘤关系密切，IGF-I对各种肿瘤细胞具有促有丝分裂作用，如对人乳腺癌细胞株[2]、人黑色素瘤细胞[3]等。国外有研究表明，IGF mRNA的表达水平与结肠癌的浸润深度有关[4]。
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我们采用RTPCR方法检测IGF-I mRNA在结直肠癌组织及癌周组织中的表达，结果表明，癌组织的表达阳性率明显高于癌周组织，提示IGF-I基因在结直肠癌组织中，存在激活的现象，C、D期结直肠癌的表达率明显高于A、B期，提示IGF-I mRNA的表达与结直肠癌的转移关系，IGF-I mRNA的表达能够促进结直肠癌的转移。IGF-I促进肿瘤转移的机制尚不明确，但在乳腺癌的研究中发现，IGF-I能够促进乳腺癌细胞的运动，进而促进肿瘤的转移[5]，其确切机制仍有待于进一步研究阐明。
鉴于IGF在肿瘤发生发展中的重要意义，有学者采用阻断IGF的方法对肿瘤进行治疗，方法主要有两种：第一，阻断IGF的合成或分泌，第二，阻断IGF与其受体的结合，应用这些方法，已取得了初步的治疗效果[2,6]。本实验结果显示，IGF-I在结直肠癌的发生发展中具有重要意义。因此，应用阻断IGF-I的方法对结直肠癌治疗可能也会有效，这有待于进一步研究证明。
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通讯作者：李晴：Tel：86-21-56770588-3361
[参考文献]
[1] Macaulay VM. Insulin-like growth factors and cancer [J]. Br J Cancer, 1992, 65：311～320.
[2] Rohlik QT, Adams D, Kull FC Jr, et al. An antibody to the receptor for insulin like growth factor I inhibits the growth of MCF-7 cells in tissue culture [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1987, 149：276～281.
[3] Rodeck U, Herlyn M, Menssen HD, et al. Metastatic but not primary melanoma cell lines grow in vitro independently of exogenous growth factors [J]. Int J Cancer,1987,40：687～690.
, 百拇医药
[4] Tricoli JV, Rall LB, Karakousis CP, et al. Enhanced levels of insulin-like growth factor messenger RNA in human colon carcinomas and liposarcomas [J]. Cancer Res, 1986, 46：6169～6173.
[5] Doerr ME, Jones JI. The roles of integrins and extracellular matrix proteins in the insulin-like growth factor I-stimulated chemotaxis of human breast cancer cells [J]. J Biol Chem, 1996, 271：2443～2447.
[6] Huynh HT, Tetenes E, Wallace L, et al. In vivo inhibition of insulin-like growth factor I gene expression by tamoxifen [J]. Cancer Res,1993, 53：1727～1730.
收稿日期：1999-03-05;修回日期：1999-04-23, http://www.100md.com
单位：李晴(上海铁道大学医学院附属铁路医院外科，上海 200072)；孔宪国(上海铁道大学医学院附属铁路医院外科，上海 200072)；郝杰民(上海铁道大学医学院附属铁路医院外科，上海 200072)；叶世会(上海铁道大学医学院附属铁路医院外科，上海 200072)
关键词：结直肠癌；IGF-I；RT-PCR
癌症000216
【摘 要】目的：探讨IGF-I mRNA在结直肠癌组织中的表达。方法：采用RT-PCR方法检测28例结直肠癌组织及癌周正常组织IGF-I mRNA的表达。结果：28例结直肠癌中，IGFImRNA表达阳性者20例，癌周组织仅3例阳性，癌组织中的表达率明显高于癌周组织(P<0.01);C、D期癌表达率明显高于A、B期癌(P<0.01)。结论：IGF-I在结直肠癌组织中存在广泛的表达，IGF-I mRNA的表达与结直肠癌的转移有关。
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中图分类号：R735.34 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)02-0153-03
Expression of IGF-I mRNA in colorectal carcinomas and its relationship with the presence of metastasis
LI Qing KONG Xian-guo HAO Jie-min et al
(Department of General Surgery, Railway Hospital, Shanghai Tiedao University，Shanghai 200072,P.R.China)
【Abstract】 Objective：To investigate the expression of IGF-I mRNA in colorectal carcinoma tissues. Method： RT-PCR was used to determine the IGF-I mRNA expression in 28 cases of colorectal carcinomas tissues and the normal tissues around the cancer. Results： The results showed that IGF-I mRNA was positively expressed in 20 of 28 cases of cancer, whereas it was positively expressed only in 3 cases of normal tissues. The expression rate in cancers was significantly higher than that in normal tissues (P<0.01). And the expression rate in stage C and D cancers was significantly higher than that in stage A and B cancers (P< 0.01). Conclusion： IGF-I is widely expressed in colorectal carcinoma tissues, and the expression of IGF-I mRNA is associated with the presence of metastasi of colorectal carcinomas.
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Key words：Colorectal carcinoma; IGF-I; RT-PCR
为探讨胰岛素样生长因子(insulin-like growth factorI，IGF-I)在国人结直肠癌组织中的表达状况,我们采用RT-PCR技术检测28例结直肠癌及其癌周IGF-I mRNA的表达，并探讨IGF-I mRNA表达与结直肠癌浸润转移的关系。结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 病例资料和组织标本
结直肠癌标本28例取自手术切除标本。手术后，立即取癌组织及癌周正常组织(切端正常组织，病理证实无肿瘤浸润)各一块，经液氮速冻后，放入80℃冰箱中保存。其中男17例，女11例，年龄36～78岁，中位年龄62岁，所有病例均经病理证实。按临床Dukes分期：A期3例，B期10例，C期11例，D期4例。
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1.2 主要试剂
Qiagen RNA抽提试剂盒为德国Qiagen公司产品，Taq酶、oligodT、AMV逆转录酶、dNTP等购自美国promega公司。
1.3 引物序列及合成
根据IGF-I cDNA序列设计IGF-I引物，由加拿大sangon公司上海分公司合成，扩增片段长度为296bp，引物序列如下：
正义：5’CTAGGCACTCTGCTTGC 3’
反义：5’CTTGGGCATGTCAGTGTGGC 3’
同时设计β-Actin内参照引物一对，由中科院上海植物生理研究所合成，扩增片段长度为776bp，引物序列如下：
, http://www.100md.com
正义：5’CTATTGGCAACGAGCGGTTC 3’
反义：5’CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT 3’
1.4 组织总RNA抽提
按试剂盒说明进行。
1.5 RNA含量及质量鉴定
抽提出的RNA经凝胶电泳鉴定RNA质量，紫外分光光度计测定RNA含量。
1.6 逆转录合成cDNA
20μl逆转录反应体系包含总RNA2μg，AMV逆转录酶20u，4种dNTP(10mmol/L)2μl，oligodT1μl，Rnasin20u，Buffer4μl，双蒸水加至20μl。混匀后，42℃反应45分钟，95℃加热5分钟以灭活逆转录酶，放入80℃冰箱中备用。
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1.7 PCR扩增及电泳、结果判定
25μlPCR反应体系包含cDNA2μl，dNTP(2mmol/L)2.5μl，正、反向引物各25pmol，Taq酶2u，PCRbuffer2.5μl，双蒸去离子水加至25μl。混匀后，置PCR仪上，IGFI的反应条件为：94℃变性50秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分钟，30个循环后，再72℃延伸7分钟。β-Actin的反应条件为：94℃变性50秒，55℃退火1分15秒，72℃延伸1分15秒，30个循环后再72℃延伸7分钟。其中不加cDNA模板者作为阴性对照。取PCR扩增产物8μl在2%琼脂糖凝胶电泳80v30分钟，溴化乙锭染色，紫外灯下观察记录照相。
1.8 统计学处理
采用χ2检验或四格表确切概率法。
2 结果
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2.1 RNA质量及含量鉴定
提取出的RNA经琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s、28s三条RNA电泳带，RNA经紫外分光光度计测定吸光度260与280比值大于1.8。
2.2 结直肠癌及癌周IGF-ImRNA的表达
IGF-ImRNA经RTPCR扩增后，其产物电泳图见图1，被扩增的片断长度为296bp，产物经测序与欲扩增片断DNA序列一致。内标基因β-Actin同时电泳作为内部对照，所有组织标本均有表达。阴性对照均为阴性。
图1 IGF-I mRNA RT-PCR产物电泳图
注：M：PCR Marker;1、3、5、7：
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癌组织阳性表达;2、4、6、8：癌周组织阴性表达
2.3 IGF-ImRNA在结直肠癌及癌周组织表达的差异
28例结直肠癌组织中，20例有表达。而癌周组织中，仅3例有表达。两组表达率有显著性差异(P<0.01)(见表1)。
表1 结直肠癌及癌周IGF-I mRNA表达的差异 组别
n
阳性
阴性
P值
结直肠癌
28
, http://www.100md.com
20
8
<0.01
癌周
28
3
25
合计
56
23
33
χ2=18.88
2.4 IGF-I mRNA在A、B期癌及C、D期癌表达的差异
, 百拇医药
A、B期癌13例，IGFImRNA有表达者5例;C、D期癌15例，全部有IGFImRNA的表达，两组表达率有显著性差异(P<0.01)(见表2)。
表2 A、B期癌与C、D期癌IGF-m RNA表达差异 组别
n
阳性
阴性
P值
A、B期
13
5
8
<0.01
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C、D期
15
15
0
合计
28
20
8
3 讨论
胰岛素样生长因子(IGF)是目前已知的几个生长因子中十分重要的一个，因其与胰岛素具有结构同源性而得名[1]。有两种IGF多肽被证实：IGF-I及IGF-Ⅱ。IGF与肿瘤关系密切，IGF-I对各种肿瘤细胞具有促有丝分裂作用，如对人乳腺癌细胞株[2]、人黑色素瘤细胞[3]等。国外有研究表明，IGF mRNA的表达水平与结肠癌的浸润深度有关[4]。
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我们采用RTPCR方法检测IGF-I mRNA在结直肠癌组织及癌周组织中的表达，结果表明，癌组织的表达阳性率明显高于癌周组织，提示IGF-I基因在结直肠癌组织中，存在激活的现象，C、D期结直肠癌的表达率明显高于A、B期，提示IGF-I mRNA的表达与结直肠癌的转移关系，IGF-I mRNA的表达能够促进结直肠癌的转移。IGF-I促进肿瘤转移的机制尚不明确，但在乳腺癌的研究中发现，IGF-I能够促进乳腺癌细胞的运动，进而促进肿瘤的转移[5]，其确切机制仍有待于进一步研究阐明。
鉴于IGF在肿瘤发生发展中的重要意义，有学者采用阻断IGF的方法对肿瘤进行治疗，方法主要有两种：第一，阻断IGF的合成或分泌，第二，阻断IGF与其受体的结合，应用这些方法，已取得了初步的治疗效果[2,6]。本实验结果显示，IGF-I在结直肠癌的发生发展中具有重要意义。因此，应用阻断IGF-I的方法对结直肠癌治疗可能也会有效，这有待于进一步研究证明。
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通讯作者：李晴：Tel：86-21-56770588-3361
[参考文献]
[1] Macaulay VM. Insulin-like growth factors and cancer [J]. Br J Cancer, 1992, 65：311～320.
[2] Rohlik QT, Adams D, Kull FC Jr, et al. An antibody to the receptor for insulin like growth factor I inhibits the growth of MCF-7 cells in tissue culture [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1987, 149：276～281.
[3] Rodeck U, Herlyn M, Menssen HD, et al. Metastatic but not primary melanoma cell lines grow in vitro independently of exogenous growth factors [J]. Int J Cancer,1987,40：687～690.
, 百拇医药
[4] Tricoli JV, Rall LB, Karakousis CP, et al. Enhanced levels of insulin-like growth factor messenger RNA in human colon carcinomas and liposarcomas [J]. Cancer Res, 1986, 46：6169～6173.
[5] Doerr ME, Jones JI. The roles of integrins and extracellular matrix proteins in the insulin-like growth factor I-stimulated chemotaxis of human breast cancer cells [J]. J Biol Chem, 1996, 271：2443～2447.
[6] Huynh HT, Tetenes E, Wallace L, et al. In vivo inhibition of insulin-like growth factor I gene expression by tamoxifen [J]. Cancer Res,1993, 53：1727～1730.
收稿日期：1999-03-05;修回日期：1999-04-23, http://www.100md.com