白细胞介素-6和γ-干扰素基因在甲状腺组织中表达的研究
http://www.100md.com
南京医科大学学报 2000年第2期第20卷 论著
作者：段宇 刘超 蒋须勤 覃又文 刘翠萍 武晓泓
单位：南京医科大学第一附属医院内分泌研究室， 南京 210029
关键词：甲状腺；甲状腺疾病；白细胞介素-6；γ-干扰素；基因表达
南京医科大学学报000203
摘 要 目的 研究白细胞介素-6(IL-6)、γ-干扰素(IFN-γ)mRNA在正常及病理甲状腺组织中的表达特征。方法 病理甲状腺组织取自Graves病(GD)和非毒性结节性甲状腺肿(MNG)的手术患者，正常对照取材于孤立性良性甲状腺腺瘤旁正常组织，mRNA基因的检测采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术。结果 4例GD、2例MNG甲状腺组织均表达IL-6和IFN-γ mRNA,2份正常甲状腺样本中仅1例含有IL-6与IFN-γ mRNA。结论 IL-6、IFN-γ等细胞因子参与自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的免疫病理过程，并与甲状腺功能的紊乱密切相关。
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中图号 R581；R392.6
Gene Expression of Interleukin-6 and Interferon-γ in the Thyroid Gland
Duan Yu Liu Chao Jiang Xuqin
(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To investigate interleukin-6(IL-6) and interferon-γ (IFN-γ) gene expressions in normal and abnormal thyroid tissues. Methods Thyroid tissues were obtained from patients with Graves′ disease (GD,n=4), multinodular goiter (MNG,n=2). Normal thyroid are taken from paraadenomatous tissues on patients with thyroid adenoma (n=2). Total RNA was isolated from thyroid tissue, the cDNA was prepared by RT-PCR for IL-6 and IFN-γ. Results IL-6 and IFN-γ mRNAs have been detected in all samples from GD and MNG, though only in one of the two normal thyroid tissues. Conclusion IL-6 and IFN-γ genes are expressed in thryoid tissue, they might have important role both in the regulation of thyroid function and thyroid autoimmunity.
, 百拇医药
Key words thyroid gland; thyroid diseases; interleukin-6; interferon-γ; gene expression
细胞因子是由免疫细胞产生的一类具有免疫调节与效应功能的小分子多肽或蛋白，这种激素样活性物质，一方面维持机体的稳态，另一方面，又参与多种自身免疫性内分泌疾病的发生发展过程[1～3]。研究表明，细胞因子与自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的免疫病理过程密切相关，是甲状腺功能紊乱的重要因素之一[1，2]。本文采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，初步探讨白细胞介素-6(IL-6)和γ-干扰素(IFN-γ)在Graves病(GD)、非毒性结节性甲状腺肿(MNG)以及正常甲状腺组织中的表达特征。
1 材料和方法
1.1 甲状腺组织的制备
, http://www.100md.com
甲状腺取材于GD(n=4)、MNG(n=2)和孤立性良性甲状腺腺瘤旁正常组织(n=2)。组织在离体30 min内置液氮速冻后保存于-70℃。
1.2 RNA抽提和RT-PCR反应
1.2.1 RNA抽提
取50 mg甲状腺冷冻组织加入1 ml变性液(Trizol, Gibco产品)，冰浴中充分匀浆，至组织碎片完全消失，移入1.5 ml离心管中，室温静置5 min，加入氯仿200 μl，振荡15 s，加入异戊醇500 μl，充分混匀，静置10 min,以12 000×g、4℃，离心15 min，移出上层水相，加入等体积异丙醇，混匀，12 000×g、4℃，离心15 min。弃上清，75%冰乙醇洗2次，每次7 500×g、4℃，离心5 min，弃上清，超净工作台下自然干燥10 min，将抽提出的RNA充分溶解，取少量于754紫外分光光度计检测A260/A280，比值为1.6～1.9，计算RNA浓度。
, 百拇医药
1.2.2 cDNA合成及PCR扩增(Promega, RT-PCR kit)
50 μl反应体积中含逆转录酶、聚合酶、脱氧核苷酸(dNTP)各1 μl，镁离子5 μl，上、下游引物50 pmol, RNA 1 μg。RT-PCR采用温度条件为48℃、45 min, 96℃、7 min(逆转录)，93℃、45 s, 55℃、45 s, 72℃、45 s, 35个循环，72℃、6 min末循环。IL-6、IFN-γ、β-actin待扩增片段引物序列见表1(Endocrinol, 1994,141:309)，扩增片段长度分别为661 bp(IL-6),359 bp(IFN-γ), 628 bp(β-actin)。
表1 IL-6、IFN-γ、β-actin引物序列 IL-6
上游引物5′-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3′
, 百拇医药
下游引物5′-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3′
IFN-γ
上游引物5′-TACAAGTTATATCTTGGCTT-3′
下游引物5′-ACCGAATAATTAGTCAGCTT-3′
β-actin
上游引物5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTG-
CCCATCTA-3′
下游引物5′-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGAT-
GGAGGG-3′
, 百拇医药
1.3 PCR产物电泳
配制1%琼脂糖凝胶(含1%溴乙啶)、TBE电泳缓冲液(1.08% Tris, 5.4%硼酸，0.5 mol/LEDTA)，取5 μl PCR产物，加1 μl上样缓冲液，上样后电泳，电压为90V，1.0～1.5 h，紫外灯下观察结果。
2 结果
4例GD、2例MNG甲状腺组织均表达IL-6和IFN-γ mRNA，2例正常甲状腺样本中仅1例含有IL-6与IFN-γ mRNA(图1～3)。
图1 IL-6 mRNA在甲状腺组织中表达情况
, 百拇医药 图2 阳性参照β-actin mRNA在甲状腺组织中的表达
图3 IFN-γ mRNA在甲状腺组织中的表达
3 讨论
业已证实，内分泌细胞可产生多种细胞因子，后者对内分泌腺体生理功能的维持和某些病理状态的发生起到十分重要的作用。已有的研究资料显示，IL-6作为细胞因子网络的重要成员，具有活化B细胞、T细胞的功能，可以刺激甲状腺细胞(TEC)产生自身抗体，与正常甲状腺功能的调控、GD的免疫紊乱、激素异常密切相关[4]。IFN-γ作为一种炎症性细胞因子，对TEC上主要组织相容性(MHC)Ⅱ类抗原的表达具有促进作用，并能增强巨噬细胞和树突细胞对自身抗原提呈的能力，从而在甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和(或)促甲状腺激素受体抗体(TRAb)等甲状腺特异性抗体的生成和AITD的发生发展中扮演重要角色[5]。不仅如此，细胞因子尚能通过改变其他免疫分子的活性而间接发挥它们在GD等AITD中的致病作用。例如，肿瘤坏死因子(TNF)-α能加强转化生长因子(TGF-β)在TEC上的表达活性，从而改变甲状腺细胞的生长与分化状态[6]。IFN-γ、TNF-α、IL-1则可以诱导并增强TEC产生细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的能力，后者在介导甲状腺内活化T细胞与TEC紧密结合、加强效应T细胞识别与杀伤能力，以及在免疫选择和免疫粘附等一系列病理活动中发挥的作用正日益受到人们的重视[7]。因此，研究AITD细胞因子的变化模式具有重要的实际意义。
, 百拇医药
在AITD的甲状腺组织中，甲状腺上皮细胞、活化T细胞、巨噬细胞等都具备产生细胞因子的能力[1～3]。由于免疫组化方法很难在甲状腺组织中发现IL-6、IFN-γ等细胞因子相关蛋白，Northern blot分析和原位杂交也较少证明低水平细胞因子mRNA在甲状腺组织中的表达[1，2]。因此，我们选择了高灵敏度的RT-PCR方法，旨在大幅提高上述免疫分子的检出概率。
本研究发现，甲状腺组织中含有IL-6及IFN-γ两种细胞因子的mRNA，但正常甲状腺组织表达此类细胞因子的模式有别于GD和MNG两种病理组织，说明IL-6与IFN-γ不仅参与TEC生理功能的调节，而且与甲状腺疾病，特别是AITD的发生、发展存在内在关联性。
由于甲状腺组织中多种细胞成分均能够合成与释放细胞因子，故本研究尚无法明确IL-6及IFN-γ是否来源于TEC。因此，有必要采用TEC培养的方法，进一步探讨细胞因子的表达特征，继而确定其在甲状腺疾病发病机理中的地位与作用。
, 百拇医药
江苏省自然科学基金资助项目(056DA9502)
参考文献
1，Paschke R, Schupport F, Taton M, et al. Intrathyroidal cytokine gene expression profiles in autoimmune thyroiditis. Endocrinol, 1994,141:309
2，Waston PF, Pickerill AP, Davies R, et al. Analysis of cytokine gene expression in Graves′ disease and multinodular goiter. J Clin Endocrinol, 1994,79:355
3，Zipris D, Greiner DL, Malkani S, et al. Cytokine gene expression in islets and thyroids of BB rats. J Immunol, 1996,156：1315
, 百拇医药
4，刘 超.白介素-6与甲状腺.国外医学.内分泌分册，1999，19(3)：117
5，Marazuela M, Garia B. Thyroid autoimmune disorders in patients with chronic hepatitis C before and during interferons therapy. Clin Endocrinol, 1996,44:635
6，Pekary AE, Berg L, Wang J, et al. TNF-α, TSH and aging regulate TGF-beta synthesis and secretion in FRTL-5 rat thyroid cells. Am J Physiol, 1995,268(3/2):808
7，段 宇，刘 超.粘附分子与自身免疫性甲状腺疾病.国外医学*内分泌学分册，1998，18(增)：8
(1999-06-07收稿), 百拇医药
单位：南京医科大学第一附属医院内分泌研究室， 南京 210029
关键词：甲状腺；甲状腺疾病；白细胞介素-6；γ-干扰素；基因表达
南京医科大学学报000203
摘 要 目的 研究白细胞介素-6(IL-6)、γ-干扰素(IFN-γ)mRNA在正常及病理甲状腺组织中的表达特征。方法 病理甲状腺组织取自Graves病(GD)和非毒性结节性甲状腺肿(MNG)的手术患者，正常对照取材于孤立性良性甲状腺腺瘤旁正常组织，mRNA基因的检测采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术。结果 4例GD、2例MNG甲状腺组织均表达IL-6和IFN-γ mRNA,2份正常甲状腺样本中仅1例含有IL-6与IFN-γ mRNA。结论 IL-6、IFN-γ等细胞因子参与自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的免疫病理过程，并与甲状腺功能的紊乱密切相关。
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中图号 R581；R392.6
Gene Expression of Interleukin-6 and Interferon-γ in the Thyroid Gland
Duan Yu Liu Chao Jiang Xuqin
(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To investigate interleukin-6(IL-6) and interferon-γ (IFN-γ) gene expressions in normal and abnormal thyroid tissues. Methods Thyroid tissues were obtained from patients with Graves′ disease (GD,n=4), multinodular goiter (MNG,n=2). Normal thyroid are taken from paraadenomatous tissues on patients with thyroid adenoma (n=2). Total RNA was isolated from thyroid tissue, the cDNA was prepared by RT-PCR for IL-6 and IFN-γ. Results IL-6 and IFN-γ mRNAs have been detected in all samples from GD and MNG, though only in one of the two normal thyroid tissues. Conclusion IL-6 and IFN-γ genes are expressed in thryoid tissue, they might have important role both in the regulation of thyroid function and thyroid autoimmunity.
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Key words thyroid gland; thyroid diseases; interleukin-6; interferon-γ; gene expression
细胞因子是由免疫细胞产生的一类具有免疫调节与效应功能的小分子多肽或蛋白，这种激素样活性物质，一方面维持机体的稳态，另一方面，又参与多种自身免疫性内分泌疾病的发生发展过程[1～3]。研究表明，细胞因子与自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的免疫病理过程密切相关，是甲状腺功能紊乱的重要因素之一[1，2]。本文采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，初步探讨白细胞介素-6(IL-6)和γ-干扰素(IFN-γ)在Graves病(GD)、非毒性结节性甲状腺肿(MNG)以及正常甲状腺组织中的表达特征。
1 材料和方法
1.1 甲状腺组织的制备
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甲状腺取材于GD(n=4)、MNG(n=2)和孤立性良性甲状腺腺瘤旁正常组织(n=2)。组织在离体30 min内置液氮速冻后保存于-70℃。
1.2 RNA抽提和RT-PCR反应
1.2.1 RNA抽提
取50 mg甲状腺冷冻组织加入1 ml变性液(Trizol, Gibco产品)，冰浴中充分匀浆，至组织碎片完全消失，移入1.5 ml离心管中，室温静置5 min，加入氯仿200 μl，振荡15 s，加入异戊醇500 μl，充分混匀，静置10 min,以12 000×g、4℃，离心15 min，移出上层水相，加入等体积异丙醇，混匀，12 000×g、4℃，离心15 min。弃上清，75%冰乙醇洗2次，每次7 500×g、4℃，离心5 min，弃上清，超净工作台下自然干燥10 min，将抽提出的RNA充分溶解，取少量于754紫外分光光度计检测A260/A280，比值为1.6～1.9，计算RNA浓度。
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1.2.2 cDNA合成及PCR扩增(Promega, RT-PCR kit)
50 μl反应体积中含逆转录酶、聚合酶、脱氧核苷酸(dNTP)各1 μl，镁离子5 μl，上、下游引物50 pmol, RNA 1 μg。RT-PCR采用温度条件为48℃、45 min, 96℃、7 min(逆转录)，93℃、45 s, 55℃、45 s, 72℃、45 s, 35个循环，72℃、6 min末循环。IL-6、IFN-γ、β-actin待扩增片段引物序列见表1(Endocrinol, 1994,141:309)，扩增片段长度分别为661 bp(IL-6),359 bp(IFN-γ), 628 bp(β-actin)。
表1 IL-6、IFN-γ、β-actin引物序列 IL-6
上游引物5′-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3′
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下游引物5′-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3′
IFN-γ
上游引物5′-TACAAGTTATATCTTGGCTT-3′
下游引物5′-ACCGAATAATTAGTCAGCTT-3′
β-actin
上游引物5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTG-
CCCATCTA-3′
下游引物5′-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGAT-
GGAGGG-3′
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1.3 PCR产物电泳
配制1%琼脂糖凝胶(含1%溴乙啶)、TBE电泳缓冲液(1.08% Tris, 5.4%硼酸，0.5 mol/LEDTA)，取5 μl PCR产物，加1 μl上样缓冲液，上样后电泳，电压为90V，1.0～1.5 h，紫外灯下观察结果。
2 结果
4例GD、2例MNG甲状腺组织均表达IL-6和IFN-γ mRNA，2例正常甲状腺样本中仅1例含有IL-6与IFN-γ mRNA(图1～3)。
图1 IL-6 mRNA在甲状腺组织中表达情况
, 百拇医药 图2 阳性参照β-actin mRNA在甲状腺组织中的表达
图3 IFN-γ mRNA在甲状腺组织中的表达
3 讨论
业已证实，内分泌细胞可产生多种细胞因子，后者对内分泌腺体生理功能的维持和某些病理状态的发生起到十分重要的作用。已有的研究资料显示，IL-6作为细胞因子网络的重要成员，具有活化B细胞、T细胞的功能，可以刺激甲状腺细胞(TEC)产生自身抗体，与正常甲状腺功能的调控、GD的免疫紊乱、激素异常密切相关[4]。IFN-γ作为一种炎症性细胞因子，对TEC上主要组织相容性(MHC)Ⅱ类抗原的表达具有促进作用，并能增强巨噬细胞和树突细胞对自身抗原提呈的能力，从而在甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和(或)促甲状腺激素受体抗体(TRAb)等甲状腺特异性抗体的生成和AITD的发生发展中扮演重要角色[5]。不仅如此，细胞因子尚能通过改变其他免疫分子的活性而间接发挥它们在GD等AITD中的致病作用。例如，肿瘤坏死因子(TNF)-α能加强转化生长因子(TGF-β)在TEC上的表达活性，从而改变甲状腺细胞的生长与分化状态[6]。IFN-γ、TNF-α、IL-1则可以诱导并增强TEC产生细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的能力，后者在介导甲状腺内活化T细胞与TEC紧密结合、加强效应T细胞识别与杀伤能力，以及在免疫选择和免疫粘附等一系列病理活动中发挥的作用正日益受到人们的重视[7]。因此，研究AITD细胞因子的变化模式具有重要的实际意义。
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在AITD的甲状腺组织中，甲状腺上皮细胞、活化T细胞、巨噬细胞等都具备产生细胞因子的能力[1～3]。由于免疫组化方法很难在甲状腺组织中发现IL-6、IFN-γ等细胞因子相关蛋白，Northern blot分析和原位杂交也较少证明低水平细胞因子mRNA在甲状腺组织中的表达[1，2]。因此，我们选择了高灵敏度的RT-PCR方法，旨在大幅提高上述免疫分子的检出概率。
本研究发现，甲状腺组织中含有IL-6及IFN-γ两种细胞因子的mRNA，但正常甲状腺组织表达此类细胞因子的模式有别于GD和MNG两种病理组织，说明IL-6与IFN-γ不仅参与TEC生理功能的调节，而且与甲状腺疾病，特别是AITD的发生、发展存在内在关联性。
由于甲状腺组织中多种细胞成分均能够合成与释放细胞因子，故本研究尚无法明确IL-6及IFN-γ是否来源于TEC。因此，有必要采用TEC培养的方法，进一步探讨细胞因子的表达特征，继而确定其在甲状腺疾病发病机理中的地位与作用。
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江苏省自然科学基金资助项目(056DA9502)
参考文献
1，Paschke R, Schupport F, Taton M, et al. Intrathyroidal cytokine gene expression profiles in autoimmune thyroiditis. Endocrinol, 1994,141:309
2，Waston PF, Pickerill AP, Davies R, et al. Analysis of cytokine gene expression in Graves′ disease and multinodular goiter. J Clin Endocrinol, 1994,79:355
3，Zipris D, Greiner DL, Malkani S, et al. Cytokine gene expression in islets and thyroids of BB rats. J Immunol, 1996,156：1315
, 百拇医药
4，刘 超.白介素-6与甲状腺.国外医学.内分泌分册，1999，19(3)：117
5，Marazuela M, Garia B. Thyroid autoimmune disorders in patients with chronic hepatitis C before and during interferons therapy. Clin Endocrinol, 1996,44:635
6，Pekary AE, Berg L, Wang J, et al. TNF-α, TSH and aging regulate TGF-beta synthesis and secretion in FRTL-5 rat thyroid cells. Am J Physiol, 1995,268(3/2):808
7，段 宇，刘 超.粘附分子与自身免疫性甲状腺疾病.国外医学*内分泌学分册，1998，18(增)：8
(1999-06-07收稿), 百拇医药