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编号:10231267
一种筛选自由基清除剂的简便方法
http://www.100md.com 《中草药》 2000年第2期
     作者:许申鸿 杭瑚

    单位:许申鸿(青岛大学化学系,266071);杭瑚(青岛大学化学系,266071)

    关键词:二苯代苦味肼基自由基;自由基清除剂;筛选研究

    中草药000209摘 要 对二苯代苦味肼基自由基(DPPH *)分光分析法进行了系统研究,结果表明,该法灵敏、简便、实用且重现性好,不失为筛选自由基清除剂的好方法。

    A Simple Method for the Screening of Free Radical Scavenger

    Xu Shenhong and Hang Hu

    (Department of Chemistry, Qingdao University Qingdao 266071)
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    Abstract The use of 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical for the screening of free radical scavenger was studied by spectrophotometry. The result showed that the method was sensitive, simple, applicable and had a good reproducibility. It is a good method for the screening of free radical scavenger.

    Key words 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical free radical scavenger screening

    随着自由基生物学与自由基医学的迅速发展,现已证明多种疾病的发生和发展与自由基对组织细胞的损伤关系密切[1,2]。因此,研究自由基的检测方法并探讨物质对自由基的清除作用具有重要意义。
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    自由基的检测方法很多,如电子顺磁共振法,电子自旋共振法,气-液色谱法,发光法等。但这些方法大多需用昂贵的仪器,一般实验室难以应用。二苯代苦味肼基自由基(DPPH )分光测定法的测定原理是依据DPPH 在517 nm处有一强吸收,其乙醇溶液呈深紫色[3,4]。当有自由基清除剂存在时,由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其接受的电子数成定量关系。因而可用分光法进行定量分析。1958年Blois[5]将其应用于抗氧化剂的筛选研究。此后,国外又有很多学者用此法研究了物质清除自由基的性质[6~11]。然而,这种自由基分光分析法在国内却很少有报道。实验表明,该法简便易行,灵敏可靠,不失为筛选天然产物抗氧化剂的好方法之一。

    1 材料与方法

    1.1 仪器:722型分光光度计(上海第三分析仪器厂产品)。
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    1.2 试剂:DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)(日本,东京化成工业株式会社产品),分别以乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二甲亚砜为溶剂配制浓度为6.5×10-4 mol/L的储液,于冰箱存放,临用时将储液以同一种溶剂稀释至6.5×10-5 mol/L。其它试剂均为国产分析纯。

    1.3 方法:在最大波长处(517 nm),于直径1 cm比色皿中,按表1加样测定各吸光度(A),总体积3.0 mL。每一吸光度平行测3次,取其平均值。清除率按下式计算:

    表1 DPPH 实验加样表 Ao 2.5 mL 6.5×10-5 mol/L DPPH 溶液+0.5 mL 试样的溶剂,为空白对照
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    Ai 2.5 mL 6.5×10-5 mol/L DPPH 溶液+0.5 mL 试样

    Aj 2.5 mL DPPH 溶液的溶剂+0.5 mL 试样

    2 结果与讨论

    2.1 波长与吸光度之关系:按上述1.3方法操作,于不同波长处测定吸光度,结果表明,各种溶剂中DPPH 溶液的最大吸光度均在517 nm附近,这与文献[3,4]报道一致。

    2.2 DPPH 溶液浓度与吸光度的关系:实验表明,在1.0×10-5~2.0×10-4 mol/L范围内DPPH 溶液浓度与A呈线性正相关关系。用最小二乘法作线性回归,得DPPH 溶液浓度(C×10-5 mol/L)与A关系曲线的回归方程式:A=-0.003 0+0.077 7C,r=0.099 98。采用比色分析手段,通过溶液颜色的变化,可了解加入样品后剩余DPPH 的含量。
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    2.3 DPPH 浓度对测量线性范围及测定灵敏度的影响:特丁基对苯二酚(TBHQ)是现今食品业广为应用的合成抗氧化剂。我们以TBHQ为试样,研究DPPH 溶液浓度对其测量线性范围及测定灵敏度的影响,结果(表2),TBHQ的测量线性范围随DPPH 浓度的增加而增大,但其测定灵敏度(以IC50表示)却随之而降低。

    表2 DPPH 浓度对测量线性范围及灵敏度的影响 [DPPH ](mol/L)

    线性范围(g/mL)

    IC50(g/mL)

    6.5×10-5

    2×10-7~3×10-6
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    1.7×10-6

    1×10-4

    3×10-7~5×10-6

    2.7×10-6

    2×10-4

    3×10-7~1×10-5

    5.4×10-6

    2.4 体系显色的稳定性:实验表明,各种溶剂(乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二甲亚砜)中的DPPH 溶液的A值在35 min内基本不变,表明该显色体系较稳定。以乙醇、甲醇、二甲亚砜为溶剂的DPPH 分析法曾有报道[1~11],但其它溶剂中DPPH 分析法未见报道。本研究表明,DPPH 分析法可用于多种有机溶剂提取物抗氧化性质的研究。
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    2.5 干扰实验:以1.7×10-7 g/mL TBHQ对DPPH 进行清除实验,在误差小于5%的情况下,相关成分影响如下:10 000倍的Na+、Cl-、Br-;100倍的NO3-、NO2-、SO42-、Mg2+、蔗糖、葡萄糖;10倍的Mn2+、I-;等倍的Zn2+、Fe3+、SO32-不干扰测定;等倍量的Fe2+、Cu2+、S2O32-产生干扰。

    2.6 回收实验:抗坏血酸(Vc)和茶多酚(TP)是公认的安全可靠的天然抗氧化剂。它们清除DPPH 实验结果及回收率实验结果见表3。表3 应用实验及回收实验结果 样品
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    加入量

    (g/mL)

    DPPH 清除

    率(%)

    TBHQ加入量

    (g/mL)

    回收量

    (g/mL)

    回收率

    (%)

    Vc

    8.6×10-7
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    10.3

    3.3×10-7

    11.7×10-7

    93.9

    TP

    3.3×10-7

    9.5

    3.3×10-7

    6.7×10-7

    103.0

    3 应用实验
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    生姜为多年生草本植物,它在传统中医药学中具有很广泛的用途。已有文献报道它具有清除活性氧自由基的作用[2],并已将其用作食用油等的抗氧剂[13,14]。我们研究它对DPPH 的清除作用,其IC50(清除50%DPPH 所需试剂量)为3.8 mg/mL,这表明DPPH 的实验结果与其它自由基的清除实验结果是一致的。

    △山东省自然科学基金资助课题(Y98DO2050)

    许申鸿 女,40岁。1982年毕业于石油大学炼制系化学师资专业。副教授,现在青岛大学化学系工作,主要从事有机化学的教学与研究。

    参考文献

    1,Barry H, et al. Free radicals in Biology and Medicine. Oxford, Charendon Press, 1985:37
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    2,方允中,等.自由基与酶—基础理论及其在生理学和医学中的应用.北京:科学出版社,1989:11,193

    3,许士凯.抗衰老药物学.北京:中国医药科技出版社,1995:200

    4,Nicole C, et al., Free Radical Biology & Medicine, 1996,20(1):35

    5,Blois, M S. Nature, 1958,181:1199

    6,Cheng Z J, et al., Biochimica et Biophysica Acta., 1998, 1392:291

    7,Mellors A, et al., J Biol Chem,1966,241:4353
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    8,Alexandre C, et al. Planta Med, 1998,64:393

    9,Jose A L, et al. J Agric Food Chem, 1998,46:2694

    10,Makoto H, et al. J Agric Food Chem, 1998,46:2167

    11,Esperanza J, et al. J Nat Prod,1998,61:706

    12,田亚平,等.自由基生命科学进展.第1集.北京:原子能出版社,1993:72

    13,李爱华.食品科学,1995,16(12):35

    14,许淑英编译.食品科学,1987,9:49

    (1999-05-24 收稿), 百拇医药