高效液相色谱法测定天麻中L-焦谷氨酸的含量
作者：郝小燕 谭宁华
单位：郝小燕(贵阳医学院药学系，550004)；谭宁华(中国科学院昆明植物研究所植化开放研究实验室)
关键词：天麻；L-焦谷氨酸；HPLC法；含量测定
中草药000208摘 要 应用HPLC法对不同来源和加工方法不同的天麻Gastrodia elata Bl.中L-焦谷氨酸成分进行了定量分析。结果显示L-焦谷氨酸在天麻中的含量因产地、栽培方法和加工方法的不同而有差异。野生比家种、鲜品比干品的L-焦谷氨酸含量高。
Quantitative Analysis of L-Pyroglutamic Acid of Tall Gastrodia
(Gastrodia elata) by HPLC
, 百拇医药
Hao Xiaoyan
(Department of Pharmacy, Guiyang Medical College Guiyang 550004)
Tan Ninghua
(Laboratory of Phytochemistry, Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences)
Abstract Quantitative analysis of L-pyroglutamic acid in Gastrodia elata Bl. collected from different origins and prepared through different procedures were carried out by HPLC. The results indicated that the contents of L-pyroglutamic acid in different G. elata varied differently as to their habitats, cultivation and preparative processes. As an overall result, it is clear that the concentrations of L-pyroglutamic acid in wild and fresh G. elata are higher than that of the cultivated and dried varieties.
, 百拇医药
Key words Gastrodia elata Bl.L-pyroglutamic acid HPLC quantitative analysis▲
天麻Gastrodia elata Bl.是我国著名的中药，目前已普遍种植。有关天麻的药理实验表明具有镇惊、抗癫痫、镇静、安眠、镇痛等作用[1，2]。关于其化学成分研究的报道，多集中于酚类化合物和有机酸类化合物[3～8]。在试图从中寻找环肽化合物的过程中，我们从天麻中分离得到L-焦谷氨酸。据文献[9]报道L-焦谷氨酸具有抗惊厥等作用，因此推测L-焦谷氨酸可能是天麻的活性成分之一。
另有文献[10]报道，天然鲜人参中焦谷氨酸的含量远高于加工品人参，不同的品种人参中L-焦谷氨酸的含量有显著差异。因此，我们对不同产地、不同栽培方法、不同加工方法的天麻样品中L-焦谷氨酸的含量进行了定量分析，测定了不同品种天麻中L-焦谷氨酸的含量，并探讨了不同加工方法对L-焦谷氨酸含量变化的影响。
, 百拇医药
1 仪器和试剂
仪器：Hewlet Packard HP1100高效液相色谱仪。HP工作站数据处理机；HP自动进样器。
试剂：无水乙醇(优级纯)，超纯水，无水醋酸钠(分析纯)。
2 样品的制备
不同来源的天麻样品1～7号(见表1)经粉碎后，精确称取10 g粉末，分别用10倍量的无水乙醇浸泡过夜后，用超声波震荡35 min，过滤。重复提取3次，合并提取液。提取液减压浓缩至一定的体积后，用无水乙醇定容到10 mL容量瓶中，供定量分析用。样品8～10号为云南昭通家种新鲜天麻，8号是用鲜品(含水量为70.74 %)直接提取，9号是用晒干品(含水量为47.47%)提取，10号是用烘干品(80 ℃烘至恒重)提取，提取方法同上。
3 分离条件和测定方法
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3.1 分离条件：经反复试验和比较不同类型的流动相，确定天麻中L-焦谷氨酸的分离条件如下：色谱柱：Selectosil C18, 5 μ,250 mm×4.60 mm；流动相5 mmol/L NaAc水溶液；流速1 mL/min；紫外检测波长210 nm；柱温35 ℃；进样量5 μL；分离效果见图1。
3.2 标准曲线的制备：精密称取L-焦谷氨酸对照品(作者从天麻中分离得到，纯度为98%以上)2.0 mg置于10 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解定容，取此溶液分别进样2.5，5.0，10.0 μL。在上述色谱条件下测定，记录峰面积与进样量。L-焦谷氨酸在0.5～2.0 μg范围内峰面积Y与浓度X的线性关系良好，r=0.999 98。
3.3 精密度、回收试验、重复性实验：称取10.00 g 1号样品各4份，平行测定L-焦谷氨酸的含量分别为：0.009 28%，0.009 33%，0.009 59%，0.009 90%，平均为0.009 52%，RSD为2.99%。
, 百拇医药
重现性实验：重复进样1号样品4份，测定L-焦谷氨酸的含量分别为：0.009 33 %、0.009 26 %、0.009 53 %、0.009 64 %，平均为0.009 44 %，RSD为1.86 %。
回收率实验：准确称取102.0 μg对照品3份，分别加到5.0 g的1号样品中，并按上述方法提取，测定。回收率为100.93 %，RSD为3.52 %。
3.4 样品的测定：将上述样品1～10号，分别进样5 μL，与对照品的相对保留时间比较，并用加入法定量，用外标法由数据处理机计算L-焦谷氨酸的含量，分析结果见表1。
A-天麻样品1号 *L-焦谷氨酸 B-L焦谷氨酸对照品
图1 样品HPLC图
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表1 不同品种天麻中L-焦谷氨酸的含量(%) 样品编号
样品名称
L-焦谷氨酸含量
(%)
样品编号
样品名称
L-焦谷氨酸含量
(%)
1
贵州大方野生天麻
0.009 44
6
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云南昭通野生天麻
0.008 66
2
贵州毕节家种天麻
0.002 15
7
云南昭通家种天麻
0.003 58
3
贵州毕节野生天麻
0.006 13
8
, http://www.100md.com 云南昭通家种天麻(鲜品)
0.018 76
4
贵州毕节野生幼天麻
0.007 28
9
云南昭通家种天麻(晒干品)
0.012 51
5
贵州毕节家种幼天麻
0.001 14
10
, 百拇医药
云南昭通家种天麻(烘干品)
0.002 53
4 结果与讨论
用高效液相色谱仪，以L-焦谷氨酸为对照品用外标法定量分析了不同来源和加工方法不同的天麻样品中L-焦谷氨酸的含量，结果(见表1)表明：(1)来自不同产地的天麻中L-焦谷氨酸的含量不同。(2)野生天麻中L-焦谷氨酸的含量高于家种天麻，这一现象表明L-焦谷氨的含量与天麻的品质有关。(3)不同加工方法对L-焦谷氨酸的含量有显著影响，鲜品比干品的含量高。对于同一新鲜样品，8号样品是不经任何处理，直接用无水乙醇提取，L-焦谷氨酸的含量最高；10号样品是将天麻烘干，用同样方法提取，其含量最低；9号样品是晒干后提取，其含量居中。对于市售天麻通常加工方法是将鲜品清蒸，然后烘干或晒干，其含量均低于8号、9号样品。对加工过程影响L-焦谷氨酸含量变化的机制，有待于进一步深入研究。
, http://www.100md.com 致谢：本工作得到中科院昆明植物所李炳钧副研究员、丁靖凯研究员、李顺林副研究员及植化开放实验室的大力支持；中科院昆明植物所周铉副研究员鉴定天麻药材。
△贵州省自然科学研究基金资助项目
郝小燕 贵州大学化学系毕业。现在贵阳医学院药学系分析化学教研究室工作，副教授。主要从事分析化学教学和植物化学科研工作。
参考文献
1，陆 伟.中草药，1985，16(9)：40
2，江苏新医学院编.中药大辞典.上册.上海：上海科学技术出版社，1995：315
3，周 俊，等.化学学报，1979，37(3)：183
4，周 俊，等.云南植物研究，1980，2(3)：370
, http://www.100md.com
5，周 俊，等.科学通报，1981，26(18)：1118
6，Taguchi H, et al. Chem pharm Bull,1981,29(1):55
7，Noda N, et al. Phytochem,1995,39(5):1247
8，Lin J H, et al. Phytochem,1996,42(2):549
9，Nicole D, et al. Neuropharmacology,1985,24(9):903
10，秦 波，等.中草药，1994，25(2)：75
(1998-12-25 收稿), http://www.100md.com
单位：郝小燕(贵阳医学院药学系，550004)；谭宁华(中国科学院昆明植物研究所植化开放研究实验室)
关键词：天麻；L-焦谷氨酸；HPLC法；含量测定
中草药000208摘 要 应用HPLC法对不同来源和加工方法不同的天麻Gastrodia elata Bl.中L-焦谷氨酸成分进行了定量分析。结果显示L-焦谷氨酸在天麻中的含量因产地、栽培方法和加工方法的不同而有差异。野生比家种、鲜品比干品的L-焦谷氨酸含量高。
Quantitative Analysis of L-Pyroglutamic Acid of Tall Gastrodia
(Gastrodia elata) by HPLC
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Hao Xiaoyan
(Department of Pharmacy, Guiyang Medical College Guiyang 550004)
Tan Ninghua
(Laboratory of Phytochemistry, Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences)
Abstract Quantitative analysis of L-pyroglutamic acid in Gastrodia elata Bl. collected from different origins and prepared through different procedures were carried out by HPLC. The results indicated that the contents of L-pyroglutamic acid in different G. elata varied differently as to their habitats, cultivation and preparative processes. As an overall result, it is clear that the concentrations of L-pyroglutamic acid in wild and fresh G. elata are higher than that of the cultivated and dried varieties.
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Key words Gastrodia elata Bl.L-pyroglutamic acid HPLC quantitative analysis▲
天麻Gastrodia elata Bl.是我国著名的中药，目前已普遍种植。有关天麻的药理实验表明具有镇惊、抗癫痫、镇静、安眠、镇痛等作用[1，2]。关于其化学成分研究的报道，多集中于酚类化合物和有机酸类化合物[3～8]。在试图从中寻找环肽化合物的过程中，我们从天麻中分离得到L-焦谷氨酸。据文献[9]报道L-焦谷氨酸具有抗惊厥等作用，因此推测L-焦谷氨酸可能是天麻的活性成分之一。
另有文献[10]报道，天然鲜人参中焦谷氨酸的含量远高于加工品人参，不同的品种人参中L-焦谷氨酸的含量有显著差异。因此，我们对不同产地、不同栽培方法、不同加工方法的天麻样品中L-焦谷氨酸的含量进行了定量分析，测定了不同品种天麻中L-焦谷氨酸的含量，并探讨了不同加工方法对L-焦谷氨酸含量变化的影响。
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1 仪器和试剂
仪器：Hewlet Packard HP1100高效液相色谱仪。HP工作站数据处理机；HP自动进样器。
试剂：无水乙醇(优级纯)，超纯水，无水醋酸钠(分析纯)。
2 样品的制备
不同来源的天麻样品1～7号(见表1)经粉碎后，精确称取10 g粉末，分别用10倍量的无水乙醇浸泡过夜后，用超声波震荡35 min，过滤。重复提取3次，合并提取液。提取液减压浓缩至一定的体积后，用无水乙醇定容到10 mL容量瓶中，供定量分析用。样品8～10号为云南昭通家种新鲜天麻，8号是用鲜品(含水量为70.74 %)直接提取，9号是用晒干品(含水量为47.47%)提取，10号是用烘干品(80 ℃烘至恒重)提取，提取方法同上。
3 分离条件和测定方法
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3.1 分离条件：经反复试验和比较不同类型的流动相，确定天麻中L-焦谷氨酸的分离条件如下：色谱柱：Selectosil C18, 5 μ,250 mm×4.60 mm；流动相5 mmol/L NaAc水溶液；流速1 mL/min；紫外检测波长210 nm；柱温35 ℃；进样量5 μL；分离效果见图1。
3.2 标准曲线的制备：精密称取L-焦谷氨酸对照品(作者从天麻中分离得到，纯度为98%以上)2.0 mg置于10 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解定容，取此溶液分别进样2.5，5.0，10.0 μL。在上述色谱条件下测定，记录峰面积与进样量。L-焦谷氨酸在0.5～2.0 μg范围内峰面积Y与浓度X的线性关系良好，r=0.999 98。
3.3 精密度、回收试验、重复性实验：称取10.00 g 1号样品各4份，平行测定L-焦谷氨酸的含量分别为：0.009 28%，0.009 33%，0.009 59%，0.009 90%，平均为0.009 52%，RSD为2.99%。
, 百拇医药
重现性实验：重复进样1号样品4份，测定L-焦谷氨酸的含量分别为：0.009 33 %、0.009 26 %、0.009 53 %、0.009 64 %，平均为0.009 44 %，RSD为1.86 %。
回收率实验：准确称取102.0 μg对照品3份，分别加到5.0 g的1号样品中，并按上述方法提取，测定。回收率为100.93 %，RSD为3.52 %。
3.4 样品的测定：将上述样品1～10号，分别进样5 μL，与对照品的相对保留时间比较，并用加入法定量，用外标法由数据处理机计算L-焦谷氨酸的含量，分析结果见表1。
A-天麻样品1号 *L-焦谷氨酸 B-L焦谷氨酸对照品
图1 样品HPLC图
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表1 不同品种天麻中L-焦谷氨酸的含量(%) 样品编号
样品名称
L-焦谷氨酸含量
(%)
样品编号
样品名称
L-焦谷氨酸含量
(%)
1
贵州大方野生天麻
0.009 44
6
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云南昭通野生天麻
0.008 66
2
贵州毕节家种天麻
0.002 15
7
云南昭通家种天麻
0.003 58
3
贵州毕节野生天麻
0.006 13
8
, http://www.100md.com 云南昭通家种天麻(鲜品)
0.018 76
4
贵州毕节野生幼天麻
0.007 28
9
云南昭通家种天麻(晒干品)
0.012 51
5
贵州毕节家种幼天麻
0.001 14
10
, 百拇医药
云南昭通家种天麻(烘干品)
0.002 53
4 结果与讨论
用高效液相色谱仪，以L-焦谷氨酸为对照品用外标法定量分析了不同来源和加工方法不同的天麻样品中L-焦谷氨酸的含量，结果(见表1)表明：(1)来自不同产地的天麻中L-焦谷氨酸的含量不同。(2)野生天麻中L-焦谷氨酸的含量高于家种天麻，这一现象表明L-焦谷氨的含量与天麻的品质有关。(3)不同加工方法对L-焦谷氨酸的含量有显著影响，鲜品比干品的含量高。对于同一新鲜样品，8号样品是不经任何处理，直接用无水乙醇提取，L-焦谷氨酸的含量最高；10号样品是将天麻烘干，用同样方法提取，其含量最低；9号样品是晒干后提取，其含量居中。对于市售天麻通常加工方法是将鲜品清蒸，然后烘干或晒干，其含量均低于8号、9号样品。对加工过程影响L-焦谷氨酸含量变化的机制，有待于进一步深入研究。
, http://www.100md.com 致谢：本工作得到中科院昆明植物所李炳钧副研究员、丁靖凯研究员、李顺林副研究员及植化开放实验室的大力支持；中科院昆明植物所周铉副研究员鉴定天麻药材。
△贵州省自然科学研究基金资助项目
郝小燕 贵州大学化学系毕业。现在贵阳医学院药学系分析化学教研究室工作，副教授。主要从事分析化学教学和植物化学科研工作。
参考文献
1，陆 伟.中草药，1985，16(9)：40
2，江苏新医学院编.中药大辞典.上册.上海：上海科学技术出版社，1995：315
3，周 俊，等.化学学报，1979，37(3)：183
4，周 俊，等.云南植物研究，1980，2(3)：370
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5，周 俊，等.科学通报，1981，26(18)：1118
6，Taguchi H, et al. Chem pharm Bull,1981,29(1):55
7，Noda N, et al. Phytochem,1995,39(5):1247
8，Lin J H, et al. Phytochem,1996,42(2):549
9，Nicole D, et al. Neuropharmacology,1985,24(9):903
10，秦 波，等.中草药，1994，25(2)：75
(1998-12-25 收稿), http://www.100md.com