南方红豆杉愈伤组织培养的研究
作者：盛长忠 王淑芳 王宁宁 陈喜文
单位：南开大学生命科学学院(天津 300071)
关键词：南方红豆杉；愈伤组织；水解酪蛋白；苯丙氨酸；乙酸钠
中草药000229摘 要 对南方红豆杉叶愈伤组织诱导条件及最适培养基组成成分进行了探讨。结果表明，2，4-D比NAA更有利于愈伤组织的形成。培养基中添加适当浓度的CA、Phe和乙酸钠能促进南方红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醇的积累。
Studies on Callus Culture of Maire Yew (Taxus chinensis var. mairei) Leaves
Sheng Changzhong, Wang Shufang, Wang Ningning and Chen Xiwen
, 百拇医药
(College of Life Sciences, Nankai University Tianjin 300071)
Abstract The induction condition and optimum medium constitution for callus growth of Taxus chinensis var. mairei (Lemee et Levl.) Cheng et L.K. Fu leaves were studied. The results indicated that 2, 4-D was more effective in inducing callus than NAA. Certain concentrations of CA (0.1%) phenylalanine (1.0 mmol/L) and sodium acetate (0.5 mmol/L) not only promoted the callus growth, but also increased the accumulation of taxol contents.
, 百拇医药
Key words Taxus chinensis var.mairei(Lemee et Levl.) Cheng et L. K. Fu callus tissue casein hydrolysate phenylalanine sodium acetate▲
红豆杉属植物中次生代谢产物紫杉醇(paclitaxel)是当今新的具有明显疗效的抗癌药物，目前主要是从植物体中获取，来源有限，无法满足患者的需求。所以，国内外不少学者正致力于通过细胞工程技术生产紫杉醇的研究，以期缓和紫杉醇供应短缺的矛盾。目前有关红豆杉愈伤组织和细胞培养的研究已有不少报道。
本文以南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei叶为实验材料，研究了2，4-D和NAA对愈伤组织诱导的影响，并对愈伤组织的培养基组成成分的优化进行了初步探讨。可望为今后细胞大规模培养生产紫杉醇提供些实验依据。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 材料：南方红豆杉叶，由天津大学元英进教授提供。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的诱导：将南方红豆杉叶于自来水下冲洗3～4 h，浸入0.1%升汞中灭菌5 min后，用无菌水冲洗3次，再剪成0.5 cm长的切段，接种到诱导培养基中。
1.2.2 组织培养生长的指标
接种鲜重(克/瓶)=接种后瓶重-接种前瓶重
收获鲜重(克/瓶)=收获前瓶重-收获后瓶重
生长率(鲜重增长倍数)=收获鲜重/接种鲜重
1.2.3 紫杉醇的提取分离和HPLC分析：紫杉醇提取方法同文献[1]。
, 百拇医药
HPLC分析：将样品用1 mL色谱纯甲醇溶解，在C18反相硅胶柱进行恒速洗脱，流动相为甲醇-水(65∶35)，流速为1 mL/min，在227 nm下用紫外检测器检测。紫杉醇定量采用外标法。
2 结果与讨论
2.1 愈伤组织的诱导：将无菌的南方红豆杉叶片切段接种于添加不同浓度的生长素(2，4-D和NAA)和1 mg/L KT的B5培养基上。在25 ℃黑暗下培养，20 d左右，叶切面处膨大，逐渐形成愈伤组织。35 d时，统计叶切面处长出的愈伤组织情况(表1)。
表1 生长素对愈伤组织诱导的影响 生长素浓度(mg/L)
叶切段数
出愈段数
, 百拇医药 诱导率(%)
2，4-D
0.5
50
48
96.0
1.0
48
47
97.9
2.0
50
49
, 百拇医药 98.0
NAA
0.5
49
25
51.0
1.0
50
26
52.0
2.0
47
25
53.2
, 百拇医药
从表1可以看出，2，4-D和NAA的浓度对愈伤组织形成影响不大，但不同生长素诱导结果相差明显。2，4-D比NAA更有利于愈伤组织的形成，诱导率高得多，这与孙臖结果是一致的[2]。观察愈伤组织的颜色和性状也有明显差异，在含有2，4-D培养基上的愈伤组织颜色比较新鲜，块大、松软，而在NAA培养基上的愈伤组织块小，褐色，较硬。所以，以后的研究选用在添加2，4-D的培养基上的愈伤组织为实验材料。
2.2 愈伤组织的继代培养：35 d时，将愈伤组织剥离下来接种于含有1 mg/L KT、2 mg/L 2，4-D的培养基上。几天后，愈伤组织迅速变褐，后来无论是改变激素浓度及配比，还是采取频繁继代等措施，褐色现象均无多大变化，组织块硬，生长速率极为缓慢。大约1 a以后，愈伤组织长出新鲜松软的白色细胞团，生长速度变快。第4次继代培养的愈伤组织与1 a后的相比较，见图1。
, 百拇医药
A-为愈伤组织发生后第4代30 d时生长情况，黑褐色生长缓慢 B-愈伤组织生长1 a后培养30 d时情况。组织块松软，长出新鲜白色细胞
图1 南方红豆杉愈伤组织发生后的性状
有许多报道称，红豆杉愈伤组织发生后，要经历较长时间的继代培养，生长速率才能有所提高，有的竟长达2 a时间之久[3]。南方红豆杉愈伤组织也有这种特性。
2.3 水解酪蛋白(CA)对愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响：愈伤组织在含不同浓度CA的B5培养基(含1 mg/L KT、2 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L GA3)上生长30 d后收获，称鲜重，提取紫杉醇并测定含量，结果如图2。
, 百拇医药 图2 CA对南方红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响
在其它红豆杉愈伤组织的培养中，关于CA的作用既有对愈伤组织生长和紫杉醇含量无显著影响的报道[4]，也有能促进生物产量而不影响紫杉醇含量的报道。但对于南方红豆杉愈伤组织的影响尚未见报道。本实验结果表明，一定浓度(0.1%，0.5%)的CA能促进南方红豆杉愈伤组织的生长，最适浓度为0.5%，生长率达7.34%，是对照的1.6倍，但不利于紫杉醇积累，紫杉醇含量仅为对照的1/3。当CA浓度为0.1%时既能促进愈伤组织的生长(为对照的1.4倍)，又不影响紫杉醇的含量(略高于对照)。所以，该浓度是南方红豆杉愈伤组织培养的最适浓度。
2.4 苯丙氨酸(Phe)和乙酸钠对愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响：将愈伤组织培养在添加不同浓度的Phe和乙酸钠的B5培养基上(其它成分同前)，30 d收获。其生长率及紫杉醇含量如图3，4所示。
, http://www.100md.com
图3 不同浓度Phe对不同愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响
图4 不同浓度乙酸钠对愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响
结果表明，Phe在0～1.0 mmol/L时，愈伤组织生长速率变化不大，但是明显影响紫杉醇的含量。其中，1.0 mmol/L Phe效果最好，与对照相比，紫杉醇含量提高了近3倍。Phe浓度继续升高，反而对生长及紫杉醇的积累产生不利影响。
培养基中添加0.1～0.5 mmol/L的乙酸钠有利于愈伤组织生长和紫杉醇产量的提高。其中0.5 mmol/L时效果较好，使愈伤组织中紫杉醇的含量增加了2倍多。浓度过高不利于愈伤组织的生长，培养后很快变黑、衰老甚至死亡。
Strobe等[5](1982)通过饲喂短叶红豆杉无菌树皮小块，证明苯丙氨酸、亮氨酸和乙酸钠都是紫杉醇的前体，其中乙酸钠不仅掺入到乙酰基，而且还能掺入到苯环和紫杉烷的骨架中。Zamir等[6](1992)也用放射性同位素标记的前体进行饲喂实验，结果表明，侧链乙酰基来自乙酸，而C13位酯基侧链中的Phe CHCH(OH)COO-则来自苯丙氨酸。在其他红豆杉细胞培养中，有些报道[7]证明这些前体都能掺入到紫杉烷中。但也有一些种类红豆杉愈伤组织不能利用乙酸盐作为前体。本实验结果表明，南方红豆杉愈伤组织均能利用一定浓度的苯丙氨酸和乙酸钠来合成紫杉醇而不降低生物量。■
, 百拇医药
参考文献
1，Fett-Neto A G， et al. Plant Medica, 1992, 58:461
2，孙 臖，等.中草药，1997，28(增刊)：7
3，Wickremesinhe ERM, et al. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 1993，38：181
4，Fett-Neto A G， et al. Bio/Technology, 1993, 11:731
5，Strobel G A, et al. Plant Science, 1992, 84:65
6，Zamir L O, et al. Tetrahedron Lett, 1992，33(36)：5235
7，Fett-Neto A G， et al. Biotechnol/Bioengineer, 1994, 44:966
(1999-08-13 收稿), http://www.100md.com
单位：南开大学生命科学学院(天津 300071)
关键词：南方红豆杉；愈伤组织；水解酪蛋白；苯丙氨酸；乙酸钠
中草药000229摘 要 对南方红豆杉叶愈伤组织诱导条件及最适培养基组成成分进行了探讨。结果表明，2，4-D比NAA更有利于愈伤组织的形成。培养基中添加适当浓度的CA、Phe和乙酸钠能促进南方红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醇的积累。
Studies on Callus Culture of Maire Yew (Taxus chinensis var. mairei) Leaves
Sheng Changzhong, Wang Shufang, Wang Ningning and Chen Xiwen
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(College of Life Sciences, Nankai University Tianjin 300071)
Abstract The induction condition and optimum medium constitution for callus growth of Taxus chinensis var. mairei (Lemee et Levl.) Cheng et L.K. Fu leaves were studied. The results indicated that 2, 4-D was more effective in inducing callus than NAA. Certain concentrations of CA (0.1%) phenylalanine (1.0 mmol/L) and sodium acetate (0.5 mmol/L) not only promoted the callus growth, but also increased the accumulation of taxol contents.
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Key words Taxus chinensis var.mairei(Lemee et Levl.) Cheng et L. K. Fu callus tissue casein hydrolysate phenylalanine sodium acetate▲
红豆杉属植物中次生代谢产物紫杉醇(paclitaxel)是当今新的具有明显疗效的抗癌药物，目前主要是从植物体中获取，来源有限，无法满足患者的需求。所以，国内外不少学者正致力于通过细胞工程技术生产紫杉醇的研究，以期缓和紫杉醇供应短缺的矛盾。目前有关红豆杉愈伤组织和细胞培养的研究已有不少报道。
本文以南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei叶为实验材料，研究了2，4-D和NAA对愈伤组织诱导的影响，并对愈伤组织的培养基组成成分的优化进行了初步探讨。可望为今后细胞大规模培养生产紫杉醇提供些实验依据。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 材料：南方红豆杉叶，由天津大学元英进教授提供。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的诱导：将南方红豆杉叶于自来水下冲洗3～4 h，浸入0.1%升汞中灭菌5 min后，用无菌水冲洗3次，再剪成0.5 cm长的切段，接种到诱导培养基中。
1.2.2 组织培养生长的指标
接种鲜重(克/瓶)=接种后瓶重-接种前瓶重
收获鲜重(克/瓶)=收获前瓶重-收获后瓶重
生长率(鲜重增长倍数)=收获鲜重/接种鲜重
1.2.3 紫杉醇的提取分离和HPLC分析：紫杉醇提取方法同文献[1]。
, 百拇医药
HPLC分析：将样品用1 mL色谱纯甲醇溶解，在C18反相硅胶柱进行恒速洗脱，流动相为甲醇-水(65∶35)，流速为1 mL/min，在227 nm下用紫外检测器检测。紫杉醇定量采用外标法。
2 结果与讨论
2.1 愈伤组织的诱导：将无菌的南方红豆杉叶片切段接种于添加不同浓度的生长素(2，4-D和NAA)和1 mg/L KT的B5培养基上。在25 ℃黑暗下培养，20 d左右，叶切面处膨大，逐渐形成愈伤组织。35 d时，统计叶切面处长出的愈伤组织情况(表1)。
表1 生长素对愈伤组织诱导的影响 生长素浓度(mg/L)
叶切段数
出愈段数
, 百拇医药 诱导率(%)
2，4-D
0.5
50
48
96.0
1.0
48
47
97.9
2.0
50
49
, 百拇医药 98.0
NAA
0.5
49
25
51.0
1.0
50
26
52.0
2.0
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53.2
, 百拇医药
从表1可以看出，2，4-D和NAA的浓度对愈伤组织形成影响不大，但不同生长素诱导结果相差明显。2，4-D比NAA更有利于愈伤组织的形成，诱导率高得多，这与孙臖结果是一致的[2]。观察愈伤组织的颜色和性状也有明显差异，在含有2，4-D培养基上的愈伤组织颜色比较新鲜，块大、松软，而在NAA培养基上的愈伤组织块小，褐色，较硬。所以，以后的研究选用在添加2，4-D的培养基上的愈伤组织为实验材料。
2.2 愈伤组织的继代培养：35 d时，将愈伤组织剥离下来接种于含有1 mg/L KT、2 mg/L 2，4-D的培养基上。几天后，愈伤组织迅速变褐，后来无论是改变激素浓度及配比，还是采取频繁继代等措施，褐色现象均无多大变化，组织块硬，生长速率极为缓慢。大约1 a以后，愈伤组织长出新鲜松软的白色细胞团，生长速度变快。第4次继代培养的愈伤组织与1 a后的相比较，见图1。
, 百拇医药
A-为愈伤组织发生后第4代30 d时生长情况，黑褐色生长缓慢 B-愈伤组织生长1 a后培养30 d时情况。组织块松软，长出新鲜白色细胞
图1 南方红豆杉愈伤组织发生后的性状
有许多报道称，红豆杉愈伤组织发生后，要经历较长时间的继代培养，生长速率才能有所提高，有的竟长达2 a时间之久[3]。南方红豆杉愈伤组织也有这种特性。
2.3 水解酪蛋白(CA)对愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响：愈伤组织在含不同浓度CA的B5培养基(含1 mg/L KT、2 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L GA3)上生长30 d后收获，称鲜重，提取紫杉醇并测定含量，结果如图2。
, 百拇医药 图2 CA对南方红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响
在其它红豆杉愈伤组织的培养中，关于CA的作用既有对愈伤组织生长和紫杉醇含量无显著影响的报道[4]，也有能促进生物产量而不影响紫杉醇含量的报道。但对于南方红豆杉愈伤组织的影响尚未见报道。本实验结果表明，一定浓度(0.1%，0.5%)的CA能促进南方红豆杉愈伤组织的生长，最适浓度为0.5%，生长率达7.34%，是对照的1.6倍，但不利于紫杉醇积累，紫杉醇含量仅为对照的1/3。当CA浓度为0.1%时既能促进愈伤组织的生长(为对照的1.4倍)，又不影响紫杉醇的含量(略高于对照)。所以，该浓度是南方红豆杉愈伤组织培养的最适浓度。
2.4 苯丙氨酸(Phe)和乙酸钠对愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响：将愈伤组织培养在添加不同浓度的Phe和乙酸钠的B5培养基上(其它成分同前)，30 d收获。其生长率及紫杉醇含量如图3，4所示。
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图3 不同浓度Phe对不同愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响
图4 不同浓度乙酸钠对愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响
结果表明，Phe在0～1.0 mmol/L时，愈伤组织生长速率变化不大，但是明显影响紫杉醇的含量。其中，1.0 mmol/L Phe效果最好，与对照相比，紫杉醇含量提高了近3倍。Phe浓度继续升高，反而对生长及紫杉醇的积累产生不利影响。
培养基中添加0.1～0.5 mmol/L的乙酸钠有利于愈伤组织生长和紫杉醇产量的提高。其中0.5 mmol/L时效果较好，使愈伤组织中紫杉醇的含量增加了2倍多。浓度过高不利于愈伤组织的生长，培养后很快变黑、衰老甚至死亡。
Strobe等[5](1982)通过饲喂短叶红豆杉无菌树皮小块，证明苯丙氨酸、亮氨酸和乙酸钠都是紫杉醇的前体，其中乙酸钠不仅掺入到乙酰基，而且还能掺入到苯环和紫杉烷的骨架中。Zamir等[6](1992)也用放射性同位素标记的前体进行饲喂实验，结果表明，侧链乙酰基来自乙酸，而C13位酯基侧链中的Phe CHCH(OH)COO-则来自苯丙氨酸。在其他红豆杉细胞培养中，有些报道[7]证明这些前体都能掺入到紫杉烷中。但也有一些种类红豆杉愈伤组织不能利用乙酸盐作为前体。本实验结果表明，南方红豆杉愈伤组织均能利用一定浓度的苯丙氨酸和乙酸钠来合成紫杉醇而不降低生物量。■
, 百拇医药
参考文献
1，Fett-Neto A G， et al. Plant Medica, 1992, 58:461
2，孙 臖，等.中草药，1997，28(增刊)：7
3，Wickremesinhe ERM, et al. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 1993，38：181
4，Fett-Neto A G， et al. Bio/Technology, 1993, 11:731
5，Strobel G A, et al. Plant Science, 1992, 84:65
6，Zamir L O, et al. Tetrahedron Lett, 1992，33(36)：5235
7，Fett-Neto A G， et al. Biotechnol/Bioengineer, 1994, 44:966
(1999-08-13 收稿), http://www.100md.com