几种阿魏酸衍生物高分子药物对血小板聚集和血栓素B2、6-酮-前列腺素Fia 产生的影响
作者：杨俊旺 李天赐 单春文 林继红 梁永录 肖丽英
单位：杨俊旺(解放军兰州医学高等专科学校药理学教研室，甘肃 兰州 730020)；李天赐(兰州医学院药化教研室，甘肃 兰州730000)；单春文(第一军医大学 药理教研室，广东 广州 510515)；林继红(第一军医大学 实验动物教研室，广东 广州 510515)；梁永录(解放军兰州医学高等专科学校药理学教研室，甘肃 兰州 730020)
关键词：血栓素B2；6-酮-前列腺素Fla ；血小板聚集；比浊法；放射免疫测定法
第一军医大学学报000206 摘要：目的 通过测定兔血小板聚集和血栓素B2 (TXB2) 、6-酮-前列腺素FIa (6-keto-PGFla ) 的含量，比较观察阿魏酸(F)、吲哚美辛(I)、阿魏酸-吲哚美辛结合物(FI)和阿魏酸-吲哚美辛-淀粉高分子载体衍生物(FIS)在抗血栓方面的药理作用特点。方法 用比浊法和放免法测定F、I、FI和FIS在体外对兔血小板聚集和对TXB2，6-keto-PGFla 生成的影响。结果 F、I、FI和FIS显著地抑制ADP和AA诱导的兔血小板聚集和TXB2，6-keto-PGFla 的产生。在12.5～240 m mol/L的剂量范围内，对血小板聚集的抑制率，F为11.3%～31.8%(ADP诱导)和3.3%～18.5%(AA诱导)、I为3%～34.3%(ADP诱导)和 2%～20.2%(AA诱导)、FI为5.0%～59.3%(ADP诱导)和0.3%～63.1%(AA诱导)、FIS为3.1%～39.1%(ADP诱导)和1.5%～39.6%(AA诱导)。剂量为240.0 m mol/L时对TXB2和6-keto-PGFla 产生的抑制率，F为14.8%和1.2%、I为24.9%和26.2%、FI为40.6%和29.3%、FIS为28.7%和21.4%。6-keto-PGFla 与TXB2的比值，对照组为2.0，F组为2.4、I为2.0、FI为2.4、FIS为2.2。结论 在等物质的量浓度下，FI、FIS对AA诱导的兔血小板聚集及其对TXB2和6-keto-PGFla 释放的抑制作用显著强于阿魏酸和吲哚美辛本身，且能使6-keto-PGFla 与TXB2的比值增加。
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中图分类号：R973.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0152-03
Influences of ferulate acid, indomethacin, indomethacinum-ferulate acid and imdometha-cinum-ferulate acid-starch on rabbit platelet aggregation and production of thromboxan B2 and 6-keto-prostaglandin Fla in vitroYANG Jun-wang，LIANG Yong-lu，XIAO Li-ying
(Department of Pharmacology, Lanzhou Military Medical Academy)
, 百拇医药
LI Tian-ci
(Department of pharmacochemistry, Lanzhou Medical College, Lanzhou 730000, China)
SHAN Chun-wen
(Department of Pharmacology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
LIN Ji-hong
(Experimental Animal Center, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: objective To investigate the effect of indomethacinum-ferulate acid (FI) and indomethacinum-ferulate acid-starch (FIS) on rabbit platelet aggregation induced by ADP and AA and on the production of thromboxane B2 (TXB2) and 6-keto-prostaglandin Fla (6-keto-PGFla ). Methods Turbimetry and radioimmunoassay were employed to measure in vitro the platelet aggregation and the content of TXB2, 6-keto-PGFla production in rabbit blood treated with ferulate acid (F), indomethacin (I), FI and FIS respectively. Results It was shown that F, I, FI and FIS significantly inhibited ADP-induced rabbit platelet aggregation and the production of TXB2 and 6-keto-PGFla . With the dosage of 12.5 to 240.0 m mol/L, the inhibition rate (%) of platelet aggregation by F was 11.3%–31.8% (ADP-induced) and 3.3%–18.5%(AA-induced), that by I was 5.3%–34.3% (ADP-induced) and 6.2%–20.2% (AA-induced), that by FI was 25.0%–59.3% (ADP-induced) and 30.3%–63.1% (AA-induced), and that by FIS was 13.0%–39.1% (ADP-induced) and 11.5%–39.6%(AA-induced). With the dosage of 240.0 m mol/L, the inhibition rates of TXB2 and 6-keto-PGFla production by F was 14.8% and 1.2%, that by I was 24.9% and 26.4%, that by FI was 40.6% and 29.3%, and that by FIS was 28.7% and 21.4%. The ratio of 6-keto-PGFla to TXB2 was 2.0 (control group), 2.4 (F), 2.0 (I), 2.4 (FI) and 2.2 (FIS).
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–31.8% (ADP-induced) and 3.3%–18.5%(AA-induced), that by I was 5.3%–34.3% (ADP-induced) and 6.2%–20.2% (AA-induced), that by FI was 25.0%–59.3% (ADP-induced) and 30.3%–63.1% (AA-induced), and that by FIS was 13.0%–39.1% (ADP-induced) and 11.5%–39.6%(AA-induced). With the dosage of 240.0 m mol/L, the inhibition rates of TXB2 and 6-keto-PGFla production by F was 14.8% and 1.2%, that by I was 24.9% and 26.4%, that by FI was 40.6% and 29.3%, and that by FIS was 28.7% and 21.4%. The ratio of 6-keto-PGFla to TXB2 was 2.0 (control group), 2.4 (F), 2.0 (I), 2.4 (FI) and 2.2 (FIS).
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Key words: adenosine diphosphate arachidonic acid; platelet aggregation; thromboxane B2; 6-keto-prostaglandin Fla ; radioimmunoassay; turbidimetry.
吲哚美辛为非甾体类抗炎药物，具有镇痛、消炎、抗风湿等作用，近来研究发现该药可影响花生四烯酸(AA)的代谢过程，并通过抑制环内氧化酶使TXB2的生成减少，对ADP、AA诱导的血小板聚集有抑制作用 [1～3] 。阿魏酸是中药当归中活血化瘀、抑制血小板聚集[2]的典型有效活性成分，近年来被广泛研究。李天赐等在原阿魏酸(F)和吲哚美辛(I)的结构基础上，合成了阿魏酸-吲哚美辛结合物(FI)和阿魏酸-吲哚美辛-淀粉高分子载体衍生物(FIS)，初步实验发现FIS溶解度已经增大，体外模拟试验也发现它们具有缓释作用，其药理活性正在研究中。我们的目的是测定FI和FIS对ADP，AA诱导的血小板聚集和对血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素FIa (6-keto-PGFla )生成的影响。
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1 材料和方法
1.1材料
FI，白色粉末，Mr为533.5； FIS，白色粉末，由兰州医学院药化教研室合成并提供；I为白色结晶，Mr为 356.0，江苏太仓县制药厂生产；阿魏酸Mr 为194.0，上海试剂一厂产品，白色针状结晶；ADP为Sigma公司产品； AA为Fluka公司产品；TXB2、放免药盒由解放军总医院东亚放免研究所提供，兔由中山医科大学动物所提供，SPA-4多功能血小板聚集仪为上海科达测试仪器厂生产。
1.2方法
1.2.1血小板聚集实验 取新西兰兔，体质量(2.2±0.5) kg，雌雄不拘，心脏取血，3.8%的枸橼酸钠抗凝，制备富含血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。以PPP调整PRP，使PRP的血小板数为(95～120)×109/L。将调整好血小板数的PRP加入比浊管内，每管400 m l，第1管为药物溶剂做对照组，第2～4管为药物组，每管加药液10 m l，使I、F、FI、FIS终浓度分别为12.5、60.5、 240 m mol/L；每管温育2 min后，加入ADP(2.0 m mol/L)和AA(33.3 m mol/L)，描记5 min的血小板聚集曲线，实验数据均以
±s表示，组间比较采用t检验。
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1.2.2 TXB2和6-keto-PGFla 的测定[5、6] 按常规法制备PRP，再以560×g离心12 min，弃上清液，沉淀的血小板用含EDTA 0.1 mmol/L 的无钙改良台氏HEPES液(pH7.4)洗2次，最后用含CaCl2 1.3 mmol/L及0.25%牛血清白蛋白的改良台氏HEPES液制成血小板悬浮液，调血小板数为5×1012/L ，待用。用放免法[1、7～9]测定，取5支比浊管，每管取洗涤血小板悬液0.5 ml，第一管加入10 m l药物溶剂，第2～5管分别加入药物F、I、FI和FIS 10 m l，终浓度为240.0 m mol/L，37℃振荡温育20 min，再加入AA 30 m mol/L 5 m l，5 min后加入10%甲酸(pH3.5)，迅速置冰浴中终止反应。反应后的血小板悬液用4倍体积的乙酸乙酯提取2次，收取有机相，N2吹干，- 30℃保存，测定时用PBS复溶后按说明书操作，在LS9800液体计数器上测定TXB2和6-keto-PGFla 的cpm。以TXB2和6-keto-PGFla 标准曲线算出样品中TXB2和6-keto-PGFla 的含量(ng/ml)。实验数据均以±s表示，以t检验检测组间的差异。
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2 结果
2.1 药物对血小板聚集的影响
在ADP诱导组，F、I、FI和FIS均显著抑制血小板聚集，在12.5、60.5和240.0 m mol/L 3种浓度中，F对血小板聚集的抑制率为11.3%、30.9%和31.8%；I的抑制率为5.4%、17.1%和34.3%；FI的抑制率为25.0%、43.6%和59.3%；FIS的抑制率为13.1%、25.5%和39.1%。在AA诱导组的上述3种浓度中， F的抑制率为3.3%、15.0%和18.5%；I的抑制率为6.2%、16.5%和20.0%，FI为30.0%，54.1%和63.1%；FIS为11.5%、24.2%和39.6%。与等剂量的F和I相比，无论ADP还是AA诱导组， FI对血小板聚集的抑制作用显著增强 (P<0.001) 。而FIS和F、I之间无显著差异性 (P>0.05) (表1)。
表1 F、I、FI和FIS对ADP、AA诱导的兔血小板聚集的影响(±s)
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Tab.l Influence of F, I, FI and FIS on rabbit platelet aggregation induced by ADP and AA in vitro (Mean±SD) Drug (m mol/1)
Curve of platelet aggregation(mm) Inhibition rate (%)
ADP
AA
ADP
AA
F
Control
49.8± 11.5
, 百拇医药
62.3± 8.9
12.5
45.3± 9.6* *
69.4± 10.2* *
11.3
3.3
60.0
37.5± 11.2* *
53.0± 13.4* *
30.9
15.0
240.0
, 百拇医药
33.2± 8.6* *
50.8± 10.0* *
31.8
18.5
I
Control
51.0± 4.7
80.2± 4.6
12.5
48.9± 4.8*
75.1± 6.3*
5.3
, 百拇医药
6.2
60.0
44.0± 6.2* *
67.0± 5.0* *
17.1
16.5
240.0
37.2± 7.0* *
64.0± 5.5* *
34.3
20.2
FI
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Control
44.0± 9.9
72.7± 7.8
12.5
35.5± 11.5* *
62.0± 9.3* *
25.0
30.0
60.0
29.2± 10.3* *
47.2± 12.8* *
43.6
, 百拇医药
54.1
240.0
23.8± 8.6* *
22.8± 10.2* *
59.3
63.1
FIS
Control
40.5± 10.1
90.2± 11.2
12.5
49.2± 13.1* *
, 百拇医药
78.8± 15.8* *
13.1
11.5
60.0
40.2± 12.2* *
68.3± 11.2* *
25.5
24.2
240.0
34.7± 9.3* *
54.5± 10.9* *
39.1
, 百拇医药
39.6
n=6; * P >0.05 vs control, * * P<0.001 vs control=6; * P >0.05 vs control, * * P<0.001 vs control
2.2 药物对TXB2和6-keto-PGFla 生成的影响
240.0 m mol/L的 F、I、FI和FIS显著地抑制AA诱导的TXB2和6-keto-PGFla 的产生，其抑制率依次为14.8%、24.9%、40.6%和28.7%； 对6-keto-PGFla 的抑制率为1.2%、26.2%、29.3%和21.4%。6-keto-PGFla 与TXB2的比值，对照组为2.0，药物组分别为2.4、2.0、2.4和2.2，F、FI和FIS比对照组高些，I与对照组相同(表2)。
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表2 F、I、FI和FIS对FAA诱导的兔血小板生成TXB2 6-keto-PGFla 的影响(±s)
Tab.2 Imfluences of F, I, FI and FIS on the content of TXB2 6-keto-PGF1a in rabbit platelets in virto (Mean±SD) Drug
TXB2 (ng/ml)
Inhibition rate (%)
6-keto-PGF1a (ng/ml)
, 百拇医药
Inhibition rate (%)
6-keto- PGF1a /TXB2
control
82.1± 12.8
167.2± 6.4
2.0
F
70.0± 9.3**
14.8
165.2± 6.9*
1.2
, 百拇医药
2.4
I
61.7± 9.6**
24.9
123.4± 15* *
26.2
2.0
FI
48.8± 5.4**
40.6
118.2± 6.6* *
29.3
, 百拇医药 2.4
FIS
58.5± 13.8**
28.7
131.4± 8.1* *
21.4
2.2
n=6; * P >0.05 vs control, * * P<0.001 vs control; the concentration of the drug is 240.0 m mol/L=6; * P >0.05 vs control, * * P<0.001 vs control; the concentration of the drug is 240.0 m mol/L
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3 讨论
本实验的结果显示了药物明显的量效关系。与阳性对照药F、I比较，FI抑制血小板聚集作用最强，FIS与F、I作用相似。虽然4种药物均抑制6-keto-PGFla 和 TXB2的产生，但与对照组比较，6-keto-PGFla 和 TXB2 的比值增加的较少，F和FI组分别增加0.4、0.2，而I与对照组相等。在F、I、FI和FIS 4种药物中，FI和F此值增加的稍多，提示FI和FIS对血小板聚集抑制作用的机制是抑制血小板内的环氧酶，在240 m mol/L剂量下，它们对TXB2和6-keto-PGFla 产生的抑制作用有明显的选择性，但也不排除存在着其它作用机制的可能。
李天赐等使I的羧基的阿魏酸上的羟基脱水而合成了FI，并进一步使FI与可溶性大分子淀粉连结，生成FIS。兰州医学院药化教研室研究发现FIS的溶解度增大，体外溶出实验发现两种化合物有缓释作用。FIS溶解度增大会增加吸收度，并可做成液体剂型，而其缓释作用可减少对胃的刺激性。FIS分子中因淀粉分子量较大，F和I占的比例较少，这可能是其作用无明显增加的原因。
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总之，FI和FIS的药理、理化特性较之F和I具有一定的优越性，它们是两种有发展前途的新型抗血栓药物。
致谢：完成本课题过程中第一军医大学吴曙光教授给予大力的帮助，在此表示衷心感谢。
作者简介：杨俊旺(1965-)，男，甘肃天水人，1988年毕业于兰州医学院，本科，现攻读硕士学位，副教授，中国药理学会教育及科普专业委员会委员，电话：0931-8972163
作者单位：肖丽英(解放军兰州医学高等专科学校药理学教研室，甘肃 兰州 730020)
参考文献
1，单春文, 杨素琴, 何菡萏等. 3, 4, 5 一三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷在体外对兔血小板聚集和产生血栓素B2的影响[J]. 中国药理学报, 1990, 11(6):527～30.
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2，徐理纳, 王润玲, 徐德成. 阿魏酸钠和阿斯匹林联用对大鼠血小板聚集的影响及对PGI2 –TXA2平衡的调节[J]. 药学学报, 1985, 20 (1):5～9.
3，唐冀雪, 史以庆. 药生四烯酸代谢物. 炎症及抗炎药. 见: 金荫昌主编. 分子药理学[M], 天津: 天津科学技术出版社.
4，Bcm GVR. Aggeration of blood platelet by adenosine diphosphate and its reversal[J]. Nature.1962, 194(4832):927～9.
5，杨俊旺, 梁永录, 李文广等. 吡啶1, 6(TH，3H)二酮生物碱对ADP, CoI诱导的兔血小板聚集的影响[J].中国药理学通报, 1998, 14 (1):24～6.
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6，Shan CW, Yang JW, Yang SQ. Blockage of clonidine-induced platelet aggregation in rabbits by procainamide [J]. Chun Kuo Yao Li Hsueh Pao, 1993, 14(2):127～9.
7，李振甲, 杨梅芳, 郝秀华等. 血浆血栓素B2放射免疫分析法[J]. 解放军医学杂志, 1985, 10 (1) :35～8.
8，陈新生, 龙 昆, 岳天立等. 羧基氧乙基咪唑对大鼠中粒细胞和血小板释放6-keto-PGFla 和 TXB2的选择性影响[J]. 第二军医大学学报, 1989, 10 (4): 328～32.
9，吴勇杰, 延自强, 李新芳等. 苦豆碱对兔血小板聚集的影响[J]. 中国药理学通报, 1993, 9 (2) :138～9.
收稿日期：1999-06-26, 百拇医药
单位：杨俊旺(解放军兰州医学高等专科学校药理学教研室，甘肃 兰州 730020)；李天赐(兰州医学院药化教研室，甘肃 兰州730000)；单春文(第一军医大学 药理教研室，广东 广州 510515)；林继红(第一军医大学 实验动物教研室，广东 广州 510515)；梁永录(解放军兰州医学高等专科学校药理学教研室，甘肃 兰州 730020)
关键词：血栓素B2；6-酮-前列腺素Fla ；血小板聚集；比浊法；放射免疫测定法
第一军医大学学报000206 摘要：目的 通过测定兔血小板聚集和血栓素B2 (TXB2) 、6-酮-前列腺素FIa (6-keto-PGFla ) 的含量，比较观察阿魏酸(F)、吲哚美辛(I)、阿魏酸-吲哚美辛结合物(FI)和阿魏酸-吲哚美辛-淀粉高分子载体衍生物(FIS)在抗血栓方面的药理作用特点。方法 用比浊法和放免法测定F、I、FI和FIS在体外对兔血小板聚集和对TXB2，6-keto-PGFla 生成的影响。结果 F、I、FI和FIS显著地抑制ADP和AA诱导的兔血小板聚集和TXB2，6-keto-PGFla 的产生。在12.5～240 m mol/L的剂量范围内，对血小板聚集的抑制率，F为11.3%～31.8%(ADP诱导)和3.3%～18.5%(AA诱导)、I为3%～34.3%(ADP诱导)和 2%～20.2%(AA诱导)、FI为5.0%～59.3%(ADP诱导)和0.3%～63.1%(AA诱导)、FIS为3.1%～39.1%(ADP诱导)和1.5%～39.6%(AA诱导)。剂量为240.0 m mol/L时对TXB2和6-keto-PGFla 产生的抑制率，F为14.8%和1.2%、I为24.9%和26.2%、FI为40.6%和29.3%、FIS为28.7%和21.4%。6-keto-PGFla 与TXB2的比值，对照组为2.0，F组为2.4、I为2.0、FI为2.4、FIS为2.2。结论 在等物质的量浓度下，FI、FIS对AA诱导的兔血小板聚集及其对TXB2和6-keto-PGFla 释放的抑制作用显著强于阿魏酸和吲哚美辛本身，且能使6-keto-PGFla 与TXB2的比值增加。
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中图分类号：R973.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0152-03
Influences of ferulate acid, indomethacin, indomethacinum-ferulate acid and imdometha-cinum-ferulate acid-starch on rabbit platelet aggregation and production of thromboxan B2 and 6-keto-prostaglandin Fla in vitroYANG Jun-wang，LIANG Yong-lu，XIAO Li-ying
(Department of Pharmacology, Lanzhou Military Medical Academy)
, 百拇医药
LI Tian-ci
(Department of pharmacochemistry, Lanzhou Medical College, Lanzhou 730000, China)
SHAN Chun-wen
(Department of Pharmacology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
LIN Ji-hong
(Experimental Animal Center, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: objective To investigate the effect of indomethacinum-ferulate acid (FI) and indomethacinum-ferulate acid-starch (FIS) on rabbit platelet aggregation induced by ADP and AA and on the production of thromboxane B2 (TXB2) and 6-keto-prostaglandin Fla (6-keto-PGFla ). Methods Turbimetry and radioimmunoassay were employed to measure in vitro the platelet aggregation and the content of TXB2, 6-keto-PGFla production in rabbit blood treated with ferulate acid (F), indomethacin (I), FI and FIS respectively. Results It was shown that F, I, FI and FIS significantly inhibited ADP-induced rabbit platelet aggregation and the production of TXB2 and 6-keto-PGFla . With the dosage of 12.5 to 240.0 m mol/L, the inhibition rate (%) of platelet aggregation by F was 11.3%–31.8% (ADP-induced) and 3.3%–18.5%(AA-induced), that by I was 5.3%–34.3% (ADP-induced) and 6.2%–20.2% (AA-induced), that by FI was 25.0%–59.3% (ADP-induced) and 30.3%–63.1% (AA-induced), and that by FIS was 13.0%–39.1% (ADP-induced) and 11.5%–39.6%(AA-induced). With the dosage of 240.0 m mol/L, the inhibition rates of TXB2 and 6-keto-PGFla production by F was 14.8% and 1.2%, that by I was 24.9% and 26.4%, that by FI was 40.6% and 29.3%, and that by FIS was 28.7% and 21.4%. The ratio of 6-keto-PGFla to TXB2 was 2.0 (control group), 2.4 (F), 2.0 (I), 2.4 (FI) and 2.2 (FIS).
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–31.8% (ADP-induced) and 3.3%–18.5%(AA-induced), that by I was 5.3%–34.3% (ADP-induced) and 6.2%–20.2% (AA-induced), that by FI was 25.0%–59.3% (ADP-induced) and 30.3%–63.1% (AA-induced), and that by FIS was 13.0%–39.1% (ADP-induced) and 11.5%–39.6%(AA-induced). With the dosage of 240.0 m mol/L, the inhibition rates of TXB2 and 6-keto-PGFla production by F was 14.8% and 1.2%, that by I was 24.9% and 26.4%, that by FI was 40.6% and 29.3%, and that by FIS was 28.7% and 21.4%. The ratio of 6-keto-PGFla to TXB2 was 2.0 (control group), 2.4 (F), 2.0 (I), 2.4 (FI) and 2.2 (FIS).
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Key words: adenosine diphosphate arachidonic acid; platelet aggregation; thromboxane B2; 6-keto-prostaglandin Fla ; radioimmunoassay; turbidimetry.
吲哚美辛为非甾体类抗炎药物，具有镇痛、消炎、抗风湿等作用，近来研究发现该药可影响花生四烯酸(AA)的代谢过程，并通过抑制环内氧化酶使TXB2的生成减少，对ADP、AA诱导的血小板聚集有抑制作用 [1～3] 。阿魏酸是中药当归中活血化瘀、抑制血小板聚集[2]的典型有效活性成分，近年来被广泛研究。李天赐等在原阿魏酸(F)和吲哚美辛(I)的结构基础上，合成了阿魏酸-吲哚美辛结合物(FI)和阿魏酸-吲哚美辛-淀粉高分子载体衍生物(FIS)，初步实验发现FIS溶解度已经增大，体外模拟试验也发现它们具有缓释作用，其药理活性正在研究中。我们的目的是测定FI和FIS对ADP，AA诱导的血小板聚集和对血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素FIa (6-keto-PGFla )生成的影响。
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1 材料和方法
1.1材料
FI，白色粉末，Mr为533.5； FIS，白色粉末，由兰州医学院药化教研室合成并提供；I为白色结晶，Mr为 356.0，江苏太仓县制药厂生产；阿魏酸Mr 为194.0，上海试剂一厂产品，白色针状结晶；ADP为Sigma公司产品； AA为Fluka公司产品；TXB2、放免药盒由解放军总医院东亚放免研究所提供，兔由中山医科大学动物所提供，SPA-4多功能血小板聚集仪为上海科达测试仪器厂生产。
1.2方法
1.2.1血小板聚集实验 取新西兰兔，体质量(2.2±0.5) kg，雌雄不拘，心脏取血，3.8%的枸橼酸钠抗凝，制备富含血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。以PPP调整PRP，使PRP的血小板数为(95～120)×109/L。将调整好血小板数的PRP加入比浊管内，每管400 m l，第1管为药物溶剂做对照组，第2～4管为药物组，每管加药液10 m l，使I、F、FI、FIS终浓度分别为12.5、60.5、 240 m mol/L；每管温育2 min后，加入ADP(2.0 m mol/L)和AA(33.3 m mol/L)，描记5 min的血小板聚集曲线，实验数据均以
±s表示，组间比较采用t检验。, http://www.100md.com
1.2.2 TXB2和6-keto-PGFla 的测定[5、6] 按常规法制备PRP，再以560×g离心12 min，弃上清液，沉淀的血小板用含EDTA 0.1 mmol/L 的无钙改良台氏HEPES液(pH7.4)洗2次，最后用含CaCl2 1.3 mmol/L及0.25%牛血清白蛋白的改良台氏HEPES液制成血小板悬浮液，调血小板数为5×1012/L ，待用。用放免法[1、7～9]测定，取5支比浊管，每管取洗涤血小板悬液0.5 ml，第一管加入10 m l药物溶剂，第2～5管分别加入药物F、I、FI和FIS 10 m l，终浓度为240.0 m mol/L，37℃振荡温育20 min，再加入AA 30 m mol/L 5 m l，5 min后加入10%甲酸(pH3.5)，迅速置冰浴中终止反应。反应后的血小板悬液用4倍体积的乙酸乙酯提取2次，收取有机相，N2吹干，- 30℃保存，测定时用PBS复溶后按说明书操作，在LS9800液体计数器上测定TXB2和6-keto-PGFla 的cpm。以TXB2和6-keto-PGFla 标准曲线算出样品中TXB2和6-keto-PGFla 的含量(ng/ml)。实验数据均以
±s表示，以t检验检测组间的差异。, 百拇医药
2 结果
2.1 药物对血小板聚集的影响
在ADP诱导组，F、I、FI和FIS均显著抑制血小板聚集，在12.5、60.5和240.0 m mol/L 3种浓度中，F对血小板聚集的抑制率为11.3%、30.9%和31.8%；I的抑制率为5.4%、17.1%和34.3%；FI的抑制率为25.0%、43.6%和59.3%；FIS的抑制率为13.1%、25.5%和39.1%。在AA诱导组的上述3种浓度中， F的抑制率为3.3%、15.0%和18.5%；I的抑制率为6.2%、16.5%和20.0%，FI为30.0%，54.1%和63.1%；FIS为11.5%、24.2%和39.6%。与等剂量的F和I相比，无论ADP还是AA诱导组， FI对血小板聚集的抑制作用显著增强 (P<0.001) 。而FIS和F、I之间无显著差异性 (P>0.05) (表1)。
表1 F、I、FI和FIS对ADP、AA诱导的兔血小板聚集的影响(
±s), http://www.100md.com
Tab.l Influence of F, I, FI and FIS on rabbit platelet aggregation induced by ADP and AA in vitro (Mean±SD) Drug (m mol/1)
Curve of platelet aggregation(mm) Inhibition rate (%)
ADP
AA
ADP
AA
F
Control
49.8± 11.5
, 百拇医药
62.3± 8.9
12.5
45.3± 9.6* *
69.4± 10.2* *
11.3
3.3
60.0
37.5± 11.2* *
53.0± 13.4* *
30.9
15.0
240.0
, 百拇医药
33.2± 8.6* *
50.8± 10.0* *
31.8
18.5
I
Control
51.0± 4.7
80.2± 4.6
12.5
48.9± 4.8*
75.1± 6.3*
5.3
, 百拇医药
6.2
60.0
44.0± 6.2* *
67.0± 5.0* *
17.1
16.5
240.0
37.2± 7.0* *
64.0± 5.5* *
34.3
20.2
FI
, http://www.100md.com
Control
44.0± 9.9
72.7± 7.8
12.5
35.5± 11.5* *
62.0± 9.3* *
25.0
30.0
60.0
29.2± 10.3* *
47.2± 12.8* *
43.6
, 百拇医药
54.1
240.0
23.8± 8.6* *
22.8± 10.2* *
59.3
63.1
FIS
Control
40.5± 10.1
90.2± 11.2
12.5
49.2± 13.1* *
, 百拇医药
78.8± 15.8* *
13.1
11.5
60.0
40.2± 12.2* *
68.3± 11.2* *
25.5
24.2
240.0
34.7± 9.3* *
54.5± 10.9* *
39.1
, 百拇医药
39.6
n=6; * P >0.05 vs control, * * P<0.001 vs control=6; * P >0.05 vs control, * * P<0.001 vs control
2.2 药物对TXB2和6-keto-PGFla 生成的影响
240.0 m mol/L的 F、I、FI和FIS显著地抑制AA诱导的TXB2和6-keto-PGFla 的产生，其抑制率依次为14.8%、24.9%、40.6%和28.7%； 对6-keto-PGFla 的抑制率为1.2%、26.2%、29.3%和21.4%。6-keto-PGFla 与TXB2的比值，对照组为2.0，药物组分别为2.4、2.0、2.4和2.2，F、FI和FIS比对照组高些，I与对照组相同(表2)。
, 百拇医药
表2 F、I、FI和FIS对FAA诱导的兔血小板生成TXB2 6-keto-PGFla 的影响(
±s)Tab.2 Imfluences of F, I, FI and FIS on the content of TXB2 6-keto-PGF1a in rabbit platelets in virto (Mean±SD) Drug
TXB2 (ng/ml)
Inhibition rate (%)
6-keto-PGF1a (ng/ml)
, 百拇医药
Inhibition rate (%)
6-keto- PGF1a /TXB2
control
82.1± 12.8
167.2± 6.4
2.0
F
70.0± 9.3**
14.8
165.2± 6.9*
1.2
, 百拇医药
2.4
I
61.7± 9.6**
24.9
123.4± 15* *
26.2
2.0
FI
48.8± 5.4**
40.6
118.2± 6.6* *
29.3
, 百拇医药 2.4
FIS
58.5± 13.8**
28.7
131.4± 8.1* *
21.4
2.2
n=6; * P >0.05 vs control, * * P<0.001 vs control; the concentration of the drug is 240.0 m mol/L=6; * P >0.05 vs control, * * P<0.001 vs control; the concentration of the drug is 240.0 m mol/L
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3 讨论
本实验的结果显示了药物明显的量效关系。与阳性对照药F、I比较，FI抑制血小板聚集作用最强，FIS与F、I作用相似。虽然4种药物均抑制6-keto-PGFla 和 TXB2的产生，但与对照组比较，6-keto-PGFla 和 TXB2 的比值增加的较少，F和FI组分别增加0.4、0.2，而I与对照组相等。在F、I、FI和FIS 4种药物中，FI和F此值增加的稍多，提示FI和FIS对血小板聚集抑制作用的机制是抑制血小板内的环氧酶，在240 m mol/L剂量下，它们对TXB2和6-keto-PGFla 产生的抑制作用有明显的选择性，但也不排除存在着其它作用机制的可能。
李天赐等使I的羧基的阿魏酸上的羟基脱水而合成了FI，并进一步使FI与可溶性大分子淀粉连结，生成FIS。兰州医学院药化教研室研究发现FIS的溶解度增大，体外溶出实验发现两种化合物有缓释作用。FIS溶解度增大会增加吸收度，并可做成液体剂型，而其缓释作用可减少对胃的刺激性。FIS分子中因淀粉分子量较大，F和I占的比例较少，这可能是其作用无明显增加的原因。
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总之，FI和FIS的药理、理化特性较之F和I具有一定的优越性，它们是两种有发展前途的新型抗血栓药物。
致谢：完成本课题过程中第一军医大学吴曙光教授给予大力的帮助，在此表示衷心感谢。
作者简介：杨俊旺(1965-)，男，甘肃天水人，1988年毕业于兰州医学院，本科，现攻读硕士学位，副教授，中国药理学会教育及科普专业委员会委员，电话：0931-8972163
作者单位：肖丽英(解放军兰州医学高等专科学校药理学教研室，甘肃 兰州 730020)
参考文献
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收稿日期：1999-06-26, 百拇医药