ATP敏感性钾电流与蛋白激酶关系的研究
作者：张延凤 招明高 赵德化 熊晓云 姚秀娟
单位：张延凤(第四军医大学分析与测试中心,西安710032)；招明高 赵德化 熊晓云 姚秀娟(第四军医大学基础部药理教研室,西安710032)
关键词：克罗卡林；ATP敏感性钾电流；蛋白激酶A；蛋白激酶C
中国临床药理学与治疗学000203
目的 观察蛋白激酶A(PKA)及蛋白激酶C(PKC)抑制剂和蛋白脱磷酸化物质对大鼠心室肌细胞ATP敏感性钾电流(IKATP)的影响，探讨克罗卡林(cromakalim)开放ATP敏感性钾通道的作用机制。方法 采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞IKATP。结果 在37 ℃时克罗卡林(1 μmol.L-1)可阻断ATP的抑制作用，诱导出IKATP。PKA抑制剂PKI(6～22)amide (1 μmol.L-1),可模拟克罗卡林的作用，激活IKATP；而PKC抑制剂calphostic C无此作用。同时还观察到蛋白脱磷酸化物质butanedioe monoxime (BDM,5 mmol.L-1)也可诱发出IKATP。结论 克罗卡林开放IKATP机制与抑制PKA的活性有关，而与PKC无关。
, 百拇医药
中图分类号 R966
Research of relationship between protein kinase
and ATP-sensitive potassium current
ZHAO Ming-Gao
(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
ZHAO De-Hua
(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
, 百拇医药
ZHANG Yan-Feng
(Analysis and Test Center, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
XIONG Xiao-Yun
(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
YAO Xiu-Juan
(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
, http://www.100md.com Aim To observe the effects of protein kinase A (PKA),protein kinase C(PKC) inhibitor and dephosphorylating agent on ATP-sensitive potassium current(IKATP) of rat ventricular cardiomyocytes and investigate the mechanism of cromakalim opening IKATP. Methods Whole-cell patch-clamp was used to record IKATP. Results Cromakalim (1 μmol.L-1) was shown to induce IKATP at the holding potential of -10 mV, 37 ℃. When added to the pipette solution, the PKA inhibitor PKI(6～22)amide (1 μmol.L-1) caused production of IKATP, just as cromakalim did, while the PKC inhibitor calphostic C(1 μmol.L-1) showed no effect. Moreover, addition of the dephosphorylating agent, butanedione monoxime (5 mmol.L-1),to the bath also stimulated IKATP. Conclusion The mechanism of cromakalim opening IKATP is due to the inhibition of PKA (not PKC).
, 百拇医药
Key words cromakalim; ATP-sensitire potassium current(IKATP); protein kinase A； protein kinase C
钾通道开放剂如克罗卡林和pinacidil，具有激活心肌和平滑肌等组织ATP敏感性钾通道的作用[1,2]，目前已用于治疗高血压和抗心肌缺血。现已知，ATP敏感性钾电流(IKATP)可被细胞内ATP所抑制，因而在生理条件下此通道不开放，但在缺血、代谢障碍及钾通道开放剂存在时，IKATP开放[3]。目前，IKATP开放机理仍不完全明了，但IKATP通道蛋白的磷酸化状态与通道开放具有十分密切的关系[4]。本实验采用全细胞膜片钳技术，观察PKA抑制剂PKI(6～22)amide、PKC抑制剂calphostic C和化学性磷酸酶butanedione monoxime(BDM)对IKATP的影响，探讨IKATP与蛋白激酶之间的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 心室肌细胞制备 Sprague-Dawley大鼠，体重150～182 g，由第四军医大学实验动物中心提供(陕动字第003号),♀♂兼用。戊巴比妥钠30 mg.kg-1腹腔麻醉，迅速摘取心脏，Langendorff法离体心脏灌流。0.1%胶原酶(I型，Sigma)消化分离大鼠心室肌细胞[5]。
1.2 仪器及药品 膜片钳放大器(CEZ-2300,日本光电公司);电刺激器(SEN-7103, 日本光电公司)； 步脉冲发生器(8-8300,日本光电公司);示波器(CS- 8010,键伍公司);数字磁带记录仪(MR-10,TEAC公司)。PSS组成(mmol.L-1):NaCl 125, KCl 4.8, MgCl2 3.7, KH2PO4 1.2, HEPES 10, EGTA 1.0, glucose 11; NaOH调整 pH为7.3，100%O2饱和。电极液组成：NaCl 5, KCl 120, MgCl2 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 10, EGTA 1.2, glucose 11, sodium pyruvate 2; KOH 调整pH为7.3 。克罗卡林，glibenclamide 和calphostic C(Sigma)于实验前临时溶解于DMSO中。实验中PSS液以1 ml.min-1恒速灌流，克罗卡林终浓度为1 μmol.L-1，glibenclamide为1 μmol.L-1， BDM(Sigma)为5 mmol.L-1。电极液中PKI(6～22)amide(Sigma) 终浓度为1 μmol.L-1，calphostic C为1 μmol.L-1。温度控制于37 ℃。
, http://www.100md.com
1.3 实验方法 采用全细胞膜片钳记录心室肌细胞钾电流，以Ag-AgCl电极引导致膜片钳放大器，电极电阻4～5MΩ，钳制电压-10 mV , 刺激时程300 ms。实验电压分别为0 mV、+20 mV、+40 mV。结果记录于多道数字磁带记录仪，记忆示波器回放，各实验电压下诱发电流的峰值作为该电压下的电流值。
1.4 统计学处理 数据以
±s表示，采用t检验。
2 结果
实验分离的心室肌细胞有70%呈柱状，细胞边界与横纹清晰，静息电位-(72±10) mV。
2.1 蛋白激酶抑制剂对IKATP的影响 在37 ℃ 时，各实验电压下均可记录到一外向性电流，并可被glibenclamide抑制，此电流主要为IKATP。在同等实验条件下，在电极内液中加入PKA抑制剂PKI(6～22)amide(1 μmol.L-1)可诱发出IKATP(图1)。而PKC抑制剂calphostic C(1 μmol.L-1)未诱发出IKATP(图2)。
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图1 PKI(6～22)amide对大鼠心室肌IKATP的作用
钳制电压为-10 mV，实验电压分别为0，+20，+40 mV(n=4),与正常对照比较*P<0.01
图2 calphostic C对大鼠心室肌IKATP的作用
钳制电压为-10 mV，实验电压分别为0，+20，+40 mV(n=3),与正常对照比较*P<0.01
2.2 化学磷酸酶BDM的作用 在PSS液加入磷酸化酶，使蛋白质脱磷酸化的物质BDM(5 mmol·L-1)，亦可诱发出IKATP，电流稍小(图3)。
, http://www.100md.com
图3 BDM对大鼠心室肌IKATP的作用
钳制电压为-10 mV，实验电压分别为0，+20，+40 mV(n=4),与正常对照比较*P<0.01
3 讨论
通道的本质是蛋白质，因而多种修饰蛋白质的因素可以调节通道活性，例如pH，细胞内氧化还原状态，酶活性修饰以及阻断剂等。这些调节因素有的是对通道直接作用，有些则是通过改变细胞内信号传导而间接发挥作用。通道蛋白质磷酸化与脱磷酸化过程为通道调节的重要机制之一，如乙酰胆碱N型受体、GABA A受体、谷氨酸受体、钙通道、及氯通道等[4]。细胞内的第二信使如Ca2+、 cAMP、GTP等均可影响IKATP的开放。有报道认为[6]，IKATP通道蛋白三个位点上苏氨酸残基的磷酸化与否，决定该通道的功能状态。因此，蛋白激酶在KATP开放中可能具有重要的意义。
, 百拇医药
PKA抑制剂PKI(6～22)amide可模拟克罗卡林的作用，激活IKATP，PKC抑制剂calphostic C无此作用，因此PKC与IKATP开放过程无关。蛋白脱磷酸化物质BDM，也可诱发出IKATP，可见，通道蛋白脱磷酸化可导致IKATP开放。
结果提示，克罗卡林开放IKATP机制，可能与抑制PKA活性有关,而与PKC无关。
国家自然科学基金资助项目 №39500177
招明高，男，30岁，博士研究生，讲师。
赵德化，男，64岁，教授，博士生导师。
参考文献
, 百拇医药 1，Venkatesh N, Stuart JS, Lamp ST，et al. Activation of ATP-sensitive potassium channels by cromakalim: effects on cellular K+ loss and cardiac function in ischemic and reperfused mammalian ventricle. Circ Res, 1992;71:1324
2，Tarano M, Noma A. Selective modulation of the ATP-sensitive K+ channel by nicordil in guinea-pig cardiac cell membrane. Naunyn Schmiedeberg Arch Pharmacol, 1990; 342: 592
3，Birgitta H, Martin P, Pieter A. ATP-sensitive potassium channels in isolated rat aorta during physiologic, hypoxie, and low-glucose conditions. J Cardiovasc Pharmacol, 1997;29:130
, 百拇医药
4，Irwin B，Levitan J. Modulation of ion channels by protein phosphorylation and dephosphorylation.Annu Rev Physiol，1994;56:193
5，刘启营，陈维洲，魏丕敬，等.常咯啉对分离的成年豚鼠心室肌单细胞的电生理作用.中国药理学报, 1989;10:526
6，Xu ZC, Yang YH, Hebert C. Phosphorylation of the ATP-sensitive,inwardly rectifying K+channel,ROMK,by cyclic AMP-dependent protein kinase. J Bio Chem，1996;271:9313
2000-03-21 收稿, 百拇医药
单位：张延凤(第四军医大学分析与测试中心,西安710032)；招明高 赵德化 熊晓云 姚秀娟(第四军医大学基础部药理教研室,西安710032)
关键词：克罗卡林；ATP敏感性钾电流；蛋白激酶A；蛋白激酶C
中国临床药理学与治疗学000203
目的 观察蛋白激酶A(PKA)及蛋白激酶C(PKC)抑制剂和蛋白脱磷酸化物质对大鼠心室肌细胞ATP敏感性钾电流(IKATP)的影响，探讨克罗卡林(cromakalim)开放ATP敏感性钾通道的作用机制。方法 采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞IKATP。结果 在37 ℃时克罗卡林(1 μmol.L-1)可阻断ATP的抑制作用，诱导出IKATP。PKA抑制剂PKI(6～22)amide (1 μmol.L-1),可模拟克罗卡林的作用，激活IKATP；而PKC抑制剂calphostic C无此作用。同时还观察到蛋白脱磷酸化物质butanedioe monoxime (BDM,5 mmol.L-1)也可诱发出IKATP。结论 克罗卡林开放IKATP机制与抑制PKA的活性有关，而与PKC无关。
, 百拇医药
中图分类号 R966
Research of relationship between protein kinase
and ATP-sensitive potassium current
ZHAO Ming-Gao
(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
ZHAO De-Hua
(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
, 百拇医药
ZHANG Yan-Feng
(Analysis and Test Center, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
XIONG Xiao-Yun
(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
YAO Xiu-Juan
(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)
, http://www.100md.com Aim To observe the effects of protein kinase A (PKA),protein kinase C(PKC) inhibitor and dephosphorylating agent on ATP-sensitive potassium current(IKATP) of rat ventricular cardiomyocytes and investigate the mechanism of cromakalim opening IKATP. Methods Whole-cell patch-clamp was used to record IKATP. Results Cromakalim (1 μmol.L-1) was shown to induce IKATP at the holding potential of -10 mV, 37 ℃. When added to the pipette solution, the PKA inhibitor PKI(6～22)amide (1 μmol.L-1) caused production of IKATP, just as cromakalim did, while the PKC inhibitor calphostic C(1 μmol.L-1) showed no effect. Moreover, addition of the dephosphorylating agent, butanedione monoxime (5 mmol.L-1),to the bath also stimulated IKATP. Conclusion The mechanism of cromakalim opening IKATP is due to the inhibition of PKA (not PKC).
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Key words cromakalim; ATP-sensitire potassium current(IKATP); protein kinase A； protein kinase C
钾通道开放剂如克罗卡林和pinacidil，具有激活心肌和平滑肌等组织ATP敏感性钾通道的作用[1,2]，目前已用于治疗高血压和抗心肌缺血。现已知，ATP敏感性钾电流(IKATP)可被细胞内ATP所抑制，因而在生理条件下此通道不开放，但在缺血、代谢障碍及钾通道开放剂存在时，IKATP开放[3]。目前，IKATP开放机理仍不完全明了，但IKATP通道蛋白的磷酸化状态与通道开放具有十分密切的关系[4]。本实验采用全细胞膜片钳技术，观察PKA抑制剂PKI(6～22)amide、PKC抑制剂calphostic C和化学性磷酸酶butanedione monoxime(BDM)对IKATP的影响，探讨IKATP与蛋白激酶之间的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 心室肌细胞制备 Sprague-Dawley大鼠，体重150～182 g，由第四军医大学实验动物中心提供(陕动字第003号),♀♂兼用。戊巴比妥钠30 mg.kg-1腹腔麻醉，迅速摘取心脏，Langendorff法离体心脏灌流。0.1%胶原酶(I型，Sigma)消化分离大鼠心室肌细胞[5]。
1.2 仪器及药品 膜片钳放大器(CEZ-2300,日本光电公司);电刺激器(SEN-7103, 日本光电公司)； 步脉冲发生器(8-8300,日本光电公司);示波器(CS- 8010,键伍公司);数字磁带记录仪(MR-10,TEAC公司)。PSS组成(mmol.L-1):NaCl 125, KCl 4.8, MgCl2 3.7, KH2PO4 1.2, HEPES 10, EGTA 1.0, glucose 11; NaOH调整 pH为7.3，100%O2饱和。电极液组成：NaCl 5, KCl 120, MgCl2 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 10, EGTA 1.2, glucose 11, sodium pyruvate 2; KOH 调整pH为7.3 。克罗卡林，glibenclamide 和calphostic C(Sigma)于实验前临时溶解于DMSO中。实验中PSS液以1 ml.min-1恒速灌流，克罗卡林终浓度为1 μmol.L-1，glibenclamide为1 μmol.L-1， BDM(Sigma)为5 mmol.L-1。电极液中PKI(6～22)amide(Sigma) 终浓度为1 μmol.L-1，calphostic C为1 μmol.L-1。温度控制于37 ℃。
, http://www.100md.com
1.3 实验方法 采用全细胞膜片钳记录心室肌细胞钾电流，以Ag-AgCl电极引导致膜片钳放大器，电极电阻4～5MΩ，钳制电压-10 mV , 刺激时程300 ms。实验电压分别为0 mV、+20 mV、+40 mV。结果记录于多道数字磁带记录仪，记忆示波器回放，各实验电压下诱发电流的峰值作为该电压下的电流值。
1.4 统计学处理 数据以
±s表示，采用t检验。2 结果
实验分离的心室肌细胞有70%呈柱状，细胞边界与横纹清晰，静息电位-(72±10) mV。
2.1 蛋白激酶抑制剂对IKATP的影响 在37 ℃ 时，各实验电压下均可记录到一外向性电流，并可被glibenclamide抑制，此电流主要为IKATP。在同等实验条件下，在电极内液中加入PKA抑制剂PKI(6～22)amide(1 μmol.L-1)可诱发出IKATP(图1)。而PKC抑制剂calphostic C(1 μmol.L-1)未诱发出IKATP(图2)。
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图1 PKI(6～22)amide对大鼠心室肌IKATP的作用
钳制电压为-10 mV，实验电压分别为0，+20，+40 mV(n=4),与正常对照比较*P<0.01
图2 calphostic C对大鼠心室肌IKATP的作用
钳制电压为-10 mV，实验电压分别为0，+20，+40 mV(n=3),与正常对照比较*P<0.01
2.2 化学磷酸酶BDM的作用 在PSS液加入磷酸化酶，使蛋白质脱磷酸化的物质BDM(5 mmol·L-1)，亦可诱发出IKATP，电流稍小(图3)。
, http://www.100md.com
图3 BDM对大鼠心室肌IKATP的作用
钳制电压为-10 mV，实验电压分别为0，+20，+40 mV(n=4),与正常对照比较*P<0.01
3 讨论
通道的本质是蛋白质，因而多种修饰蛋白质的因素可以调节通道活性，例如pH，细胞内氧化还原状态，酶活性修饰以及阻断剂等。这些调节因素有的是对通道直接作用，有些则是通过改变细胞内信号传导而间接发挥作用。通道蛋白质磷酸化与脱磷酸化过程为通道调节的重要机制之一，如乙酰胆碱N型受体、GABA A受体、谷氨酸受体、钙通道、及氯通道等[4]。细胞内的第二信使如Ca2+、 cAMP、GTP等均可影响IKATP的开放。有报道认为[6]，IKATP通道蛋白三个位点上苏氨酸残基的磷酸化与否，决定该通道的功能状态。因此，蛋白激酶在KATP开放中可能具有重要的意义。
, 百拇医药
PKA抑制剂PKI(6～22)amide可模拟克罗卡林的作用，激活IKATP，PKC抑制剂calphostic C无此作用，因此PKC与IKATP开放过程无关。蛋白脱磷酸化物质BDM，也可诱发出IKATP，可见，通道蛋白脱磷酸化可导致IKATP开放。
结果提示，克罗卡林开放IKATP机制，可能与抑制PKA活性有关,而与PKC无关。
国家自然科学基金资助项目 №39500177
招明高，男，30岁，博士研究生，讲师。
赵德化，男，64岁，教授，博士生导师。
参考文献
, 百拇医药 1，Venkatesh N, Stuart JS, Lamp ST，et al. Activation of ATP-sensitive potassium channels by cromakalim: effects on cellular K+ loss and cardiac function in ischemic and reperfused mammalian ventricle. Circ Res, 1992;71:1324
2，Tarano M, Noma A. Selective modulation of the ATP-sensitive K+ channel by nicordil in guinea-pig cardiac cell membrane. Naunyn Schmiedeberg Arch Pharmacol, 1990; 342: 592
3，Birgitta H, Martin P, Pieter A. ATP-sensitive potassium channels in isolated rat aorta during physiologic, hypoxie, and low-glucose conditions. J Cardiovasc Pharmacol, 1997;29:130
, 百拇医药
4，Irwin B，Levitan J. Modulation of ion channels by protein phosphorylation and dephosphorylation.Annu Rev Physiol，1994;56:193
5，刘启营，陈维洲，魏丕敬，等.常咯啉对分离的成年豚鼠心室肌单细胞的电生理作用.中国药理学报, 1989;10:526
6，Xu ZC, Yang YH, Hebert C. Phosphorylation of the ATP-sensitive,inwardly rectifying K+channel,ROMK,by cyclic AMP-dependent protein kinase. J Bio Chem，1996;271:9313
2000-03-21 收稿, 百拇医药