反相高效液相色谱法测定血浆中TTNPB酸乙酯及其代谢物TTNPB
作者：赵华 李惠芝 邱宗荫 周远大
单位：赵华 李惠芝 邱宗荫(重庆医科大学化学教研室 重庆 400016)；周远大(重庆医科大学临床药理研究室 重庆 400016)
关键词：TTNPB酸乙酯；代谢物；反相高效液相色谱法
药物分析杂志000212摘要 目的：TTNPB酸乙酯及其代谢物TTNPB同属维甲酸类药物，是治疗银屑病的有效药物。为了测定TTNPB酸乙酯及代谢物TTNPB在体内的血药浓度，特建立了反相高效液相色谱同时测定TTNPB酸乙酯和TTNPB的分析方法。方法：反相高效液相色谱法，C18柱，流动相为甲醇-1%冰醋酸(80∶20)，流速为1 mL.min-1，柱温35 ℃，检测波长305 nm。结果：TTNPB酸乙酯在50 ng～5 μg范围内质量与峰面积呈线性，相关系数r=0.999 2，检测下限20 ng；TTNPB在30 ng～5 μg内质量与峰面积呈线性，相关系数r=0.999 4，检测下限为5 ng。在血浆中TTNPB酸乙酯和TTNPB的回收率大于90%，相对标准偏差小于5%。结论：该方法简便，稳定，可用于TTNPB酸乙酯及代谢物TTNPB的同时测定和药代动力学研究。
, 百拇医药
RP-HPLC Determination of Tetrahydro-tetramethyl-
naphthyl-propene-bozoicacid(TTNPB) Ethyl
Ester and Its Metabolite
Zhao Hua,Li Huizhi,Qiu Zongyin and Zhou Yuanda
(Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016)
Abstract Objective：A method for determination of the TTNPB ethyl ester and its metabolite (TTNPB) in plasma was developed.Method:TTNPB ethyl ester and TTNPB were separated by reverse phase HPLC and detected by UV detector.A Waters NOVA-Pak C18 column(3.9 mm×150 mm)was used and the column temperature was kept at 35 ℃.The flow rate of mobile phase (methanol-1% acetic acid)was 1.0 mL.min-1 and UV detection was performed at 305 nm.Results:The limit of detection was 20 ng for TTNPB ethyl ester and 5 ng for TTNPB.Standard curves for TTNPB ethyl ester and TTNPB were linear from 50 ng to 5 μg with r=0.999 2 and 30 ng to 5 μg with r=0.999 4 respectively.The recoveries were more than 90%.Conclusion:The present study provides a simple and reliable method for pharmacokinetic studies as well as for determining concentration of TTNPB ethyl ester and its metabolite in plasma.
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Key words TTNPB ethyl ester,TTNPB,RP-HPLC
维甲酸，又名维A酸，是维生素A的一种衍生物，原用于皮肤科疾病如痤疮、角化性疾病等的治疗。经过大量的实验和流行病学调查资料发现维生素A及衍生物是人类癌肿的一种天然抑制物，其抗肿瘤作用倍受关注。目前已合成上万种的维甲酸类化合物，以寻求高效低毒的药物[1，2]。维甲酸类化合物按其结构和发展顺序可分为三代。第一代是以全反式维甲酸为代表的主要改变极性基团及侧链部分的维甲酸衍生物；第二代是改脂肪环为芳香环的芳香维甲酸，如阿维A酯；第三代是改变多烯侧链的芳维甲酸。四氢—四甲基萘丙烯苯甲酸乙酯(TTNPB酸乙酯)，又名RO 13-6298，及其代谢物TTNPB(结构如图1)，同属于第三代维甲酸，是芳维甲酸类药物最有效的类似物之一。据Peter Loeliger报道[3]，TTNPB酸乙酯抗乳头状瘤活性比维甲酸大8 000倍，而维甲酸过多症毒性只增大800倍。TTNPB酸乙酯及其代谢物TTNPB都是治疗银屑病的有效药物。TTNPB酸乙酯在体内代谢，首先水解成TTNPB，为了对TTNPB酸乙酯和TTNPB的药代动力学进行研究，测定TTNPB酸乙酯及其代谢物TTNPB的血药浓度，本文建立了反相高效液相色谱同时测定TTNPB酸乙酯和TTNPB的分析方法。
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图1 TTNPB酸乙酯(A)和TTNPB(B)的结构
1 仪器与试剂
岛津LC-6A液相色谱仪，配用SPD 6A检测器、C-R3A数据处理系统，Waters NOVA-Pak C18柱(3.9 mm×150 mm，4 μm)，Elgastat UHQ超纯水仪(英国Elga公司)。
TTNPB酸乙酯和TTNPB由重庆华邦制药有限公司提供，纯度为98.5%；甲醇、冰醋酸、乙酸乙酯、高氯酸均为国产分析纯试剂，水为超纯水。
2 实验动物
健康合格一级Wistar大白鼠，体重250 g左右雌雄兼用，由重庆医科大学实验动物中心提供。
3 色谱条件
, 百拇医药
流动相：甲醇-1%冰醋酸(80∶20)。流速：1 mL。min-1。柱温：35 ℃。检测波长：305 nm。
4 血样的采集与处理
TTNPB乙酯用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成0.1%混悬液给大白鼠灌服给药，给药量为20 mg。kg-1，给药2 h后经股动脉取血，用肝素抗凝，离心(3 000 r。min-1)5 min，分出血浆。
取血浆0.5 mL，加5%高氯酸100 μL，摇匀。加入乙酸乙酯0.5 mL，振摇提取5 min，离心(2 000 r。min-1)10 min。取上清液直接进样50 μL。
5 实验结果
, http://www.100md.com
5.1 色谱图 在本实验条件下，空白血浆、TTNPB酸乙酯和TTNPB达到基线分离。图2为空白血浆的色谱图，图3为空白血浆加TTNPB酸乙酯和TTNPB提取后的色谱图，图4为大白鼠灌服20 mg。kg-1 TTNPB酸乙酯后2 h取血提取后的色谱图。图2和图3衰减(Atten)为4，图4衰减为1。
图2 空白血浆色谱图
图3 空白血浆加标准TTNPB酸乙酯和TTNPB的色谱图
1. TTNPB(9 min) 2. TTNPB酸乙酯(24 min)
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图4 灌服TTNPB酸乙酯后大白鼠血浆的色谱图
图注同图3
5.2 线性关系和检测限 配制不同浓度的TTNPB酸乙酯和TTNPB的甲醇溶液，相同条件下进样，以峰面积定量。TTNPB酸乙酯在50 ng～5 μg范围内质量m(ng)与峰面积A呈线性关系，线性方程为：
m=24.05+6.405×10-4A r=0.999 2
最小检测量为20 ng(3倍噪音)。TTNPB在30 ng～5 μg范围内质量m(ng)与峰面积A呈线性关系，线性方程为：
m=9.212+1.041×10-3A r=0.999 4
最小检测量为5 ng(3倍噪音)。
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5.3 回收率和重现性 在0.5 mL空白血浆中加入TTNPB酸乙酯2.5 μg和TTNPB 3.7 μg，用5%高氯酸100 μL沉淀蛋白后，用乙酸乙酯0.5 mL提取，进样50 μL。TTNPB酸乙酯的回收率为91.0%，相对标准偏差4.7%(n=5)；TTNPB的回收率为93.5%，相对标准偏差3.9%(n=5)。
6 讨论
6.1 检测波长TTNPB酸乙酯和TTNPB都有的“反二苯乙烯”的共轭结构使它们具有相似的紫外吸收光谱，TTNPB酸乙酯的最大吸收波长为305 nm，TTNPB的最大吸收波长为302 nm。考虑到本实验条件下TTNPB酸乙酯的检测灵敏度较TTNPB低，因此选择305 nm作为测定波长。
6.2 色谱条件的选择 采用甲醇-1%冰醋酸作流动相，为避免空白血浆中杂峰干扰TTNPB的测定，TTNPB酸乙酯的保留时间较长(约25 min)，使其峰形较宽，检测灵敏度较TTNPB低。为改善TTNPB酸乙酯的灵敏度，我们曾用乙醇代替甲醇进行了试验，用乙醇-1%冰醋酸(67∶33)作流动相，TTNPB与血浆杂峰可基线分离，且TTNPB酸乙酯的保留时间缩短到15 min，分离和测定都较为理想。但乙醇的粘度较大，使其柱压很高，因此本文仍采用甲醇-1%冰乙酸体系作流动相。
, 百拇医药
本方法操作简便，稳定性好，为TTNPB酸乙酯及代谢物TTNPB的分析及药代动力学研究提供了可靠的方法，已用于TTNPB酸乙酯的药代动力学研究。
参考文献
1，王肇炎，韩锐主编.肿瘤药物治疗.第一版.北京：人民卫生出版社，1987.15
2，黄牛.维甲酸类化合物的研究进展.国外医学药学分册，1997，24(2)：78
3，Loeliger P,Bollag W,Mayer H.Arotinoid:A new class of highly active retinoids.Eur J Med Chem Chim Ther,1980,15(1):9
(本文于1999年1月25日收到), http://www.100md.com
单位：赵华 李惠芝 邱宗荫(重庆医科大学化学教研室 重庆 400016)；周远大(重庆医科大学临床药理研究室 重庆 400016)
关键词：TTNPB酸乙酯；代谢物；反相高效液相色谱法
药物分析杂志000212摘要 目的：TTNPB酸乙酯及其代谢物TTNPB同属维甲酸类药物，是治疗银屑病的有效药物。为了测定TTNPB酸乙酯及代谢物TTNPB在体内的血药浓度，特建立了反相高效液相色谱同时测定TTNPB酸乙酯和TTNPB的分析方法。方法：反相高效液相色谱法，C18柱，流动相为甲醇-1%冰醋酸(80∶20)，流速为1 mL.min-1，柱温35 ℃，检测波长305 nm。结果：TTNPB酸乙酯在50 ng～5 μg范围内质量与峰面积呈线性，相关系数r=0.999 2，检测下限20 ng；TTNPB在30 ng～5 μg内质量与峰面积呈线性，相关系数r=0.999 4，检测下限为5 ng。在血浆中TTNPB酸乙酯和TTNPB的回收率大于90%，相对标准偏差小于5%。结论：该方法简便，稳定，可用于TTNPB酸乙酯及代谢物TTNPB的同时测定和药代动力学研究。
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RP-HPLC Determination of Tetrahydro-tetramethyl-
naphthyl-propene-bozoicacid(TTNPB) Ethyl
Ester and Its Metabolite
Zhao Hua,Li Huizhi,Qiu Zongyin and Zhou Yuanda
(Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016)
Abstract Objective：A method for determination of the TTNPB ethyl ester and its metabolite (TTNPB) in plasma was developed.Method:TTNPB ethyl ester and TTNPB were separated by reverse phase HPLC and detected by UV detector.A Waters NOVA-Pak C18 column(3.9 mm×150 mm)was used and the column temperature was kept at 35 ℃.The flow rate of mobile phase (methanol-1% acetic acid)was 1.0 mL.min-1 and UV detection was performed at 305 nm.Results:The limit of detection was 20 ng for TTNPB ethyl ester and 5 ng for TTNPB.Standard curves for TTNPB ethyl ester and TTNPB were linear from 50 ng to 5 μg with r=0.999 2 and 30 ng to 5 μg with r=0.999 4 respectively.The recoveries were more than 90%.Conclusion:The present study provides a simple and reliable method for pharmacokinetic studies as well as for determining concentration of TTNPB ethyl ester and its metabolite in plasma.
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Key words TTNPB ethyl ester,TTNPB,RP-HPLC
维甲酸，又名维A酸，是维生素A的一种衍生物，原用于皮肤科疾病如痤疮、角化性疾病等的治疗。经过大量的实验和流行病学调查资料发现维生素A及衍生物是人类癌肿的一种天然抑制物，其抗肿瘤作用倍受关注。目前已合成上万种的维甲酸类化合物，以寻求高效低毒的药物[1，2]。维甲酸类化合物按其结构和发展顺序可分为三代。第一代是以全反式维甲酸为代表的主要改变极性基团及侧链部分的维甲酸衍生物；第二代是改脂肪环为芳香环的芳香维甲酸，如阿维A酯；第三代是改变多烯侧链的芳维甲酸。四氢—四甲基萘丙烯苯甲酸乙酯(TTNPB酸乙酯)，又名RO 13-6298，及其代谢物TTNPB(结构如图1)，同属于第三代维甲酸，是芳维甲酸类药物最有效的类似物之一。据Peter Loeliger报道[3]，TTNPB酸乙酯抗乳头状瘤活性比维甲酸大8 000倍，而维甲酸过多症毒性只增大800倍。TTNPB酸乙酯及其代谢物TTNPB都是治疗银屑病的有效药物。TTNPB酸乙酯在体内代谢，首先水解成TTNPB，为了对TTNPB酸乙酯和TTNPB的药代动力学进行研究，测定TTNPB酸乙酯及其代谢物TTNPB的血药浓度，本文建立了反相高效液相色谱同时测定TTNPB酸乙酯和TTNPB的分析方法。
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图1 TTNPB酸乙酯(A)和TTNPB(B)的结构
1 仪器与试剂
岛津LC-6A液相色谱仪，配用SPD 6A检测器、C-R3A数据处理系统，Waters NOVA-Pak C18柱(3.9 mm×150 mm，4 μm)，Elgastat UHQ超纯水仪(英国Elga公司)。
TTNPB酸乙酯和TTNPB由重庆华邦制药有限公司提供，纯度为98.5%；甲醇、冰醋酸、乙酸乙酯、高氯酸均为国产分析纯试剂，水为超纯水。
2 实验动物
健康合格一级Wistar大白鼠，体重250 g左右雌雄兼用，由重庆医科大学实验动物中心提供。
3 色谱条件
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流动相：甲醇-1%冰醋酸(80∶20)。流速：1 mL。min-1。柱温：35 ℃。检测波长：305 nm。
4 血样的采集与处理
TTNPB乙酯用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成0.1%混悬液给大白鼠灌服给药，给药量为20 mg。kg-1，给药2 h后经股动脉取血，用肝素抗凝，离心(3 000 r。min-1)5 min，分出血浆。
取血浆0.5 mL，加5%高氯酸100 μL，摇匀。加入乙酸乙酯0.5 mL，振摇提取5 min，离心(2 000 r。min-1)10 min。取上清液直接进样50 μL。
5 实验结果
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5.1 色谱图 在本实验条件下，空白血浆、TTNPB酸乙酯和TTNPB达到基线分离。图2为空白血浆的色谱图，图3为空白血浆加TTNPB酸乙酯和TTNPB提取后的色谱图，图4为大白鼠灌服20 mg。kg-1 TTNPB酸乙酯后2 h取血提取后的色谱图。图2和图3衰减(Atten)为4，图4衰减为1。
图2 空白血浆色谱图
图3 空白血浆加标准TTNPB酸乙酯和TTNPB的色谱图
1. TTNPB(9 min) 2. TTNPB酸乙酯(24 min)
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图4 灌服TTNPB酸乙酯后大白鼠血浆的色谱图
图注同图3
5.2 线性关系和检测限 配制不同浓度的TTNPB酸乙酯和TTNPB的甲醇溶液，相同条件下进样，以峰面积定量。TTNPB酸乙酯在50 ng～5 μg范围内质量m(ng)与峰面积A呈线性关系，线性方程为：
m=24.05+6.405×10-4A r=0.999 2
最小检测量为20 ng(3倍噪音)。TTNPB在30 ng～5 μg范围内质量m(ng)与峰面积A呈线性关系，线性方程为：
m=9.212+1.041×10-3A r=0.999 4
最小检测量为5 ng(3倍噪音)。
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5.3 回收率和重现性 在0.5 mL空白血浆中加入TTNPB酸乙酯2.5 μg和TTNPB 3.7 μg，用5%高氯酸100 μL沉淀蛋白后，用乙酸乙酯0.5 mL提取，进样50 μL。TTNPB酸乙酯的回收率为91.0%，相对标准偏差4.7%(n=5)；TTNPB的回收率为93.5%，相对标准偏差3.9%(n=5)。
6 讨论
6.1 检测波长TTNPB酸乙酯和TTNPB都有的“反二苯乙烯”的共轭结构使它们具有相似的紫外吸收光谱，TTNPB酸乙酯的最大吸收波长为305 nm，TTNPB的最大吸收波长为302 nm。考虑到本实验条件下TTNPB酸乙酯的检测灵敏度较TTNPB低，因此选择305 nm作为测定波长。
6.2 色谱条件的选择 采用甲醇-1%冰醋酸作流动相，为避免空白血浆中杂峰干扰TTNPB的测定，TTNPB酸乙酯的保留时间较长(约25 min)，使其峰形较宽，检测灵敏度较TTNPB低。为改善TTNPB酸乙酯的灵敏度，我们曾用乙醇代替甲醇进行了试验，用乙醇-1%冰醋酸(67∶33)作流动相，TTNPB与血浆杂峰可基线分离，且TTNPB酸乙酯的保留时间缩短到15 min，分离和测定都较为理想。但乙醇的粘度较大，使其柱压很高，因此本文仍采用甲醇-1%冰乙酸体系作流动相。
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本方法操作简便，稳定性好，为TTNPB酸乙酯及代谢物TTNPB的分析及药代动力学研究提供了可靠的方法，已用于TTNPB酸乙酯的药代动力学研究。
参考文献
1，王肇炎，韩锐主编.肿瘤药物治疗.第一版.北京：人民卫生出版社，1987.15
2，黄牛.维甲酸类化合物的研究进展.国外医学药学分册，1997，24(2)：78
3，Loeliger P,Bollag W,Mayer H.Arotinoid:A new class of highly active retinoids.Eur J Med Chem Chim Ther,1980,15(1):9
(本文于1999年1月25日收到), http://www.100md.com