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编号:10234645
天麻苷与钩藤生物碱在实验动物体内的代谢分析
http://www.100md.com 《药物分析杂志》 2000年第2期
     作者:王英锋 魏璐雪

    单位:王英锋(首都师范大学化学系 北京 100037);魏璐雪(北京中医药大学中药学院 北京 100029)

    关键词:

    药物分析杂志000225 中药药对作为复方中一种相对固定的组方单位,是前人对2药配对应用后产生某些特殊功效的精辟总结,自有其内在规律。天麻、钩藤作为平肝熄风中药,常配伍使用。本课题通过对2药活性成分在生物体内的代谢研究,旨在用现代方法研究其配伍机理,为中医理论的论证及临床实践提供新的方法学和依据。

    钩藤为常用中药,其主要活性成分为钩藤生物碱,其中,钩藤碱(Rhynchophyline)、异钩藤碱(Isorhynchophyline)含量较高[1]。由于钩藤在治疗高血压、改善血液循环及脑功能方面呈现良好效果,因此受到国内外医药工作者的重视,已对其资源、提取工艺、含量等进行了研究,但对其体内药物研究尚鲜有报道。本作者对钩藤生物碱在大、小鼠体内的代谢情况已进行了考察,建立了钩藤生物碱生物体内样品分析方法[2],本文是在上述工作基础上进一步考察了大鼠服用钩藤生物碱与天麻苷合用剂后钩藤生物碱的代谢情况。天麻苷为天麻中的活性成分,其药物动力学已有报道[3],本作者在文献报道基础上,用HPLC方法对与钩藤生物碱配伍后的天麻苷的体内代谢药-时关系进行了初步研究。
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    1 仪器与材料

    仪器:岛津LC-7A高效液相色谱仪,色谱柱:Phenomenex C18 5 μm(4.0 mm×250 mm)。

    动物:昆明小鼠30只,Wistar大鼠10只。

    对照物:钩藤碱、异钩藤碱,自制,纯度为99.7%;天麻苷、卡马西平,含量测定用,购自中国药品生物制品检定所;间苯三酚、天麻苷元(对羟基苯甲醇),北京化学试剂公司,纯度均在99.99%以上;钩藤总碱,自制;抗凝剂:肝素;甲醇、乙醚、三乙胺均为国产分析纯。

    2 色谱条件

    测定钩藤生物碱流动相:甲醇-水(55∶45)(含0.01 molL-1三乙胺,冰醋酸调pH=7.5),流速:1.0 mLmin-1,检测波长:254 nm,进样量:20 μL。
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    测定天麻苷流动相:水(0.001 molL-1NaH2PO4-0.001 molL-1Na2HPO4,pH=7.5),测定天麻苷元流动相:甲醇-水(0.000 5 molL-1H3PO4-0.000 5 molL-1NaH2PO4)(96∶4),流速:1.8 mLmin-1,检测波长:221 nm,进样量:20 μL。

    3 标准曲线制作

    3.1 钩藤碱、异钩藤碱标准曲线制作

    精密称取钩藤碱1.10 mg、异钩藤碱1.05 mg,用1%盐酸定容于10 mL容量瓶中,得标准储备液,浓度分别为钩藤碱0.110 mgmL-1、异钩藤碱0.105 mgmL-1
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    精密称取卡马西平5.50 mg,用甲醇定容于5 mL容量瓶中,得内标储备液。

    精取钩藤碱、异钩藤碱标准储备液1,2,4,8,16 μL,分别加入大鼠空白血浆0.50 mL中,再各准确加入内标储备液10 μL,混匀,氨水调pH=11,加入乙醚2.0 mL萃取,乙醚萃取液挥干,用甲醇定容至0.20 mL,得标准溶液。取标准溶液20 μL进行HPLC分析,以组分与内标的色谱信号比对组分浓度做标准曲线,求得钩藤碱和异钩藤碱回归方程分别为:

    Y=0.087X-0.020 r=0.999 1

    Y=0.092X-0.005 r=0.999 4

    钩藤碱、异钩藤碱分别在0.550~8.80 μgmL-1及0.525~8.40 μgmL-1范围内线性良好。
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    3.2 天麻苷标准曲线制作 精称天麻苷5.0 mg,用浓度为11.3 μgmL-1的间苯三酚甲醇液(内标)定容于5.0 mL容量瓶中,精取该溶液20,40,60,80,160 μL,用内标液定容至2.0 mL,得标准系列溶液,取上述溶液各0.50 mL,分别加入至0.50 mL大鼠空白血浆中,沉淀,离心,取上清液过微孔滤膜,取过滤液20 μL进行HPLC分析,以天麻苷与间苯三酚的色谱信号比对天麻苷浓度作标准曲线,回归方程为:

    Y=0.020 3X-0.002 3 r=0.999 8

    天麻苷在10.9~87.0 μgmL-1范围内线性良好。

    3.3 天麻苷元标准曲线制作 精称对羟基苯甲醇2.0 mg,用甲醇定容于10 mL容量瓶中,取该溶液5,10,20,40,80 μL分别加入0.50 mL大鼠空白血浆中,1%盐酸调pH=3,再各加入浓度为1.13 mgmL-1间苯三酚甲醇液10 μL,混匀,用乙醚2 mL萃取,乙醚萃取液挥干,甲醇定容至0.20 mL,取上述标准溶液20 μL进行HPLC分析,以天麻苷元与内标的色谱信号比对苷元浓度作标准曲线,回归方程为:
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    Y=0.011X+0.009 r=0.999 7

    天麻苷元浓度在5.00~80.0 μgmL-1范围内线性良好。

    4 灌胃大鼠服用天麻苷与钩藤总碱合剂后,其体内药-时关系初探

    4.1 灌胃液配制 称取钩藤总碱1 g,用1%盐酸溶解,加水稀释至50 mL,取上述钩藤总碱盐酸盐溶液20 mL,加入天麻苷2.0 g。

    4.2 样品测定 雄性大鼠(约400 g)3只,灌胃剂量:天麻苷500 mgkg-1,钩藤总碱100 mgkg-1,乌拉坦麻醉。分别于灌胃后40,60,80,110,130 min下腔静脉取血,加肝素抗凝,离心取血浆。取血浆0.50 mL,加1%盐酸调pH=3,再加入内标液10 μL,乙醚2 mL萃取,挥干乙醚,加入甲醇0.20 mL溶解,HPLC测定天麻苷元,结果见表1及图1;取血浆0.50 mL,加氨水调pH=11,加卡马西平内标储备液10 μL,混匀,乙醚2.0 mL萃取,萃取液挥干,准确加入甲醇0.20 mL溶解,HPLC测定钩藤碱、异钩藤碱,结果见表2,色谱图见文献[2],取血浆0.50 mL,加入内标液0.50 mL,沉淀,离心,取上清液过微孔滤膜,以续滤液测定天麻苷见表3及图2。
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    表1 大鼠体内天麻苷及其苷元血药浓度-时间关系 时间/min

    浓度/μgmL-1

    天麻苷

    苷元

    40

    16.5

    0

    60

    1.4

    0

    80

    3.62
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    0.274

    110

    0

    5.09

    130

    0

    9.0

    图1 天麻苷元血样品HPLC图

    1.内标 2.天麻苷元

    可见,天麻苷在大鼠体内有一部分代谢为苷元,天麻苷进入大鼠体内后迅速代谢,约1.5 h后代谢已尽。

, http://www.100md.com     表2 大鼠体内钩藤生物碱血药浓度-时间关系 时间/min

    浓度/μgmL-1

    异钩藤碱

    钩藤碱

    40

    3.24

    1.16

    60

    4.11

    1.53

    80

    4.34
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    2.25

    110

    5.09

    2.76

    130

    5.35

    2.6

    图2 天麻苷血样品HPLC图

    1.内标 2.天麻苷

    由上述测定结果可以看出,大鼠口服钩藤生物碱后约2 h,体内血药浓度接近高峰。

    5 结果与讨论
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    5.1 方法精密度测定 取各标准溶液,分别测定5次,以色谱信号求方法精密度结果见表3。

    5.2 方法重现性测定 取4份血浆样品,分别按样品操作步骤进行前处理及测定,计算各物质结果重现性,见表3。

    5.3 加标回收率测定 取3份血浆样品,分别加入不同浓度的标准样品,分别按样品操作步骤进行前处理及测定,测定加标后各物质浓度,计算加标回收率,结果见表3。

    5.4 最低检出限测定 按2倍噪声原则,测定各物质方法最低检出限,结果见表3。

    表3 精密度、重现性、加标回收率、最低检出限 测定对象

    异钩藤碱

    钩藤碱

    天麻苷
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    天麻苷元

    精密度RSD/%

    4.45

    4.32

    3.67

    5.16

    重现性RSD/%

    3.32

    5.54

    3.59

    4.40

    加标回收率/%

    106~108
, 百拇医药
    95.5~109.5

    87~90

    86~92

    最低检出限/

    μgmL-1

    0.14

    0.33

    1.05

    0.58

    5.5 结论与讨论 由以上实验数据可以看出,大鼠口服钩藤总碱及天麻苷后,钩藤生物碱代谢较慢,约2 h后,体内浓度达到高峰;而天麻苷代谢较快,约1.5 h后,原形药在血液中几乎已完全消失;天麻苷代谢产物苷元在血液中含量随时间延长而升高。以上结果表明,2药在体内代谢时间上互补,2药合用可以保持体内药物的有效浓度,促进治疗效果,这在一定程度上反映了天麻钩藤作为常用药对用于中药复方中的用药机理。2药在体内的代谢时间与文献报道的单位用药的代谢情况相一致,也说明2药代谢在时间上互不影响。

    参考文献

    1,天津药品检验药物研究所.钩藤降压有效成分的提取及药理研究.中草药通报,1974,4:8

    2,王英锋,魏璐雪,王保中.钩藤生物碱实验动物体内药物分析.药物分析杂志,1999,19(1):56

    3,陆光伟,邹元杰,莫启忠等.不同给药时辰对[3H]天麻素大鼠体内过程的影响.中国药理学报,1986,7(2):190

    (本文于1999年9月7日收到), 百拇医药