P物质在内毒素血症大鼠肠蠕动变化中的作用
作者：史洪涛 冷恩仁 桂先勇
单位：第三军医大学大坪医院消化内科 重庆 400042
关键词：P物质 内毒素血症 肠道传输
重庆医学000203摘 要：目的 肠源性内毒素血症是多器官功能 衰竭的重要发病因素之一，而内毒素血症状态下肠蠕动变化及肠道神经内分泌系统的研究甚 少。方法 利用动物实验，观察内毒素血症状态下肠道传输速率变化 ：Wistar大鼠分为对照组、LPS组；观察内毒素血症后3、6、12小时大鼠血浆、空肠组织匀 浆P物质含量变化及空肠免疫组化SP阳性神经在肠道分布及内毒素血症后的变化。结果 内毒素血症后小肠传输速率加快；内毒素血症后血浆SP变化不显著，空 肠SP含量下降，空肠SP阳性神经纤维及产物表达减少，且与空肠组织SP含量变化相一致。结论 内毒素血症后肠道传输功能发生变化，可能与肠神经递质SP改变 有一定关系。
, 百拇医药
Research on the Effect of Substance P on Intestinal Transi t During Endotoxemia
Shi Hongtao Len Enren Qui Xianyong
(Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing,400042 )
Abstract：Objective:It has been known that enterogenic endotoxem ia is an important pathogenetic factor in multiple organ failure(MOF).However,th e changes of intestinal transit and the neuropeptides in gut during endotoxemia is not well understood.Method:The effects of E.coli lipopolysaccha ride(LPS) o n the rate of small intestinal transit were investigated in Wistar rats which we re gi ven LPS 10mg/kg,intraperitonealy;The changes of neuropeptides during endotoxe mia were investigated.The Wistar rats were divided into two groups:normal control and LPS group(LPS,10mg/kg,intravenously).Tissue and serum levels of imm u noreactive substance p(ISP) were measured at 3、6、12 hours postendotoxemia.Immu nohistochemistry methods were used to evaluate the effect of endotoxemia on the distribution of SP immunoreactivity of positive nerve fibre and product in the j ejuna.Results:Intestinal transit was rapid during endotoxemia. LPS de creased the tissue levels of ISP without changes in peripheral plasma levels.Decreased SP immunoreactive in jejuna showed similar alterations in the tissue levels of n europeptides. Conclusion:The changes of intestinal transit during end otoxemia possibly associated with SP.
, 百拇医药
Key words：Substance P;Endotoxemia;Intestinal transit▲
肠源性内毒素血症是多器官功能衰竭(MOF)的重要发病因素之一，而内毒素血症状态下肠蠕动变化及肠道神经内分泌系统的研究甚少，P物质(SP)存在于人和哺乳类动物的整个胃肠道中，具有增加血管通透性和调节肠道运动等十分重要的生物活性。本研究利用动物实验，观察内毒素血症状态下肠道传输速率变化及肠神经递质SP改变，为肠源性内毒素移位的发 生机理提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 材料 选用健康成年(10～12周龄)的88只雄性Wistar大鼠，体重220± 30g，随机分组，实验前禁食12小时。大肠杆菌脂多糖(Lipopolysaccharide LPS 0111 B4) 购自美国Sigma公司。SP放射免疫测试药盒购自北京海科锐生物技术中心。SP多克隆抗体及S -P试剂盒为北京中山生物公司进口分装。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 肠道传输速率研究 采用活性炭标记法，实验动物随机分为2组， 每组11只。对照组：腹腔注射生物盐水，1ml/kg；内毒素血症(LPS)组：腹腔注射LPS，10mg /kg。大鼠灌服5%活性炭-2%羟甲基纤维素钠混悬液0.4ml，于30分钟后处死动物，开腹取全 部胃肠，量取自幽门括约肌至色素最前端及盲肠距离，以二者之百分比为小肠推进比。
1.2.2 内毒素血症模型建立及检测指标 大鼠1%戊巴比妥钠30mg/kg腹 腔注射麻醉后，取仰卧位，切开颈部皮肤，切口1～2cm，分离皮下组织，显露颈外静脉，作 颈外静脉插管。内毒素血症组：静脉一次性注射LPS10mg/kg；对照组：静注等量生理盐 水。于3、6、12小时后处死动物，处死前取心脏血，分离血浆，并取空肠标本。
大鼠血浆、空肠组织SP放射免疫测定以北京海科锐生物技术中心提供的SP-RIA-Rit整套试剂 测定；空肠石蜡切片SP免疫组化染色。
, http://www.100md.com
1.2.3 图像分析 SP免疫组化切片采用Vanderwinden[1]方法选取 ，用同一染色条件下不同时相点切片，每时相点6张，于200倍光镜下随机选5个视野观察粘 膜 、粘膜下层、环肌层、肌间神经丛中阳性细胞、纤维及产物的染色强度、分布状况，进行判 断、评分。
标准：特别密集(4分)、密集(3分)、中等(2分)、稀疏(1分)、阴性(0分)。
1.3 统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示，采用微软Excel统 计分 析程序进行单因素方差分析及t检验。以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非 常显著。
2 结 果
2.1 内毒素血症大鼠肠道传 输速率变化显示内毒素使小肠传输速率加快(P<0.01)见表1。
, 百拇医药 表1 肠道传输速率变化 组 别
小肠全长(cm)
推进长 度(cm)
推进比(%)
LPS组
98.28±7.27
66.40±4.43
67.56±2.49*
对照组
98.17±6.89
55.86±5.26
56.82±2.30
, http://www.100md.com
*P<0.01 与对照组比较
2.2 内毒素血症大鼠血浆及空肠完整肠管SP含量变化 内毒素血症3、6、1 2小时，血浆SP含量与对照组比较无明显差异，空肠组织SP含量明显低于对照组(P<0.01 )，并呈下降趋势见表2。
表2 空肠组织P物质含量变化(pg/mg) 组 别
3小时
6小时
12小时
LPS组
39.75±4.31*
15.66±2.61*
11.89±3.27*
, http://www.100md.com
对照组
61.53±6.09
59.08±4.05
60.12±6.43
*P<0.01 与对照组比较
2.3 空肠SP免疫组化染色结果 SP免疫组化染色，其阳性产物为棕色沉淀 ，分布于肠绒毛粘膜上皮、粘膜下层、肌间神经丛。对照组(6小时)大鼠空肠绒毛内可见丰 富的SP阳性神经纤维存在，多数沿绒毛纵轴走行，靠绒毛粘膜上皮侧较多，肠肌间神经丛亦 可见多数阳性神经元。内毒素血症后空肠绒毛内及肠肌间神经丛表达明显减少见表3。
表3 P物质免疫组化染色结果 组 别
粘膜层
, http://www.100md.com
粘膜 下层
环肌层
肌间神经丛
对照组
3.68±0.29
2.43±0.30
2.61±0.32
3.27±0.26
LPS组3小时
2.05±0.18*
1.34±0.22*
1.43±0.20*
, 百拇医药
2.06±0.26*
6小时
1.28±0.14*
1.18±0.24*
1.08±0.18*
1.34±0.24*
12小时
1.17±0.13*
1.14±0.20*
1.06±0.12*
1.33±0.24*
*P<0.01与对照组比较
, http://www.100md.com
3 讨 论
本研究通过动物实验观察内毒素对清醒状态下大鼠肠道传输功能影响，提示内毒素可加快大 鼠小肠传输推进力，与Cullen[2]结果相一致。认为肠内容物传输的加快，内毒素对肠道分泌机制的作用可能导致腹泻的发生，这种胃肠动力和传输功能的紊乱可增加细菌的再生和移位，引发多器官功能衰竭的发生。
胃肠神经肽和它们的受体广泛地分布在肠神经系统和胃肠道平滑肌细胞中，参与胃肠动力功能的调控。外界刺激因素的强弱可直接影响到组织内肽的生成、释放与降解间的平衡关系，这种平衡关系决定了组织中肽含量的高低[3]。内毒素血症作为一种强烈的刺激状态可引起神经内分泌系统的变化，表现为神经内分泌激素释放的增多或减少，神经系统可通过递质、调质或神经内分泌激素而影响局部或全身其它各系统的功能。SP存在于人和哺乳类动物的整个胃肠道中，具有增加血管通透性和调节肠道运动等十分重要的生物活性，SP阳性神经纤维在肠道内与肠粘膜和肠血管有密切的组织定位关系。SP的神经末梢是一类具有双向传递功能的感觉神经末梢，它既向中枢传递信号，又可在局部释放物质，发挥重要的递质和调质功能。SP亦是一种感受伤害性物质，受刺激可从神经末梢释放，促进炎症损伤，影响免疫功能。本实验中，内毒素血症后，空肠组织SP含量下降而血浆SP含量变化不显著，空肠绒毛内SP阳性神经纤维及产物，粘膜下、肌间神经丛内SP阳性产物明显减少，且与肠管内SP含量变化相一致，呈下降趋势。提示内毒素血症状态下，空肠肠壁内SP能神经末梢释放耗竭，使空肠组织局部SP产生减少，空肠完整肠管SP含量取决于肠壁内SP能神经中的SP含量，局部SP的释放被认为与肌电复合波紊乱、引起不规律的峰电位活动有关[4]，亦说明内毒素血症后肠道内SP含量下降与肠运动功能紊乱有关。
, http://www.100md.com
Meakin[5]等称肠道是MOF发生的“始动器”。Hu[6]等提出：肠道神经内分泌系统可能是应激状态下的此“始动器”的“起始因子”。神经内分泌的过度反应是引起肠粘膜损害、肠源性内毒素移位的一个因素，对于内毒素血症状态下肠道神经内分泌的深入研究，有助于更好地阐明肠道微生物移位及MOF的发生和发展，而且对临床上防治这两种病理过程的发生，可能提供有效的手段，其研究前景广阔。
参考文献：
[1]Vanderwinden JM,De Leaf MH,Schiffmann SN,et al.Nitric oxide sy nthase distribution in the enteric nervous system of Hischsprungs disease.Gastro enterology,1993,105:969
[2]Cullen JJ,Caropreso DK,Ephgraveks,et al.The effect of endotoxi n on canine jejunal motility and transit.J Surg Res,1997,67:54
, http://www.100md.com
[3]韩济生.神经肽研究中的若干问题.生理科学进展，1988，19：173
[4]Lordal LM,Johansson C,Hellstrom PM.Myoelectric pattern and eff ects on small bowel transit induced by the tachykinins neurokinin A,neurokinin B ,substance P and neuropeptide K in the rat.J Gastrointest Motil,1993,5:33
[5]Meovkins JL,March JC.The gastrointestinal tract:the “motor”of MOF.Arch Surg,1986,121:197
[6]Hu D,Chan B,Lin S,et al.Changes in substance P in the jejuna of rats after burns.Burns,1996,20:463, 百拇医药
单位：第三军医大学大坪医院消化内科 重庆 400042
关键词：P物质 内毒素血症 肠道传输
重庆医学000203摘 要：目的 肠源性内毒素血症是多器官功能 衰竭的重要发病因素之一，而内毒素血症状态下肠蠕动变化及肠道神经内分泌系统的研究甚 少。方法 利用动物实验，观察内毒素血症状态下肠道传输速率变化 ：Wistar大鼠分为对照组、LPS组；观察内毒素血症后3、6、12小时大鼠血浆、空肠组织匀 浆P物质含量变化及空肠免疫组化SP阳性神经在肠道分布及内毒素血症后的变化。结果 内毒素血症后小肠传输速率加快；内毒素血症后血浆SP变化不显著，空 肠SP含量下降，空肠SP阳性神经纤维及产物表达减少，且与空肠组织SP含量变化相一致。结论 内毒素血症后肠道传输功能发生变化，可能与肠神经递质SP改变 有一定关系。
, 百拇医药
Research on the Effect of Substance P on Intestinal Transi t During Endotoxemia
Shi Hongtao Len Enren Qui Xianyong
(Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing,400042 )
Abstract：Objective:It has been known that enterogenic endotoxem ia is an important pathogenetic factor in multiple organ failure(MOF).However,th e changes of intestinal transit and the neuropeptides in gut during endotoxemia is not well understood.Method:The effects of E.coli lipopolysaccha ride(LPS) o n the rate of small intestinal transit were investigated in Wistar rats which we re gi ven LPS 10mg/kg,intraperitonealy;The changes of neuropeptides during endotoxe mia were investigated.The Wistar rats were divided into two groups:normal control and LPS group(LPS,10mg/kg,intravenously).Tissue and serum levels of imm u noreactive substance p(ISP) were measured at 3、6、12 hours postendotoxemia.Immu nohistochemistry methods were used to evaluate the effect of endotoxemia on the distribution of SP immunoreactivity of positive nerve fibre and product in the j ejuna.Results:Intestinal transit was rapid during endotoxemia. LPS de creased the tissue levels of ISP without changes in peripheral plasma levels.Decreased SP immunoreactive in jejuna showed similar alterations in the tissue levels of n europeptides. Conclusion:The changes of intestinal transit during end otoxemia possibly associated with SP.
, 百拇医药
Key words：Substance P;Endotoxemia;Intestinal transit▲
肠源性内毒素血症是多器官功能衰竭(MOF)的重要发病因素之一，而内毒素血症状态下肠蠕动变化及肠道神经内分泌系统的研究甚少，P物质(SP)存在于人和哺乳类动物的整个胃肠道中，具有增加血管通透性和调节肠道运动等十分重要的生物活性。本研究利用动物实验，观察内毒素血症状态下肠道传输速率变化及肠神经递质SP改变，为肠源性内毒素移位的发 生机理提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 材料 选用健康成年(10～12周龄)的88只雄性Wistar大鼠，体重220± 30g，随机分组，实验前禁食12小时。大肠杆菌脂多糖(Lipopolysaccharide LPS 0111 B4) 购自美国Sigma公司。SP放射免疫测试药盒购自北京海科锐生物技术中心。SP多克隆抗体及S -P试剂盒为北京中山生物公司进口分装。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 肠道传输速率研究 采用活性炭标记法，实验动物随机分为2组， 每组11只。对照组：腹腔注射生物盐水，1ml/kg；内毒素血症(LPS)组：腹腔注射LPS，10mg /kg。大鼠灌服5%活性炭-2%羟甲基纤维素钠混悬液0.4ml，于30分钟后处死动物，开腹取全 部胃肠，量取自幽门括约肌至色素最前端及盲肠距离，以二者之百分比为小肠推进比。
1.2.2 内毒素血症模型建立及检测指标 大鼠1%戊巴比妥钠30mg/kg腹 腔注射麻醉后，取仰卧位，切开颈部皮肤，切口1～2cm，分离皮下组织，显露颈外静脉，作 颈外静脉插管。内毒素血症组：静脉一次性注射LPS10mg/kg；对照组：静注等量生理盐 水。于3、6、12小时后处死动物，处死前取心脏血，分离血浆，并取空肠标本。
大鼠血浆、空肠组织SP放射免疫测定以北京海科锐生物技术中心提供的SP-RIA-Rit整套试剂 测定；空肠石蜡切片SP免疫组化染色。
, http://www.100md.com
1.2.3 图像分析 SP免疫组化切片采用Vanderwinden[1]方法选取 ，用同一染色条件下不同时相点切片，每时相点6张，于200倍光镜下随机选5个视野观察粘 膜 、粘膜下层、环肌层、肌间神经丛中阳性细胞、纤维及产物的染色强度、分布状况，进行判 断、评分。
标准：特别密集(4分)、密集(3分)、中等(2分)、稀疏(1分)、阴性(0分)。
1.3 统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示，采用微软Excel统 计分 析程序进行单因素方差分析及t检验。以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非 常显著。
2 结 果
2.1 内毒素血症大鼠肠道传 输速率变化显示内毒素使小肠传输速率加快(P<0.01)见表1。
, 百拇医药 表1 肠道传输速率变化 组 别
小肠全长(cm)
推进长 度(cm)
推进比(%)
LPS组
98.28±7.27
66.40±4.43
67.56±2.49*
对照组
98.17±6.89
55.86±5.26
56.82±2.30
, http://www.100md.com
*P<0.01 与对照组比较
2.2 内毒素血症大鼠血浆及空肠完整肠管SP含量变化 内毒素血症3、6、1 2小时，血浆SP含量与对照组比较无明显差异，空肠组织SP含量明显低于对照组(P<0.01 )，并呈下降趋势见表2。
表2 空肠组织P物质含量变化(pg/mg) 组 别
3小时
6小时
12小时
LPS组
39.75±4.31*
15.66±2.61*
11.89±3.27*
, http://www.100md.com
对照组
61.53±6.09
59.08±4.05
60.12±6.43
*P<0.01 与对照组比较
2.3 空肠SP免疫组化染色结果 SP免疫组化染色，其阳性产物为棕色沉淀 ，分布于肠绒毛粘膜上皮、粘膜下层、肌间神经丛。对照组(6小时)大鼠空肠绒毛内可见丰 富的SP阳性神经纤维存在，多数沿绒毛纵轴走行，靠绒毛粘膜上皮侧较多，肠肌间神经丛亦 可见多数阳性神经元。内毒素血症后空肠绒毛内及肠肌间神经丛表达明显减少见表3。
表3 P物质免疫组化染色结果 组 别
粘膜层
, http://www.100md.com
粘膜 下层
环肌层
肌间神经丛
对照组
3.68±0.29
2.43±0.30
2.61±0.32
3.27±0.26
LPS组3小时
2.05±0.18*
1.34±0.22*
1.43±0.20*
, 百拇医药
2.06±0.26*
6小时
1.28±0.14*
1.18±0.24*
1.08±0.18*
1.34±0.24*
12小时
1.17±0.13*
1.14±0.20*
1.06±0.12*
1.33±0.24*
*P<0.01与对照组比较
, http://www.100md.com
3 讨 论
本研究通过动物实验观察内毒素对清醒状态下大鼠肠道传输功能影响，提示内毒素可加快大 鼠小肠传输推进力，与Cullen[2]结果相一致。认为肠内容物传输的加快，内毒素对肠道分泌机制的作用可能导致腹泻的发生，这种胃肠动力和传输功能的紊乱可增加细菌的再生和移位，引发多器官功能衰竭的发生。
胃肠神经肽和它们的受体广泛地分布在肠神经系统和胃肠道平滑肌细胞中，参与胃肠动力功能的调控。外界刺激因素的强弱可直接影响到组织内肽的生成、释放与降解间的平衡关系，这种平衡关系决定了组织中肽含量的高低[3]。内毒素血症作为一种强烈的刺激状态可引起神经内分泌系统的变化，表现为神经内分泌激素释放的增多或减少，神经系统可通过递质、调质或神经内分泌激素而影响局部或全身其它各系统的功能。SP存在于人和哺乳类动物的整个胃肠道中，具有增加血管通透性和调节肠道运动等十分重要的生物活性，SP阳性神经纤维在肠道内与肠粘膜和肠血管有密切的组织定位关系。SP的神经末梢是一类具有双向传递功能的感觉神经末梢，它既向中枢传递信号，又可在局部释放物质，发挥重要的递质和调质功能。SP亦是一种感受伤害性物质，受刺激可从神经末梢释放，促进炎症损伤，影响免疫功能。本实验中，内毒素血症后，空肠组织SP含量下降而血浆SP含量变化不显著，空肠绒毛内SP阳性神经纤维及产物，粘膜下、肌间神经丛内SP阳性产物明显减少，且与肠管内SP含量变化相一致，呈下降趋势。提示内毒素血症状态下，空肠肠壁内SP能神经末梢释放耗竭，使空肠组织局部SP产生减少，空肠完整肠管SP含量取决于肠壁内SP能神经中的SP含量，局部SP的释放被认为与肌电复合波紊乱、引起不规律的峰电位活动有关[4]，亦说明内毒素血症后肠道内SP含量下降与肠运动功能紊乱有关。
, http://www.100md.com
Meakin[5]等称肠道是MOF发生的“始动器”。Hu[6]等提出：肠道神经内分泌系统可能是应激状态下的此“始动器”的“起始因子”。神经内分泌的过度反应是引起肠粘膜损害、肠源性内毒素移位的一个因素，对于内毒素血症状态下肠道神经内分泌的深入研究，有助于更好地阐明肠道微生物移位及MOF的发生和发展，而且对临床上防治这两种病理过程的发生，可能提供有效的手段，其研究前景广阔。
参考文献：
[1]Vanderwinden JM,De Leaf MH,Schiffmann SN,et al.Nitric oxide sy nthase distribution in the enteric nervous system of Hischsprungs disease.Gastro enterology,1993,105:969
[2]Cullen JJ,Caropreso DK,Ephgraveks,et al.The effect of endotoxi n on canine jejunal motility and transit.J Surg Res,1997,67:54
, http://www.100md.com
[3]韩济生.神经肽研究中的若干问题.生理科学进展，1988，19：173
[4]Lordal LM,Johansson C,Hellstrom PM.Myoelectric pattern and eff ects on small bowel transit induced by the tachykinins neurokinin A,neurokinin B ,substance P and neuropeptide K in the rat.J Gastrointest Motil,1993,5:33
[5]Meovkins JL,March JC.The gastrointestinal tract:the “motor”of MOF.Arch Surg,1986,121:197
[6]Hu D,Chan B,Lin S,et al.Changes in substance P in the jejuna of rats after burns.Burns,1996,20:463, 百拇医药