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编号:10240943
DNA分析技术在法科学中的应用及展望
http://www.100md.com 《法律与医学杂志》 2000年第2期
     作者:徐振波 吴梅筠 陈海东 胡海洋 赖跃

    单位:徐振波(广东省深圳市公安局刑事科学技术研究所,518001);吴梅筠(华西医科大学法医学院,成都610041);陈海东(广东省深圳市公安局刑事科学技术研究所,518001);胡海洋(广东省深圳市公安局刑事科学技术研究所,518001);赖跃(广东省深圳市公安局刑事科学技术研究所,518001)

    关键词:法医生物学;DNA技术

    法律与医学杂志000214 【摘要】 本综述对DNA指纹、PCR-VNTR 、PCR-STR、PCR-mtDNA 测序等技术的发展,以及其在法科学中的应用领域和发展前景作了系统的阐述。认为由于DN A分析技术所具有的特点,使之已成为现今法科学生物检材检验的主要手段之一。阐述了现 阶段DNA分析技术已向标准化、自动化和高鉴别机率方向发展,以及建立DNA罪犯数据库的必 要性和应用价值。
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    【中图分类号】 D919.2;Q75

    【文献标识码】 A 【文章编号】 1007-9297(2000)02-0080-06

    Application and prospect of DNA analytic technique in forensic science

    XU Zheng-bo WU Mei-yun CHEN Hai-dong

    (Shenzhen City Institute of Forensic Science)

    【Abstract】 The history,development and prospect o n DNA analytic technique such as DNA fingerprint,PCR-VNTR,PCR-STR and PCR-mtDNA were systematically reviewed i n this paper.Having characteristic of high biological identification,DNA analyti c technique has been became one of main methods of bioassay.At present,the deve l opment of analytic technique tends to standardization,automation and high-power forensic identification.Meanwhile,it is stressed that establishment DNA databas e of criminal has important significance in forensic practice.
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    【Key Words】Forensic biology DNA

    脱氧核糖核酸(DNA)是细胞内线性生物多聚体,它存在于所有真核细胞 中。已经证明,染色 体(Chromosome)是遗传物质的主要载体,每一个染色体是由一个线性DNA分子和蛋白质构成 。 生物细胞的遗传信息就存在于DNA分子上众多的基因中。广义的基因是一个可用观察突变效 应来检测的遗传功能单位,而基因的分子生物学定义为:基因是编码一条多肽链或一个RN A分子所必需的所有DNA顺序[1]。染色体、DNA和基因的关系是:染色体是DNA分子 的 载体,DNA是遗传的物质基础,基因是DNA分子上具有遗传效应的片段。在许多世代中稳定, 编码同一性状在同一染色体相同位置的不同交替形式的基因称为等位基因(Allele)。人类在 进化过程中DNA不断发生突变,DNA在复制时的序列滑动和染色体的分离、组合,形成人类DN A的个体差异及DNA多态性。法科学DNA分析就是利用此现象进行亲子鉴定及生物物证的个人 识别。法医DNA分析技术主要有二大类:DNA指纹技术和PCR技术。
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    一、DNA指纹技术

    1985年,英国遗传学家Jeffreys等[2]合成了2个小卫星探针(λ 33.15和λ33.6),通过Southern杂交得到一系列高度变异的谱带,这种谱带如同人类指纹 可 达到完全个体特异的水平(同卵双生子除外),Jeffreys称之为DNA指纹(DNA fingerprint)。 同年,他首次将DNA分析技术应用于法科学领域并获得成功[3]。此后,又有许多 学 者制备了一系列探针,如M21.3、CEPH、MYO等。DNA指纹的原理是:在人类进化过程中,DN A 序列中核苷酸排列顺序发生变化,如其变化涉及限制性内切酶识别位点时,可引起酶切位点 的消失和获得。当用限制性内切酶消化时,产生不同长度的DNA片段,此不同长度片段在群 体中呈多态现象。

    DNA指纹的探针有两类:多位点探针和单位点探针。多位点探针可同时检测多个位点,单位 点探针只检测一个位点。多位点探针的显著特点是鉴别机率极高,一个探针即可达到个人认 定的目的,如33.15探针(Gill)的个人匹配机率(Pm)为2×10-10~2.4×10 -11。多位点探 针的缺点是:1)对DNA模板要求高,不能用于降解DNA;2)操作复杂、费用昂贵、耗时长(7~ 14天);3)谱带的判读较困难,尤其是混合斑;4)统计学分析较复杂;5)探针的种属特异性 差。由于人类与动植物的某些DNA片段的同源性以及多位点探针的特性,故有些探针除与人 类DNA基因组杂交外,也可与动植物DNA基因组杂交,特别 是检测人、动物混合血斑时,影响案件的侦破;6)无DNA指纹的群体分布资料。单位点探针 因只与一个位点杂交,鉴别机率低,但无多位点探针的某些缺点,曾流行一时。近年来,PC R技术日益成熟、完善。其方法简便、成本低,基本取代了单位点探针而成为个人识别和亲 子鉴定的主要技术。
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    二、PCR技术

    1985年Saiki和Mullis等[4]发明了DNA聚合酶链式反应技术(pol ymerase chain reaction,PCR)。其原理是利用一对引物、DNA聚合酶和四种dNTP,通过模 板DNA变性,与特异引物结合(复性),在DNA聚合酶作用下,四种dNTP沿模板DNA3'端按碱基 互补原则结合,形成两条与模板序列完全互补的DNA新链(延伸),经过多个变性、复性、延 伸循环,从而在体外将某一特异的DNA片段的量以几何级数倍增。早期PCR的DNA聚合酶是从 大肠杆菌中提取的Klenow,其主要缺点是:1)不耐热,90℃以上失活;2)聚合反应温度低, 易产生非特异带。1988年Saiki等[5]首次将耐热DNA聚合酶(thermus aquaticus,T aq)引入PCR技术,使DNA扩增反应的效率大大提高。

    PCR技术有以下特点:1)操作简便,省时(1~4h);2)灵敏度高;3)特异性好:5)可用于部分 降解DNA及混合性DNA检材。PCR在法医学中的应用主要有扩增片段长度多态性技术和扩增产 物序列多态性技术,其中扩增片段长度多态性技术是现阶段应用最广泛的技术。
, 百拇医药
    (一)扩增片段长度多态性

    1.VNTR系统 可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeat,VNTR)是由Wyman等[6]在1980年从人类DNA文库中发现的一高度 可变的重复区。继后,又有人发现与之类似的可变区[7,8]。其特征是高变区内 有一核心序列可重复串联,核心序列的长度为10~70bp,不同个体核心序列的重复次数不一 样,在群体中呈多态性,高变区基本上在非编码区[9]。Nadamura等[10] 将这称之为VNTR和小卫星DNA(minisatellite)。VNTR位点存在于整个人类基因组,主要分 布在染色体端粒。表1列出了法科学中常见的部分VNTR位点。

    众所周知,VNTR系统的缺点是:杂合子两条带的产量往往有差异,短片段产量较长片段高 , 随着两片段长度相差越大越明显[11,12],这是由于小基因较大基因更容易扩增所 至,以致将杂合子误判为纯合子。当DNA部分降解,尤其长片段的靶DNA降解时,只扩出短片 段,导致错误判型,限制了VNTR系统在法科学中的应用。
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    2.STR系统 短串联重复序列(short tandem repeat,ST R)形 成多态性的原理与VNTR基本相同。STR位点广泛地分布在人类基因组。STR的核心序列短,为 2~7bp,片段长度为100~500bp。据估计,在人类基因组中,每20kb就有一个3或4核苷 酸 重复序列的STR位点[19,20]。Edwards等研究STR位点发现,近一半STR位点 具有多态性[21]。STR位点片段小、重复单元小,具有以下优点:1)检测方法的 灵敏度高,两条带的扩增产量相等,不存在优先扩增和漏带现象;2)因STR位点广泛存在 于整个基因组,可用于检测部分降解DNA;3)各位点的扩增条件相差不大,可将几个STR位点 进行同步扩增,即复合扩增技术(multiplex PCR),此法节约时间与检材、提高工作效率和识 别机率。目前STR系统在法科学个人识别和亲子鉴定中逐渐占据了主导地位。表2列出了应用 于法科学的个人识别和亲子鉴定的一些STR位点。

    表1 常见的VNTR位点 位点
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    染色体

    定位

    引物序列

    参考

    文献

    D1S80

    1p35-36

    5'-gaaactggcctccaaacactgccgccg-3'

    [11]

    (pMCT118)

    5'-gtcttgttggagatgcacgtgccccttgc-3'

, http://www.100md.com     D17S30

    17p13.3

    5'-ggaagagtgaagtgcaaagg -3'

    [13]

    (pYNZ22)

    5'-cacagtctttattcttcagcg-3'

    ApoB'3

    2p23-24

    5'-atggaaacggagaaattatg-3'

    [1 4]

    5'-ccttctcacttggcaaatac-3'
, http://www.100md.com
    DxS52

    Xq28

    5'-ggcatgtcatcacctctctcatgtt-3'

    [ 12]

    5'-caccactgccctcacgtcactt-3'

    D4S95

    4p16.3

    5'-gcataaaatggggataacagtac-3'

    [15]

    5'-gacattgctttatagctgtgccatcagttt-3'
, 百拇医药
    D7S21

    7

    5'-ccctttgcacgctggacggtggcg-3'

    [16]

    5'-acaccgtccccacacgcccatccg-3'

    D12S11

    12

    5'-ctatacatgtttacacacatgcc-3'

    [17 ]

    5'-gcgggagaaatagaaatagaact-3'

, http://www.100md.com     D1S7

    1

    5'-gctttctgtgatgagccttgatg-3'

    [17]

    5'-aagaagcatatgcaacccatgagg-3'

    D1S111

    1q23

    5'-tgtgagtagaggagacctcacatt-3'

    [ 18]

    (p33.6)

    5'-aggtgagacattactcaatccaag-3'
, 百拇医药
    D1S118

    1q

    5'-ccgggccagaccccagctgctgctgag-3'

    (p33.4)

    5'-gcagcataggggctgtcctgggct-3'

    表2 部分应用于法科学的STR基因座 基因座

    染色体

    重复序列

    等位基因

    大小(bp)

    ARA
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    Xcen-q13

    AGC

    195-225

    ACTBP2

    6

    AAAG

    231-339

    CD4

    12pter12pter

    AAAAG

    125-175

    CSF1PO
, 百拇医药
    5q33.5-34

    AGAT

    291-327

    CYP19

    15q21-31

    AAAT

    173-201

    DHFRP2

    6

    AAAC

    163-179

    D5S818
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    5q21-31

    AGAT

    119-151

    D7S820

    7q

    AGAT

    212-244

    D8S1179

    8

    TCTA

    174-206

    D11S554

    11
, 百拇医药
    AAAG

    176-225

    D13S317

    13q22-31

    AGAT

    165-197

    D16S539

    16q24-qter

    AGAT

    264-304

    D18S51

    18q21.3
, 百拇医药
    AAAG

    275-323

    D19S253

    19p13.1

    GATA

    209-241

    D21S11

    21

    TCTA/TCTG

    172-264

    F13B

    1q31-32.1
, 百拇医药
    AAAT

    169-193

    F13A01

    6p24-25

    AAAG

    281-331

    FIBRA

    4q28

    TTTC

    256-284

    FESFPS

    15q25-qter

, 百拇医药     AAAT

    222-250

    HTRTB

    Xq26

    AGAT

    259-303

    LPL

    8p22

    AAAT

    105-133

    PLA2A1

    12q23-qter

    AAT
, 百拇医药
    118-139

    TH01

    11p15.5

    AATG

    129-203

    TPOX

    2p23-2pter

    AATG

    224-252

    VWA

    12p12-pter

    AGAT

, 百拇医药     126-166

    尽管STR系统有众多的优点,但也有其不足之处:1)突变率高,为10 -2~10-5,高于人类基因平均突变率1.4×10-10[22];2)DN A污染。由于STR系统检测方法灵敏度极高(ng量DNA即可测出),当样品中渗入其他微量DNA时 ,可导致错误判型。作者在研究中发现,当将两样品混合时,如一样品量较多,另一样品量 极少,样品量少的标本很难得到有效地扩增,银染后无带或带极弱;3)某些位点重复单元不 确定,如ACTBP2、DHFRP2为四核苷酸重复单元位点,但研究发现有相差1bp、2bp等位 基因存在[23,24],可影响检案结果的判定。这种现象是人类在进化过程中, 基因组发生中性突变,即中性突变随机漂移的结果。这种突变并不影响核酸、蛋白质的功能 。因此,在法科学采用某一位点时,有必要进行群体遗传学调查,避免错误判型;4)STR位 点扩增片段大于300bp及等位基因数目较多时(多于15个),等位基因Ladder的构建极其困难 ,电泳时不能很好分离,增加了结果判定的难度,如ACTBP2
, 百拇医药
    法科学选择STR位点应符合下列条件:1)有群体遗传学调查资料,家系调查结果证明符合孟 德尔遗传规律及Hardy-Weinberg平衡;2)分型、结果可靠,可重复性好;3)与同一染色体上 其他遗传标记等位基因无连锁;4)突变率低,观察杂合度较高,个人鉴别机率高;5)等位基 因数不宜太多,以5~12个为宜;6)可以构建等位基因Ladder,最好选择已有商品化等位 基因Ladder的位点。

    为了提高STR系统的个人鉴别机率,达到同一认定的结果,人们开始研究多个STR位点的复合 扩增并获得成功[25]。复合扩增的方法是将多个引物加入同一反应体系中。固定 dNRP、Mg++以及变性温度和循环次数,调节各引物浓度进行同步扩增。目前已有13个 STR位点的复合扩增。

    STR-PCR复合扩增技术的建立,大大地提高了STR系统的个人鉴别机率。Lins AM等[2 6]对12个位点进行了复合扩增,个人匹配机率(a matching probability,Pm)小于3.3 × 10-12。超过了Jeffreys报道的单个多位点探针得到的DNA指纹3×10-11 的匹配机率[27]。复合扩增可以从微量检材中获取大量的遗传信息,对法科学实 践有着极其重要的意义。
, 百拇医药
    迄今为止,复合扩增的方法已有:双位点复合扩增(duplexing)、3位点复合扩增(triplexin g)、4位点复合扩增(quadriplexing)、5位点复合扩增(pentaplexing)、6位点复合扩增(hex aplexing)、7位点复合扩增(heptapexing)、8位点复合扩增(octoplexing)、 9位点复合扩增、12及13位点复合扩增等(表3)。复合扩增产物的检测方法有两种:1.银染 。 该方法适用于几个扩增片段长度相互不重叠位点的复合扩增,成本低,检测位点不多,限于 2~3个;2.荧光染料标记。其方法是将引物用不同颜色的荧光染料标记,扩增产物用全自 动测序 仪或荧光检测仪观察结果,它适用于扩增片断长度相互重叠的位点。此种方法成本和仪器昂 贵。可测4个及4个以上位点的复合扩增。复合扩增的STR位点选择应注意的问 题有:1)避免选同一染色体的STR位点,以防基因连锁;2)各位点的等位基因数应尽量少于1 0 个;3)各位点单独扩增条件已成熟,杂合度好;4)各位点的扩增条件尽量接近;5)位点重复 单元以三、四核苷酸,片断长度以90~350为宜,且无1bp之差的等位基因;6)银染检测复合 扩增位点应有标准等位基因Ladder,以利判型。
, 百拇医药
    目前,STR系统复合扩增技术已成功应用于法科学中的个人识别及亲子鉴定。主要存在的问 题是:1)荧光检测方法费用高,仪器昂贵;2)对多个位点同时扩增,扩增条件只能是折中的 ,以致某些位点的扩增效率不高或出现非特异扩增带而影响判型。表3 部分STR复合扩增系统 复合扩

    增系统

    检测

    方法

    基因座

    参考

    文献

    双基因座

    银染

    vWA31/1,F13A1
, 百拇医药
    [25]

    3基因座

    银染

    CSF1PO,TPOX,TH01

    [28]

    4基因座

    荧光

    F13A01,FES/FPS,F13B,LPL

    [29]

    5基因座

    荧光

    D1S103,TH01,D21S11,D18S51,FGA
, 百拇医药
    [30]

    6基因座

    荧光

    D21S11,D19S253,D18S51,vWA31/A,TH01,FGA,AMGXA

    [31]

    8基因座

    荧光

    vWA31/A,TH01,FGA,D21S11,D18S51,D6S502,D20S85,AMGXA

    [32]

    9基因座

    荧光
, 百拇医药
    D3S1358,vWA,FGA,TH01,TPOX,CSF1PO,D5S818,D13S3 17,D7S820

    [33]

    13基因座

    荧光

    CSF1PO,TPOX,TH01,vWA,D16S539,D7S820,D3S1358,D 13S317,D5S818,D21S11,D8S1179,D18S51,FGA

    [34]

    注:AMGXA与性别有关,不属于STR位点。

    等位基因Ladder的构建 等位基因Ladder是目前STR位点正确 判型的主要保证 。标准的等位基因Ladder均经过测序确定其片段长度。目前,由于已有商品化等位基因Ladd er的位点有限,给STR位点在法科学中应用造成了极大的障碍,所以,构建各位点等位基因L adder是法医工作者的目标之一。在无商品化等位基因Ladder时,简单的等位基因Ladder的 构 建方法是:对某位点进行群体遗传学调查时,选出所观察到的等位基因扩增产物,1:1混合 ,电泳,通过计算机图像分析软件分析标准分子量参照物,计算出等位基因片段长度,用已 知相同片段进行核对,再以此混合样本作为标准参照物对未知样本的扩增产物进行判型。此 方法所构建的等位基因Ladder产量有限,准确性和可靠性也较差。阎威等[27]提 出将观察到的各等位基因片段的扩增产物等量混合,1:500~1000倍稀释后再扩增,得到等 位基因Ladder。该方法可大大提高等位基因Ladder产量,但同样存在准确性及可靠性较差的 缺点。而且二次扩增的PCR反应体系较难确立,常出现各等位基因扩增效率的不均衡,等位 基因缺失,甚至出现杂带较多而无法判型的现象。
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    目前认为,为确保等位基因Ladder片段长度及命名的准确性,构建的等位基因Ladder均应进 行DNA测序。随着现代科技的发展,商品化的等位基因Ladder将会越来越多,STR系统的应用 也将在法科学中越来越普及。

    (二)PCR-mtDNA测序技术

    线粒体(Mitochondria)是存在于真核细胞胞浆中的细胞器,现已证实一个细胞中线粒体的拷 贝数目超过1000个[36],因此,线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)分析 的灵敏 度要比核DNA高。无核细胞的检材(如毛干、指甲),只能检测mtDNA。研究证明,不同个体线 粒体非编码区的D环附近的mtDNA有着明显的序列差异[37,38]。用PCR法扩增 ,测序,可进行个人识别。mtDNA是母系遗传,1990年Orrego等[39]首次提出测 定人类mtDNA的序列进行母系单亲的亲子鉴定。他们对一400bp长的扩增片段进行测度,发现 白种群体中无关个体序列相同的机率为1/370。Sullivan[40]1991年首次将PCR- mtDNA测序技术用于法科学实践。他用PCR-荧光自动测序技术,将一被害人和其姐姐的mtDN A序列进行比较,结果完全一致,从而确定了尸源。此后,人们逐渐认识到mtDNA在法科学中 的 应用价值。美国军事病理研究所在1993年运用PCR-mtDNA测序技术对战死者进行尸源识别。1 99 7年,Savolainen等[41]用PCR-mtDNA测序技术分析家养狗毛干中线粒体DNA序列 。之后,他们对一起失窃案现场进行勘察发现两根狗的毛干与两嫌疑犯喂养的狗毛干进行 mtDNA对比分析,结果显示一嫌疑犯被排除,为案件侦破提供了有力的证据[42] ,显示了PCR-mtDNA测序技术在法科学生物检材检验中的应用价值。近几年,mtDNA已广泛 地应用于法科学实践[43,44]
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    PCR-mtDNA测序技术的优点是灵敏度高、结果准确、鉴别机率高及适用于毛干、指甲等无核 生物检材。缺点是成本及仪器昂贵、操作复杂、对操作人员的专业技术要求高。

    (三)其它

    PCR-SSCP单链构象多态性(single strand conformation polynerphism),它是由Orita等人 在1989年[45]最先发现。其检测方法的原理是长度相同的单链DNA,若碱基序列 不同的构象,在非变性胶中电泳可产生不同的迁移率而得以分离。PCR-SSCP技术已在法科学 中得到应用[46]。此外尚有PCR-MVR(minisatellitd variant repeat mapping,M VR)、PCR-ASO和Radom-PCR(randomly amplified polymorphic DNA)等DNA检测技术。

    三、现状与展望
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    在法科学领域中,DNA分析技术已广泛地应用于:1)强奸及强奸杀人案件;2)凶杀案现场生 物检材鉴定;3)碎尸案的同一认定;4)战争、飞机失事的尸源确定;5)亲子鉴定;6)性别鉴 定;7)连续犯罪的并案检验;8)交通事故肇事车辆鉴定等。越来越多的DNA证据被世界各地 法庭采纳,使之成为案件侦破和亲子鉴定的重要方法之一。

    DNA分析技术正在向标准化、测序化、计算机自动化和高鉴别机率方向发展。部分传统的法 医物证检验手段将渐被DNA分析技术取代。随着人类DNA序列研究的不断深入,DNA分析技术 将会在更大领域内得到应用。

    尽管DNA分析技术已成为法医物证检验的常规方法之一,由于各国家、地区之间技术力量、 实验室设备、测试技术以及遗传标记的统计方法的不同,同一样本检测结果不一样,对法医 DNA分析技术的应用产生了一定的负面影响。为解决此类问题,1994年、1997年国际法庭血 液遗传学会DNA委员会(The DNA Commision of the International Society of Forensic H aemogenetics,ISFH)提出了一系列DNA分型技术的标准[47,48],为法庭DNA 技术的标准化打下了基础。
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    法庭DNA分析技术的标准化包括两个方面:即操作标准化和操作程序标准化。操作技术标准 化是对技术设定标准,包括:标准操作步骤、分型结果的判定及各地区的群体遗传学资料等 。操作程序标准化是对实验室的法律规定和行业规定,包括样品检验的程序、实验室管理评 定和鉴定人员的资格考察等[49]。法庭DNA分析技术标准化,可使DNA的检测质量 得到保证,使所得结果有可比性,有利于跨地域作案和连续犯罪案件的侦破。

    罪犯DNA指纹数据库 罪犯DNA指纹数据库是将有犯罪记录(劳改人 员、劳教人员、吸贩毒人 员、收容审查人员等)的人进行DNA分析,其结果输入计算机。这样,在刑事案件侦破过程中 ,可对现场罪犯遗留的唾液(斑)、血(痕)、毛发、精斑等物证进行DNA检测,将检测结果与 罪犯DNA指纹数据库中的记录进行比对,从而快速查找犯罪嫌疑人。

    目前,美国等西方国家已建立起庞大的DNA指纹数据库,并在国家内各刑事侦破机构进行联 网,极大地提高了侦破效率,为跨地域作案的侦破提供了有力的支持。
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    综上所述,DNA分析技术已成为现今法科学生物检材检验的主要手段之一。随着法庭DNA分析 程序的规范和标准化,DNA分析在法科学应用中的地位将会得到进一步的加强。

    参考文献

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    收稿:1999-10-29

    修回:2000-01-30, 百拇医药