中国丙型肝炎患者中发现新的丙型肝炎病毒核苷酸序列
作者：陈元鼎 刘名英 李嘉琦 赵玮 彭梅 周曾全 余文霖 李惠琼 Sergio G.Tisminetzky,Francisco E.Baralle
单位：陈元鼎 刘名英 李嘉琦 赵玮 彭梅(中国医学科学院中国协和医科大学 医学生物学研究所，昆明 650107)；周曾全 余文霖 李惠琼(昆明市传染病医院，昆明 650041)；Sergio G.Tisminetzky,Francisco E.Baralle(International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology,34012-Trieste,Italy)
关键词：中国丙型肝炎患者；丙型肝炎病毒；5′端非编码区；核苷酸序列；缺失；插入；HCV核苷酸序列
中国病毒学000207 摘要：应用RT-PCR和DNA克隆重组技术，从中国云南地区丙型肝炎患者血清中克隆到3个丙型肝炎病毒(HCV)5′端非编码区(5′NCR)核苷酸序列。这3个序列分别来自3个不同的丙型肝炎患者。与国内外已发表的HCV原型株同源序列比较研究发现，这3个HCV 5′NCR序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或出现插入重复。在YS225-1 5′NCR序列-155～-174位之间，有18个核苷酸序列缺失；在YS203-4和YS242-1 5′NCR序列-55～-56位之间，分别有28个(YS203-4)和40个(YS242-1)核苷酸序列插入。这些插入序列(28个核苷酸)在其相邻部位已有存在，即为重复序列。YS242-1插入序列中有11个核苷酸出现两次重复。其它部位的核苷酸变异也同已知基因型的相应核苷酸变异有很大差异。结果表明，这3个序列是迄今为止国内外都未曾发现过的新的HCV核苷酸序列。
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中图分类号：R512.63 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0136-07
New Nucleotide Sequences of the 5′ Non-coding Region of Hepatitis C Virus Isolated from China
CHEN Yuan-ding,LIU Ming-ying,LI Jia-qi,ZHAO Wei,PENG Mei
(Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Kunming 650107,China)
, 百拇医药 ZHOU Zeng-quan,YU Wen-lin,LI Hui-qiong
(Kunming Infectious Diseases Hospital,Kunming,650041)
Sergio G.Tisminetzky,Francisco E.Baralle
(International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology,Trieste 34012,Italy)
Abstract:From the sera of 3 Chinese patients with hepatitis C,3 new nucleotide sequences of the 5′ non-coding region (5′NCR) of hepatitis C virus (HCV) were found using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and DNA recombinant and sequencing techniques.Comparing with previously published HCV corresponding sequences,these new sequences have some consecutive nucleotides deleted or inserted.Sequence YS225-1 has 18 nucleotides deletion between the original position 174～-155 compared with the corresponding sequence of the prototype,HCV-1 (gene 1a);while sequence YS203-4 and sequence YS242-1 respectively contain extra 28 nucleotides and 40 nucleotides insertion between the original position -56～-55.These nucleotides are the repeating sequences existing in the forward sense (original position -83～-56).In sequence YS242-1,there is a sequence containing 11 nuclotides (corresponding to the original position -76～-56) repeated twice.In addition,variations of the nucleotides among these sequences are quite different from that previously published.The findings showed that these sequences are new HCV 5′NCR sequences that have not been previously discovered.
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Key words:Chinese patients with hepatitis C;HCV 5′NCR;Nucleotide sequence;Deletion;Insertion;HCV nucleotide sequences
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)为单股正链RNA病毒，属黄病毒科(Flaviviridae)。HCV基因组为一条约9400个核苷酸长的单链RNA分子，只有一个开放读码框架结构，编码一个约3010氨基酸的前体多肽。在HCV基因组的5′端，有一个由长约340个核苷酸组成的区域，称为5′端非编码区(5′NCR)。自从1989年Choo等人[1]发现HCV基因组核苷酸序列后，世界各地都陆续报道了许多完整的或部分HCV核苷酸序列。迄今为止发现的所有HCV序列都证实HCV 5′NCR是HCV中最保守的区域，它与黄病毒科中其它成员中的相应序列在结构和功能上都有很大差别[2]。5′NCR核苷酸序列决定着HCV的复制和基因调控等生物学和免疫学功能。因此，它在HCV研究中具有重要的地位。
, 百拇医药
在对中国丙型肝炎患者中HCV基因组的研究中，我们发现了3个新的HCV 5′NCR序列。在这3个序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或重复出现。现将结果报道如下：
1 材料和方法
1.1 患者、血清样品及HCV-RNA的抽提
本研究中的患者均为中国人，临床诊断为慢性丙型肝炎患者。静脉采血后，用异硫氰酸胍-酚法[3]，从450μL血清中提取HCV RNA。RNA最后溶于45μL蒸馏水中。
1.2 引物合成
以已发表的HCV 5′NCR核苷酸序列[1]为模板，合成逆转录、扩增、克隆用寡核苷酸引物(上海Sangon Co.产品)。见表1。
, http://www.100md.com 表1 逆转录、扩增、克隆用寡核苷酸引物
Table 1 Primers for RT-PCR,amplification and cloning of PCR products 引物
Primers
寡核苷酸序列(5′-3′)
Sequence(5′-3′)
在5′NCR中的位置*
Positions in 5′NCR
For RT-PCR
AS-1:
5′-GTGCACGGTCTACGAGACCT-3′
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-21～-2
S-1:
5′-GCCATGGCGTTAGTATGAGT-3′
-260～-241
For amplification
AS-2:
5′-GGCACTCGCAAGCACCCTAT-3′
-46～-27
S-2:
5′-GTGCAGCCTCCAGGACCC-3′
-237～-221
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For cloning
AS-3:
5′-CGGGGAGCTCGCAAGCACCCTAT-3′
Sac I
S-3:
5′-GTCGTGGTACCTCCAGGACC-3′
Kpn I
*See reference 1
RT-PCR引物(表1中AS1和S-1)、扩增引物(表1中AS-2和S-2)寡核苷酸序列分别为原型病毒核苷酸序列[1]编码区上游第-21～-2和-260～-241位核苷酸与-46～-27和-237～-221位核苷酸。克隆引物(表1中AS-3和S-3)为克隆单一核苷酸序列用，其序列分别来源于扩增引物AS-2和S-2，仅在AS-2和S-2中引入了克隆酶切位点SacI和KpnI，以作克隆用。
, 百拇医药
1.3 HCV cDNA合成
HCV cDNA合成的方法详见文献[4]。简述如下：13μL pre-RT混合液[50mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,10mmol/L MgCl2,0.5mmol/L spermidine,10mmol/L DTT以及各1.25mmol/L dNTPs (Promega Biological Products Ltd.,Shanghai)和150ng引物AS-1]与2μL HCV RNA提取液(见步骤1)混匀。混合液在92℃ 30s变性，转冰上快速冷却后，加入5μL RT混合液[含20u RNasin，10u AMV逆转录酶(Promega)]，混匀后置42℃，60min。
1.4 PCR扩增
第一次PCR扩增：制备80μL PCR反应混合液[含50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl,pH9.0,2.5mmol/L MgCl2,0.1% Triton X-100,各150ng引物AS-1和S-1，各5mmol/L dNTPs,5u Taq DNA polymerase (Promega)]。将上述RT-反应混合液(20μL，见步骤3)加入PCR反应混合液。混匀后在PCR仪(Perkin-Elmer/Cetus,USA)上作第一次PCR扩增，条件为94℃，45s； 56℃,45s;72℃,45s；30个循环。
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第二次PCR扩增：取1μL第一次PCR扩增混合液，加入第二次PCR扩增混合液。第二次PCR扩增反应除使用内层扩增引物S-2和AS-2代替外层引物S-1和AS-1外，其余均同第一次PCR扩增反应。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色分析。
1.5 HCV-cDNA的克隆及序列测定
1.5.1 HCV-cDNA的克隆
第二次PCR扩增产物凝胶电泳检测阳性的血清样品，取其第一次PCR产物为模板，再进行第三次PCR扩增。第三次PCR扩增反应中，除使用克隆引物S-3和AS-3代替外层引物S-1和AS-1外，其余均同第一次PCR扩增反应。
第三次PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化，Kpn I和Sac I双酶切，制备酶切克隆片段，再将此片段克隆到pBluescript KS+/-(pBS)质粒DNA上，获得重组pBS-HCV质粒DNA(图1)。重组pBS-HCV质粒DNA经转化DH5α细胞并在LB培养液中培养扩增[5]后，最后进行核苷酸序列测定。
, 百拇医药
图1 HCV cDNA的克隆——重组pBS-HCV的构建
Fig.1 Construction of recombinant pBS-HCV:cloning of HCV 5′NCR cDNA
1.5.2 HCV-cDNA进行核苷酸序列测定
使用T7SequencingTM Kit(Pharmacia Biotech Inc.,USA)，按说明书对重组pBS-HCV中HCV-cDNA进行双脱氧核苷酸末端终止反应，进行序列测定。为将序列测定误差减至最小程度，测序反应中，使用与克隆扩增引物同一的AS-3和S-3，并作双向测定。
1.6 HCV-cDNA核苷酸序列分析
将已测定的HCV-cDNA序列，与国内外已发表的不同基因型代表株同源核苷酸序列进行比较，研究其核苷酸序列差异及可能的基因型。
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2 结果
运用双巢式RT-PCR扩增和基因工程技术，对来自中国丙型肝炎患者血清中的HCV基因组5′NCR第-220～-47位核苷酸序列进行逆转录、克隆和序列测定。从140多位患者血清样品获得的89个克隆中，发现了3个来自不同慢性丙型肝炎患者的HCV 5′NCR序列有多个核苷酸缺失或插入，见图2。在89个克隆序列中，有3个与YS242-1的序列完全一致；而序列YS204-1和YS225-2仅各发现一个克隆。
图2 中国丙型肝炎患者中分离到的HCV 5′NCR (YS203-4，YS225-1和YS242-1)序列分析
Fig.2 The new nucleotide sequences of HCV 5′NCR (YS203-4,YS225-1和YS242-1) isolated from Chinese patients:Comparison with previously published HCV sequences.Dashes indicate identity with sequence of HCV1 (top line).Nucleotide substitutions are indicated.Stars represent the nucleotides that not exist.Nucleotide numbering corresponds to that described for the prototype HCV1[1].The published sequences come from:ref.1 for HCV1 (genotype 1a);ref.5 for HCV-J (genotype 1b);ref 6 for HC-J6 (genotype 2a);ref.7 for HV-J8 (genotype 2b);and ref.8 for Eb1 (gneotype 3a).
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与国内外已发表的HCV 5′NCR核苷酸序列比较，本研究所发现的HCV 5′NCR核苷酸序列，在YS225-1 -174～-155位之间有18个核苷酸缺失；在YS203-4和YS242-1 -55～-56位之间，分别有28个和40个核苷酸插入。进一步分析结果表明，这些插入序列在其自身序列的相邻部位(自身序列-83～-56位)已有存在，即为重复序列。在YS242-1插入序列中有11个核苷酸序列(自身序列中-76～-56位，图中划底线部分)出现两次重复。YS242-1插入序列中的第一个核苷酸(T)为一新的碱基。此外，在同已知基因型的标准株HCV同源核苷酸序列进行的比较研究结果表明，如除去缺失或插入部分不考虑，其余的序列具有基因组1或基因组3的特征。YS203-4具有基因型1b(HCVJ)的特征，但其-93位核苷酸为A，-61位为G，则为1b型所没有；YS225-1虽具有基因组3的特征，但在其-139和-138位核苷酸AT，-70 位点为T，-61位点为G，则为基因组3所没有；YS242-1虽在-118位(A)和-95～-93位(TCA)具有基因组3的特征，但其它部位的变异与已知基因型3差别很大。特别是这3个新发现的序列中，-61位核苷酸均为G，这在国内外已报道的HCV序列中都未曾发现过。
, 百拇医药
3 讨论
在对中国丙型肝炎患者血清HCV 5′NCR核苷酸序列的研究中，发现了3个新的HCV 5′NCR核苷酸序列，同国内外已发现的HCV同源序列比较，它们的3′端方向存在多个寡核苷酸的缺失或插入，是迄今未曾发现过的序列。在YS203-4患者的同一份血清样品中，我们还测定了另外两个同源序列克隆，这两个克隆序列与本文报道中的(YS203-4)不一样，没有插入序列。而且，这两个序列的其它部分也与YS203-4有很大差异，它们分属基因型1和3(资料中未显示)。同样地，我们对来自YS225-1患者的同一份血清中的另外5个克隆进行了测定，发现这5个克隆序列与本文报道中的YS225-1序列也不一样，没有碱基序列的缺失，且都属于基因型3，但彼此之间也不一致。而在YS242-1患者的同一份血清样品中分离到的另外两个克隆的核苷酸序列则与本文报道中的YS242-1序列完全一致(资料中未显示)。为了减低测序中的误差，所有序列都进行了5′→3′和3′→5′双向测定，实验结果是真实可靠的。同一患者分离的不同HCV 5′NCR克隆存在不同的核苷酸序列，在我们进行的大量序列分析研究中也得到了证实(将在另文中报道)。
, 百拇医药
HCV 5′NCR是HCV基因组中最保守的区域。不同基因型HCV 5′NCR具有其特征性的核苷酸序列。各国已发现的HCV 5′NCR核苷酸序列比较研究结果表明，不同病毒株具有不同长度的5′NCR，但此区域内的核苷酸序列除少数基因型存在1个或2个碱基缺失或插入(如基因型6a[9.10])，绝大多数都是很保守的。本文报道的3个新核苷酸序列，与原型病毒株基因组比较位于5′NCR中第-221～-46位碱基之间，在其序列中有如此多的碱基缺失或插入，在国内外都不曾出现过。
HCV 5′NCR是一个非常保守的区域，它具有基因调控和决定病毒复制等功能，其核苷酸序列的差异可反映HCV的基因组结构和/或功能的变异，并由此可将不同HCV分离株分为不同基因型和亚型。5′NCR基因结构的显著变异，可能引起病毒分子生物学、分子流行病学、分子病理学及临床药物治疗和疫苗预防等诸多方面的重大差异。因此，5′NCR在HCV的基因分型、分子进化、基因调控、疫苗研制及药物治疗研究中具有十分重要的意义。
, 百拇医药
对本研究中所发现的新HCV 5′NCR的二级结构及其体外转录效率及分子流行病学的进一步研究，将有助于阐明其分子生物学和分子病毒学意义，以及病毒基因组进化机制。
International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology国际合作研究基金项目(CRP/CHN96-05);云南省国际合作研究基金项目(97C009)
陈元鼎(1959年-),男,云南昭通人,副研究员,博士后,研究方向为分子病毒学、分子病理学及病毒疫苗.
参考文献
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[2]Han JH,Shyamala V,Richman KH,et al.Characterization of the terminal regions of hepatitis C viral RNA:Identification of conserved sequences in the 5′ untranslated region and poly (A) tails at the 3′ end[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:1711～1715
[3]Chomozynski P and Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate phenol-chloroform extraction[J].Analytical Biochemistry,1987,162:156～159
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1999-03-08
1999-06-14, 百拇医药
单位：陈元鼎 刘名英 李嘉琦 赵玮 彭梅(中国医学科学院中国协和医科大学 医学生物学研究所，昆明 650107)；周曾全 余文霖 李惠琼(昆明市传染病医院，昆明 650041)；Sergio G.Tisminetzky,Francisco E.Baralle(International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology,34012-Trieste,Italy)
关键词：中国丙型肝炎患者；丙型肝炎病毒；5′端非编码区；核苷酸序列；缺失；插入；HCV核苷酸序列
中国病毒学000207 摘要：应用RT-PCR和DNA克隆重组技术，从中国云南地区丙型肝炎患者血清中克隆到3个丙型肝炎病毒(HCV)5′端非编码区(5′NCR)核苷酸序列。这3个序列分别来自3个不同的丙型肝炎患者。与国内外已发表的HCV原型株同源序列比较研究发现，这3个HCV 5′NCR序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或出现插入重复。在YS225-1 5′NCR序列-155～-174位之间，有18个核苷酸序列缺失；在YS203-4和YS242-1 5′NCR序列-55～-56位之间，分别有28个(YS203-4)和40个(YS242-1)核苷酸序列插入。这些插入序列(28个核苷酸)在其相邻部位已有存在，即为重复序列。YS242-1插入序列中有11个核苷酸出现两次重复。其它部位的核苷酸变异也同已知基因型的相应核苷酸变异有很大差异。结果表明，这3个序列是迄今为止国内外都未曾发现过的新的HCV核苷酸序列。
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中图分类号：R512.63 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0136-07
New Nucleotide Sequences of the 5′ Non-coding Region of Hepatitis C Virus Isolated from China
CHEN Yuan-ding,LIU Ming-ying,LI Jia-qi,ZHAO Wei,PENG Mei
(Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Kunming 650107,China)
, 百拇医药 ZHOU Zeng-quan,YU Wen-lin,LI Hui-qiong
(Kunming Infectious Diseases Hospital,Kunming,650041)
Sergio G.Tisminetzky,Francisco E.Baralle
(International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology,Trieste 34012,Italy)
Abstract:From the sera of 3 Chinese patients with hepatitis C,3 new nucleotide sequences of the 5′ non-coding region (5′NCR) of hepatitis C virus (HCV) were found using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and DNA recombinant and sequencing techniques.Comparing with previously published HCV corresponding sequences,these new sequences have some consecutive nucleotides deleted or inserted.Sequence YS225-1 has 18 nucleotides deletion between the original position 174～-155 compared with the corresponding sequence of the prototype,HCV-1 (gene 1a);while sequence YS203-4 and sequence YS242-1 respectively contain extra 28 nucleotides and 40 nucleotides insertion between the original position -56～-55.These nucleotides are the repeating sequences existing in the forward sense (original position -83～-56).In sequence YS242-1,there is a sequence containing 11 nuclotides (corresponding to the original position -76～-56) repeated twice.In addition,variations of the nucleotides among these sequences are quite different from that previously published.The findings showed that these sequences are new HCV 5′NCR sequences that have not been previously discovered.
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Key words:Chinese patients with hepatitis C;HCV 5′NCR;Nucleotide sequence;Deletion;Insertion;HCV nucleotide sequences
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)为单股正链RNA病毒，属黄病毒科(Flaviviridae)。HCV基因组为一条约9400个核苷酸长的单链RNA分子，只有一个开放读码框架结构，编码一个约3010氨基酸的前体多肽。在HCV基因组的5′端，有一个由长约340个核苷酸组成的区域，称为5′端非编码区(5′NCR)。自从1989年Choo等人[1]发现HCV基因组核苷酸序列后，世界各地都陆续报道了许多完整的或部分HCV核苷酸序列。迄今为止发现的所有HCV序列都证实HCV 5′NCR是HCV中最保守的区域，它与黄病毒科中其它成员中的相应序列在结构和功能上都有很大差别[2]。5′NCR核苷酸序列决定着HCV的复制和基因调控等生物学和免疫学功能。因此，它在HCV研究中具有重要的地位。
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在对中国丙型肝炎患者中HCV基因组的研究中，我们发现了3个新的HCV 5′NCR序列。在这3个序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或重复出现。现将结果报道如下：
1 材料和方法
1.1 患者、血清样品及HCV-RNA的抽提
本研究中的患者均为中国人，临床诊断为慢性丙型肝炎患者。静脉采血后，用异硫氰酸胍-酚法[3]，从450μL血清中提取HCV RNA。RNA最后溶于45μL蒸馏水中。
1.2 引物合成
以已发表的HCV 5′NCR核苷酸序列[1]为模板，合成逆转录、扩增、克隆用寡核苷酸引物(上海Sangon Co.产品)。见表1。
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Table 1 Primers for RT-PCR,amplification and cloning of PCR products 引物
Primers
寡核苷酸序列(5′-3′)
Sequence(5′-3′)
在5′NCR中的位置*
Positions in 5′NCR
For RT-PCR
AS-1:
5′-GTGCACGGTCTACGAGACCT-3′
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-21～-2
S-1:
5′-GCCATGGCGTTAGTATGAGT-3′
-260～-241
For amplification
AS-2:
5′-GGCACTCGCAAGCACCCTAT-3′
-46～-27
S-2:
5′-GTGCAGCCTCCAGGACCC-3′
-237～-221
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AS-3:
5′-CGGGGAGCTCGCAAGCACCCTAT-3′
Sac I
S-3:
5′-GTCGTGGTACCTCCAGGACC-3′
Kpn I
*See reference 1
RT-PCR引物(表1中AS1和S-1)、扩增引物(表1中AS-2和S-2)寡核苷酸序列分别为原型病毒核苷酸序列[1]编码区上游第-21～-2和-260～-241位核苷酸与-46～-27和-237～-221位核苷酸。克隆引物(表1中AS-3和S-3)为克隆单一核苷酸序列用，其序列分别来源于扩增引物AS-2和S-2，仅在AS-2和S-2中引入了克隆酶切位点SacI和KpnI，以作克隆用。
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1.3 HCV cDNA合成
HCV cDNA合成的方法详见文献[4]。简述如下：13μL pre-RT混合液[50mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,10mmol/L MgCl2,0.5mmol/L spermidine,10mmol/L DTT以及各1.25mmol/L dNTPs (Promega Biological Products Ltd.,Shanghai)和150ng引物AS-1]与2μL HCV RNA提取液(见步骤1)混匀。混合液在92℃ 30s变性，转冰上快速冷却后，加入5μL RT混合液[含20u RNasin，10u AMV逆转录酶(Promega)]，混匀后置42℃，60min。
1.4 PCR扩增
第一次PCR扩增：制备80μL PCR反应混合液[含50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl,pH9.0,2.5mmol/L MgCl2,0.1% Triton X-100,各150ng引物AS-1和S-1，各5mmol/L dNTPs,5u Taq DNA polymerase (Promega)]。将上述RT-反应混合液(20μL，见步骤3)加入PCR反应混合液。混匀后在PCR仪(Perkin-Elmer/Cetus,USA)上作第一次PCR扩增，条件为94℃，45s； 56℃,45s;72℃,45s；30个循环。
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第二次PCR扩增：取1μL第一次PCR扩增混合液，加入第二次PCR扩增混合液。第二次PCR扩增反应除使用内层扩增引物S-2和AS-2代替外层引物S-1和AS-1外，其余均同第一次PCR扩增反应。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色分析。
1.5 HCV-cDNA的克隆及序列测定
1.5.1 HCV-cDNA的克隆
第二次PCR扩增产物凝胶电泳检测阳性的血清样品，取其第一次PCR产物为模板，再进行第三次PCR扩增。第三次PCR扩增反应中，除使用克隆引物S-3和AS-3代替外层引物S-1和AS-1外，其余均同第一次PCR扩增反应。
第三次PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化，Kpn I和Sac I双酶切，制备酶切克隆片段，再将此片段克隆到pBluescript KS+/-(pBS)质粒DNA上，获得重组pBS-HCV质粒DNA(图1)。重组pBS-HCV质粒DNA经转化DH5α细胞并在LB培养液中培养扩增[5]后，最后进行核苷酸序列测定。
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图1 HCV cDNA的克隆——重组pBS-HCV的构建
Fig.1 Construction of recombinant pBS-HCV:cloning of HCV 5′NCR cDNA
1.5.2 HCV-cDNA进行核苷酸序列测定
使用T7SequencingTM Kit(Pharmacia Biotech Inc.,USA)，按说明书对重组pBS-HCV中HCV-cDNA进行双脱氧核苷酸末端终止反应，进行序列测定。为将序列测定误差减至最小程度，测序反应中，使用与克隆扩增引物同一的AS-3和S-3，并作双向测定。
1.6 HCV-cDNA核苷酸序列分析
将已测定的HCV-cDNA序列，与国内外已发表的不同基因型代表株同源核苷酸序列进行比较，研究其核苷酸序列差异及可能的基因型。
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2 结果
运用双巢式RT-PCR扩增和基因工程技术，对来自中国丙型肝炎患者血清中的HCV基因组5′NCR第-220～-47位核苷酸序列进行逆转录、克隆和序列测定。从140多位患者血清样品获得的89个克隆中，发现了3个来自不同慢性丙型肝炎患者的HCV 5′NCR序列有多个核苷酸缺失或插入，见图2。在89个克隆序列中，有3个与YS242-1的序列完全一致；而序列YS204-1和YS225-2仅各发现一个克隆。
图2 中国丙型肝炎患者中分离到的HCV 5′NCR (YS203-4，YS225-1和YS242-1)序列分析
Fig.2 The new nucleotide sequences of HCV 5′NCR (YS203-4,YS225-1和YS242-1) isolated from Chinese patients:Comparison with previously published HCV sequences.Dashes indicate identity with sequence of HCV1 (top line).Nucleotide substitutions are indicated.Stars represent the nucleotides that not exist.Nucleotide numbering corresponds to that described for the prototype HCV1[1].The published sequences come from:ref.1 for HCV1 (genotype 1a);ref.5 for HCV-J (genotype 1b);ref 6 for HC-J6 (genotype 2a);ref.7 for HV-J8 (genotype 2b);and ref.8 for Eb1 (gneotype 3a).
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与国内外已发表的HCV 5′NCR核苷酸序列比较，本研究所发现的HCV 5′NCR核苷酸序列，在YS225-1 -174～-155位之间有18个核苷酸缺失；在YS203-4和YS242-1 -55～-56位之间，分别有28个和40个核苷酸插入。进一步分析结果表明，这些插入序列在其自身序列的相邻部位(自身序列-83～-56位)已有存在，即为重复序列。在YS242-1插入序列中有11个核苷酸序列(自身序列中-76～-56位，图中划底线部分)出现两次重复。YS242-1插入序列中的第一个核苷酸(T)为一新的碱基。此外，在同已知基因型的标准株HCV同源核苷酸序列进行的比较研究结果表明，如除去缺失或插入部分不考虑，其余的序列具有基因组1或基因组3的特征。YS203-4具有基因型1b(HCVJ)的特征，但其-93位核苷酸为A，-61位为G，则为1b型所没有；YS225-1虽具有基因组3的特征，但在其-139和-138位核苷酸AT，-70 位点为T，-61位点为G，则为基因组3所没有；YS242-1虽在-118位(A)和-95～-93位(TCA)具有基因组3的特征，但其它部位的变异与已知基因型3差别很大。特别是这3个新发现的序列中，-61位核苷酸均为G，这在国内外已报道的HCV序列中都未曾发现过。
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3 讨论
在对中国丙型肝炎患者血清HCV 5′NCR核苷酸序列的研究中，发现了3个新的HCV 5′NCR核苷酸序列，同国内外已发现的HCV同源序列比较，它们的3′端方向存在多个寡核苷酸的缺失或插入，是迄今未曾发现过的序列。在YS203-4患者的同一份血清样品中，我们还测定了另外两个同源序列克隆，这两个克隆序列与本文报道中的(YS203-4)不一样，没有插入序列。而且，这两个序列的其它部分也与YS203-4有很大差异，它们分属基因型1和3(资料中未显示)。同样地，我们对来自YS225-1患者的同一份血清中的另外5个克隆进行了测定，发现这5个克隆序列与本文报道中的YS225-1序列也不一样，没有碱基序列的缺失，且都属于基因型3，但彼此之间也不一致。而在YS242-1患者的同一份血清样品中分离到的另外两个克隆的核苷酸序列则与本文报道中的YS242-1序列完全一致(资料中未显示)。为了减低测序中的误差，所有序列都进行了5′→3′和3′→5′双向测定，实验结果是真实可靠的。同一患者分离的不同HCV 5′NCR克隆存在不同的核苷酸序列，在我们进行的大量序列分析研究中也得到了证实(将在另文中报道)。
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HCV 5′NCR是HCV基因组中最保守的区域。不同基因型HCV 5′NCR具有其特征性的核苷酸序列。各国已发现的HCV 5′NCR核苷酸序列比较研究结果表明，不同病毒株具有不同长度的5′NCR，但此区域内的核苷酸序列除少数基因型存在1个或2个碱基缺失或插入(如基因型6a[9.10])，绝大多数都是很保守的。本文报道的3个新核苷酸序列，与原型病毒株基因组比较位于5′NCR中第-221～-46位碱基之间，在其序列中有如此多的碱基缺失或插入，在国内外都不曾出现过。
HCV 5′NCR是一个非常保守的区域，它具有基因调控和决定病毒复制等功能，其核苷酸序列的差异可反映HCV的基因组结构和/或功能的变异，并由此可将不同HCV分离株分为不同基因型和亚型。5′NCR基因结构的显著变异，可能引起病毒分子生物学、分子流行病学、分子病理学及临床药物治疗和疫苗预防等诸多方面的重大差异。因此，5′NCR在HCV的基因分型、分子进化、基因调控、疫苗研制及药物治疗研究中具有十分重要的意义。
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对本研究中所发现的新HCV 5′NCR的二级结构及其体外转录效率及分子流行病学的进一步研究，将有助于阐明其分子生物学和分子病毒学意义，以及病毒基因组进化机制。
International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology国际合作研究基金项目(CRP/CHN96-05);云南省国际合作研究基金项目(97C009)
陈元鼎(1959年-),男,云南昭通人,副研究员,博士后,研究方向为分子病毒学、分子病理学及病毒疫苗.
参考文献
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1999-03-08
1999-06-14, 百拇医药