口腔粘膜鳞癌和癌前病变p53、ras基因突变的检测及p53、p21蛋白的表达
作者：李海如 郑健 袁苏娟
单位：李海如(江苏省盐城市第一人民医院 224001)；郑健(江苏省盐城市第一人民医院 224001)；袁苏娟(江苏省盐城市第一人民医院 224001)
关键词：口腔粘膜鳞癌；癌前病变；p53基因；ras基因；基因突变
口腔颌面外科杂志000211 摘 要：目的 探讨p53、ras基因改变在口腔粘膜鳞癌及癌前病变发生过程中的意义。方法 应用聚合酶链反应和免疫组织化学法检测23例口腔粘膜鳞癌和15例癌前病变p53、ras基因突变和p53、p21蛋白的表达。结果 43.5%(10/23)的口腔粘膜鳞癌存在p53基因第8外显子突变，47.8%(11/23)ras基因有突变；口腔粘膜鳞癌p53、p21蛋白表达阳性率分别为43.5%(10/23)和60.9%(14/23)。癌前病变有1例存在p53基因第8外显子和ras基因突变(6.7%)；p53、p21蛋白表达阳性率分别为13.3%(2/15)和20%(3/15)。两组间差异显著(P<0.05)。结论 p53、ras基因突变和p53、p21蛋白过量表达与口腔粘膜鳞癌的发生过程密切相关，可作为癌前病变发展为癌危险性的生物指标。
, 百拇医药
中图分类号：R739.8 文献标识码：A 文章编号：1005-4979(2000)02-0131-03
DETECTION OF p53、RAS GENES MUTATION AND p53、p21 PROTEINS EXPRESSION IN SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF ORAL MUCOSA AND PRECANCEROUS LESION
LI Hai-ru, ZHENG Jian, Yuang Su-juan
Department of Stomatology, Yancheng First Hospital, Yancheng 224001
Abstract： Objective In order to find the significance of p53、ras genes change in the development of squamous cell carcinoma of oral mucosa and precancerous lesion.Method PCR and immunohistochemical methods were used to study p53、ras genes mutation and p53、p21 preteins expression in 23 samples with carcinoma of oral mucosa and 15 samples with precancerous lesion.Results Sequenceing of exon 8, revealed p53 gene muation in 10 of 23 specimens (43.5%) and ras gene mutation in 11 of 23 specimens (47.8%) in oral carcinoma; the expression of p53 and p21 proteins positive rates were 43.5%(10/23) and 60.9%(14/23) respectively. The rate of mutation in exon 8 of p53 gene and ras gene with precancerous lesion were 6.7%(1/15) and 6.7%(1/15); the p53 and p21 proteins positive rates were 13.3%(2/15) and 20% (3/15) respectively. There was statistically significance between the squamous cell carcinoma of oral mucosa and precancerous lesion (P<0.05). Conclusion There is closely relation between the development of squamous cell carcinoma of oral mucosa and p53、ras genes mutation. p53、p21 proteins overexpression is regarded as a biological index of transfroming precancerous lesion into cancinoma dangerously.
, 百拇医药
Key words： Squamous cell carcinoma of oral mucosa; Precancerous lesion; p53 gene; Ras gene; Mutation
应用聚合酶链反应(PCR)和免疫组织化学法对口腔粘膜鳞癌和癌前病变p53、ras基因的突变及p53、p21蛋白的表达进行了研究，初步探讨了基因的改变在口腔粘膜鳞癌及癌前病变发生过程中的意义。
1 材料和方法
1.1 材料
随机选择在我院保存并经病理证实的口腔粘膜鳞癌23例(男14例，女9例，年龄36～78岁，平均57.7岁；临床Ⅰ期7例，Ⅱ期6例，Ⅲ期7例，Ⅳ期3例；其中颊癌10例，舌癌8例，牙龈癌3例，腭癌1例，唇癌1例)、癌前病变15例(男8例，女7例，年龄39～79岁，平均56.1岁；其中舌部6例，颊部5例，牙龈2例，腭部1例，唇部1例)的石腊标本。
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1.2 p53、ras基因的PCR扩增
用病理切片刀将每例石蜡标本切取5μm厚蜡屑2～4片，置于1.5ml离心管中，切片时注意严格清洁切片刀，防止标本间DNA污染。将蜡屑用二甲苯脱蜡，乙醇洗涤后，用干净玻璃棒捣碎，加200μl去离子蒸馏水制成混悬液。采用PCR试剂盒(上海复华生物医学工程有限公司)扩增p53基因7、8外显子和ras基因。以2μl混悬液做模板，加入PCR反应液及1μl DNA多聚酶，离心数秒后置PCR循环仪扩增，p53基因循环参数；94°C 保温40s，94°C 30s，63°C 45s，72°C 30s，循环32周期，72°C 保温5min。ras基因循环参数：94°C 保温4min，94°C 60s，55°C 60s，72°C 90s，循环40周期，72°C 保温4min。然后取10μl扩增产物加2μl溴酚蓝走3%琼脂糖凝胶电泳紫外透射仪上观察结果。
1.3 免疫组织化学染色
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将石蜡标本切成4μm厚组织片，采用p53单克隆抗体D0-7、p21单克隆抗体F132和S-P免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。按下列程序操作：切片脱蜡水化，3%H2O2处理灭活内源性过氧化物酶，置柠檬酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH=6.0)中微波加热至沸点(2×10min)；50μl非免疫性动物血清温育5min；加50μlD0-7和F132，湿盒中4°C过夜；加50μl生物素标记兔抗鼠抗体温育10min；加50μl链亲和素——过氧化物酶溶液温育10min，DAB溶液显色3～10min，苏木素浅染，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，封片，光学显微镜观察阳性细胞。p53定位于胞核：不染色0分，浅棕色1分，棕黄色2分，褐色3分；p21定位于胞浆：不着色0分，黄色1分，深黄色2分，棕黄色3分。阳性细胞比例：不染色为0分，<20%为1分，20%～50%为2分，≥50%为3分。以上二项相加0分为(-)，2分为(+)，3～4分为(++)，5～6分为(+++)。
1.4 统计学分析：所有资料均进行χ2检验。
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2 结果
2.1 p53、ras基因PCR扩增结果的分析
23例口腔粘膜鳞癌组织中，有10例p53基因第8外显子在200bp位点上(43.5%)和11例ras基因120bp位点上(47.8%)有突变；其中10例p53基因和ras基因同时突变，1例只有ras基因突变。15例癌前病变组织中有1例p53基因第8外显子200bp位点上的ras基因120bp位点上同时有突变(6.7%)。两组间p53基因第8外显子和ras基因的突变均有显著性差异(χ2=4.326,P<0.05和χ2=5.341,P<0.05)。p53基因第7外显子检测两组均无突变。
2.2 免疫组织化学染色结果分析(见附表)
23例口腔粘膜鳞癌组织中，10例p53蛋白(43.5%)和14例p21蛋白(60.9%)呈阳性反应；其中10例p53基因和11例ras基因突变者p53蛋白及p21蛋白均呈阳性反应。15例癌前病变组织中，2例p53蛋白(13.3%)和3例p21蛋白(20%)呈阳性反应；其中1例p53基因和ras基因突变者p53蛋白和p21蛋白呈阳性反应。两组间差异显著(χ2=5.341，P<0.05和χ2=4.592,P<0.05)。
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附表 口腔粘膜鳞癌和癌前病变p53、p21蛋白表达结果(例数) 组别
例数
p53
p21
-
+
++
+++
-
+
++
+++
口腔粘膜鳞癌
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23
13
4
3
3
9
4
4
6
癌前病变
15
13
2
0
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0
12
3
0
0
2.3 p53和ras基因同时突变的临床分析
p53基因和ras基因同时突变的临床10例中，临床Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期3例，Ⅳ期3例，仅ras基因突变的1例为临床Ⅰ期；p53蛋白和p21蛋白同时阳性反应的10例与上述基因突变的一致，仅p21蛋白阳性的4例中，临床Ⅰ期1例，Ⅱ期2例，Ⅲ期1例。p53基因和ras基因同时突变并且p53蛋白和p21蛋白同时阳性反应的10例中舌癌4例，颊癌4例，牙龈癌1例，腭癌1例；ras基因突变和p21蛋白阳性反应同时存在的为舌癌1例，仅p21蛋白阳性反应的为颊癌1例，牙龈癌1例，唇癌1例。
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3 讨论
ras癌基因被认为在细胞恶变过程中起着引发作用，是肿瘤发生的“启动基因”[1]。ras基因的活化及致癌作用必须有其它癌基因及抑癌基因的协同作用。ras基因突变激活及多个抑制基因(如p53等)的突变与癌的发生有密切关系，尤其是抑癌基因的失活更为重要[2]。本组对23例口腔粘膜鳞癌和15例癌前病变组织进行p53、ras基因PCR扩增。结果口腔粘膜鳞癌组织中p53基因有突变的为43.5%(10/23)，ras基因的突变为47.8%(11/23)。免疫组织化学染色显示口腔粘膜鳞癌组织中p53蛋白有43.5%(10/23)的过量表达，p21蛋白有60.9%(14/23)的过量表达，与文献报道相似[3～5]。说明在口腔粘膜鳞癌发生过程中存在着p53、ras基因的突变，而这种突变均有促癌效应，尤其是突变型p53基因不仅失去抑制肿瘤基因的作用，而且还能变为一种肿瘤基因，刺激细胞分裂，促使肿瘤细胞生长。因此，p53、ras基因结构的改变及表达异常与口腔粘膜鳞癌的发生密切相关。同时，本组癌前病变组织中1例p53、ras基因突变，2例p53蛋白、3例p21蛋白出现过量表达，与口腔鳞癌间有显著差异(P<0.05)，表明癌前病变其遗传机制已部分恶变[4]，但未发展到癌，其遗传本质与癌仍有一定差异。说明口腔粘膜癌变是一个渐变的发展过程，是一个从量的积累到质的突变的过程。因此，p53、ras基因的突变可作为评价口腔癌前病变发展为癌危险性的生物指标，对口腔癌前病变的发展趋势进行准确的预测并及早采取根治措施。
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本文校对：史宏男
作者简介： 李海如(1963-)，男，江苏盐城市人，副主任医师
参考文献：
[1] Barbacid M. ras genes [J]. Ann Rev Biochem, 1987, 56:776.
[2] Vogelstein B. Agenetic model for coloredtal tumorigenesis [J]. Cell, 1990, 61:759.
[3] 陈建钢，Yeudell WA.抑癌基因p53蛋白在口腔鳞癌和癌前病损中的表达[J].口腔医学，1998，15：179.
[4] 张文建，李辉CC2F，范崇德，等.口腔白斑和鳞癌p53基因突变的PCR-SSCP分析[J].临床口腔医学杂志，1998，14：97.
[5] Ogden GR, Kiddie RA, Lunny DP, et al. Assessment of p53 protein expression in normal, benign, and malignant oral mucosa [J]. J Pathol, 1992, 166:389.
收稿日期：1999-04-07, http://www.100md.com
单位：李海如(江苏省盐城市第一人民医院 224001)；郑健(江苏省盐城市第一人民医院 224001)；袁苏娟(江苏省盐城市第一人民医院 224001)
关键词：口腔粘膜鳞癌；癌前病变；p53基因；ras基因；基因突变
口腔颌面外科杂志000211 摘 要：目的 探讨p53、ras基因改变在口腔粘膜鳞癌及癌前病变发生过程中的意义。方法 应用聚合酶链反应和免疫组织化学法检测23例口腔粘膜鳞癌和15例癌前病变p53、ras基因突变和p53、p21蛋白的表达。结果 43.5%(10/23)的口腔粘膜鳞癌存在p53基因第8外显子突变，47.8%(11/23)ras基因有突变；口腔粘膜鳞癌p53、p21蛋白表达阳性率分别为43.5%(10/23)和60.9%(14/23)。癌前病变有1例存在p53基因第8外显子和ras基因突变(6.7%)；p53、p21蛋白表达阳性率分别为13.3%(2/15)和20%(3/15)。两组间差异显著(P<0.05)。结论 p53、ras基因突变和p53、p21蛋白过量表达与口腔粘膜鳞癌的发生过程密切相关，可作为癌前病变发展为癌危险性的生物指标。
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中图分类号：R739.8 文献标识码：A 文章编号：1005-4979(2000)02-0131-03
DETECTION OF p53、RAS GENES MUTATION AND p53、p21 PROTEINS EXPRESSION IN SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF ORAL MUCOSA AND PRECANCEROUS LESION
LI Hai-ru, ZHENG Jian, Yuang Su-juan
Department of Stomatology, Yancheng First Hospital, Yancheng 224001
Abstract： Objective In order to find the significance of p53、ras genes change in the development of squamous cell carcinoma of oral mucosa and precancerous lesion.Method PCR and immunohistochemical methods were used to study p53、ras genes mutation and p53、p21 preteins expression in 23 samples with carcinoma of oral mucosa and 15 samples with precancerous lesion.Results Sequenceing of exon 8, revealed p53 gene muation in 10 of 23 specimens (43.5%) and ras gene mutation in 11 of 23 specimens (47.8%) in oral carcinoma; the expression of p53 and p21 proteins positive rates were 43.5%(10/23) and 60.9%(14/23) respectively. The rate of mutation in exon 8 of p53 gene and ras gene with precancerous lesion were 6.7%(1/15) and 6.7%(1/15); the p53 and p21 proteins positive rates were 13.3%(2/15) and 20% (3/15) respectively. There was statistically significance between the squamous cell carcinoma of oral mucosa and precancerous lesion (P<0.05). Conclusion There is closely relation between the development of squamous cell carcinoma of oral mucosa and p53、ras genes mutation. p53、p21 proteins overexpression is regarded as a biological index of transfroming precancerous lesion into cancinoma dangerously.
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Key words： Squamous cell carcinoma of oral mucosa; Precancerous lesion; p53 gene; Ras gene; Mutation
应用聚合酶链反应(PCR)和免疫组织化学法对口腔粘膜鳞癌和癌前病变p53、ras基因的突变及p53、p21蛋白的表达进行了研究，初步探讨了基因的改变在口腔粘膜鳞癌及癌前病变发生过程中的意义。
1 材料和方法
1.1 材料
随机选择在我院保存并经病理证实的口腔粘膜鳞癌23例(男14例，女9例，年龄36～78岁，平均57.7岁；临床Ⅰ期7例，Ⅱ期6例，Ⅲ期7例，Ⅳ期3例；其中颊癌10例，舌癌8例，牙龈癌3例，腭癌1例，唇癌1例)、癌前病变15例(男8例，女7例，年龄39～79岁，平均56.1岁；其中舌部6例，颊部5例，牙龈2例，腭部1例，唇部1例)的石腊标本。
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1.2 p53、ras基因的PCR扩增
用病理切片刀将每例石蜡标本切取5μm厚蜡屑2～4片，置于1.5ml离心管中，切片时注意严格清洁切片刀，防止标本间DNA污染。将蜡屑用二甲苯脱蜡，乙醇洗涤后，用干净玻璃棒捣碎，加200μl去离子蒸馏水制成混悬液。采用PCR试剂盒(上海复华生物医学工程有限公司)扩增p53基因7、8外显子和ras基因。以2μl混悬液做模板，加入PCR反应液及1μl DNA多聚酶，离心数秒后置PCR循环仪扩增，p53基因循环参数；94°C 保温40s，94°C 30s，63°C 45s，72°C 30s，循环32周期，72°C 保温5min。ras基因循环参数：94°C 保温4min，94°C 60s，55°C 60s，72°C 90s，循环40周期，72°C 保温4min。然后取10μl扩增产物加2μl溴酚蓝走3%琼脂糖凝胶电泳紫外透射仪上观察结果。
1.3 免疫组织化学染色
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将石蜡标本切成4μm厚组织片，采用p53单克隆抗体D0-7、p21单克隆抗体F132和S-P免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。按下列程序操作：切片脱蜡水化，3%H2O2处理灭活内源性过氧化物酶，置柠檬酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH=6.0)中微波加热至沸点(2×10min)；50μl非免疫性动物血清温育5min；加50μlD0-7和F132，湿盒中4°C过夜；加50μl生物素标记兔抗鼠抗体温育10min；加50μl链亲和素——过氧化物酶溶液温育10min，DAB溶液显色3～10min，苏木素浅染，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，封片，光学显微镜观察阳性细胞。p53定位于胞核：不染色0分，浅棕色1分，棕黄色2分，褐色3分；p21定位于胞浆：不着色0分，黄色1分，深黄色2分，棕黄色3分。阳性细胞比例：不染色为0分，<20%为1分，20%～50%为2分，≥50%为3分。以上二项相加0分为(-)，2分为(+)，3～4分为(++)，5～6分为(+++)。
1.4 统计学分析：所有资料均进行χ2检验。
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2 结果
2.1 p53、ras基因PCR扩增结果的分析
23例口腔粘膜鳞癌组织中，有10例p53基因第8外显子在200bp位点上(43.5%)和11例ras基因120bp位点上(47.8%)有突变；其中10例p53基因和ras基因同时突变，1例只有ras基因突变。15例癌前病变组织中有1例p53基因第8外显子200bp位点上的ras基因120bp位点上同时有突变(6.7%)。两组间p53基因第8外显子和ras基因的突变均有显著性差异(χ2=4.326,P<0.05和χ2=5.341,P<0.05)。p53基因第7外显子检测两组均无突变。
2.2 免疫组织化学染色结果分析(见附表)
23例口腔粘膜鳞癌组织中，10例p53蛋白(43.5%)和14例p21蛋白(60.9%)呈阳性反应；其中10例p53基因和11例ras基因突变者p53蛋白及p21蛋白均呈阳性反应。15例癌前病变组织中，2例p53蛋白(13.3%)和3例p21蛋白(20%)呈阳性反应；其中1例p53基因和ras基因突变者p53蛋白和p21蛋白呈阳性反应。两组间差异显著(χ2=5.341，P<0.05和χ2=4.592,P<0.05)。
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附表 口腔粘膜鳞癌和癌前病变p53、p21蛋白表达结果(例数) 组别
例数
p53
p21
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口腔粘膜鳞癌
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23
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癌前病变
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2.3 p53和ras基因同时突变的临床分析
p53基因和ras基因同时突变的临床10例中，临床Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期3例，Ⅳ期3例，仅ras基因突变的1例为临床Ⅰ期；p53蛋白和p21蛋白同时阳性反应的10例与上述基因突变的一致，仅p21蛋白阳性的4例中，临床Ⅰ期1例，Ⅱ期2例，Ⅲ期1例。p53基因和ras基因同时突变并且p53蛋白和p21蛋白同时阳性反应的10例中舌癌4例，颊癌4例，牙龈癌1例，腭癌1例；ras基因突变和p21蛋白阳性反应同时存在的为舌癌1例，仅p21蛋白阳性反应的为颊癌1例，牙龈癌1例，唇癌1例。
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3 讨论
ras癌基因被认为在细胞恶变过程中起着引发作用，是肿瘤发生的“启动基因”[1]。ras基因的活化及致癌作用必须有其它癌基因及抑癌基因的协同作用。ras基因突变激活及多个抑制基因(如p53等)的突变与癌的发生有密切关系，尤其是抑癌基因的失活更为重要[2]。本组对23例口腔粘膜鳞癌和15例癌前病变组织进行p53、ras基因PCR扩增。结果口腔粘膜鳞癌组织中p53基因有突变的为43.5%(10/23)，ras基因的突变为47.8%(11/23)。免疫组织化学染色显示口腔粘膜鳞癌组织中p53蛋白有43.5%(10/23)的过量表达，p21蛋白有60.9%(14/23)的过量表达，与文献报道相似[3～5]。说明在口腔粘膜鳞癌发生过程中存在着p53、ras基因的突变，而这种突变均有促癌效应，尤其是突变型p53基因不仅失去抑制肿瘤基因的作用，而且还能变为一种肿瘤基因，刺激细胞分裂，促使肿瘤细胞生长。因此，p53、ras基因结构的改变及表达异常与口腔粘膜鳞癌的发生密切相关。同时，本组癌前病变组织中1例p53、ras基因突变，2例p53蛋白、3例p21蛋白出现过量表达，与口腔鳞癌间有显著差异(P<0.05)，表明癌前病变其遗传机制已部分恶变[4]，但未发展到癌，其遗传本质与癌仍有一定差异。说明口腔粘膜癌变是一个渐变的发展过程，是一个从量的积累到质的突变的过程。因此，p53、ras基因的突变可作为评价口腔癌前病变发展为癌危险性的生物指标，对口腔癌前病变的发展趋势进行准确的预测并及早采取根治措施。
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作者简介： 李海如(1963-)，男，江苏盐城市人，副主任医师
参考文献：
[1] Barbacid M. ras genes [J]. Ann Rev Biochem, 1987, 56:776.
[2] Vogelstein B. Agenetic model for coloredtal tumorigenesis [J]. Cell, 1990, 61:759.
[3] 陈建钢，Yeudell WA.抑癌基因p53蛋白在口腔鳞癌和癌前病损中的表达[J].口腔医学，1998，15：179.
[4] 张文建，李辉CC2F，范崇德，等.口腔白斑和鳞癌p53基因突变的PCR-SSCP分析[J].临床口腔医学杂志，1998，14：97.
[5] Ogden GR, Kiddie RA, Lunny DP, et al. Assessment of p53 protein expression in normal, benign, and malignant oral mucosa [J]. J Pathol, 1992, 166:389.
收稿日期：1999-04-07, http://www.100md.com