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编号:10244229
小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDNA克隆
http://www.100md.com 《牙体牙髓牙周病学杂志》 2000年第2期
     作者:顾淑萍 郝建军 史俊南 费俭 王丽珍 吴补领 肖明振 刘正 江卫民

    单位:史俊南(第四军医大学口腔医学院, 陕西 西安 710032);吴补领(第四军医大学口腔医学院, 陕西 西安 710032)肖明振(第四军医大学口腔医学院, 陕西 西安 710032);刘正(第四军医大学口腔医学院, 陕西 西安 710032);费俭(中科院上海细胞 生物学研究所基因工程组,上海 200031);王丽珍(上海第二医科大学口腔医学院,上 海 200011);(江卫民上海第二医科大学口腔医学院,上 海 200011)

    关键词:釉丛蛋白; cDNA; 聚合酶链反应; 小鼠

    牙体牙髓牙周病学杂志000201 【摘 要】 目的:克隆小鼠釉丛蛋白(tuftelin)成 熟肽编码区基因。方法:设计引物,以小 鼠牙胚cDNA文库为模板,利用PCR方法,扩增出小鼠釉丛蛋白成熟区的基因片段(约1200bp) ,将所得基因片段插入pBS质粒载体,转化到大肠杆菌XL-1-Blue后挑选阳性克隆,提取重组 质粒DNA,通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果:重组质粒pBS-tuftelin的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结 论:克隆到小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区基因。
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    【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A

    【文章编号】 1005-2593(20 00)02-0059-02

    Cloning of mouse tuftelin encoding mature protein

    GU Shu-ping, HAO Jian-jun, SHI Jun-nan, et al

    (School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)

    【Abstract】 AIM: Cloning and partially sequencing of m ouse tuftelin encoding m ature protein. METHODS: The desired DNA pr oduct was obtained from the mouse dental germ cDNA library by PCR with two gene specific primers. The s egment (about 1200 bp) was inserted into pBluescript vector, and the interestin g plasmid was transformed into E. Coli host strain XL-1-Blue. The double-strande d DNA of the positive clone was analyzed by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing. RESULTS: The restriction endonuclease map and sequence of mouse tuftelin encoding mature protein were consistent with thos e of the references appeared. CONCLUSION: The mouse tuftel in cDNA encoding mature protein was obtained for further study.
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    【Key Words】 tuftelin; cDNA; PCR; mouse

    成熟釉质中无机物占总重量的98%以上,是人体组织中矿 化程度最高的 组织。但发育中的釉质富含蛋白质和水,釉质基质蛋白可分为两大类:疏水的釉原蛋白(amel ogenin,AMG),占90%,是发育中釉质基质蛋白的主要成分,在釉质矿化和成熟中起着控制 矿 化晶体的大小和形态的作用[1]。而酸性釉蛋白(enamelin),占10%,包括釉丛蛋 白 (tuftelin)、成釉蛋白(ameloblastin)等,在釉质矿化起始阶段起到矿化结晶成核的作用 [2]。本组采用PCR技术克隆小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDNA,为表达该蛋白和研究 其生物学效 应打下基础。

    1 材料和方法

    1.1 PCR扩增和cDNA合成
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    根据MacDougall等[3]报道的小鼠tuftelin的cDNA序列,采用PCGENE设计PCR扩 增的两条引物:

    5' GACCTCCGCGTGAAGATGAACG

    3' AGGACTGAGGCAACTGCAACGG

    以BALB-C小鼠牙胚cDNA文库为模板,PCR扩增出小鼠tuftelin成熟肽基因片段 (美国MJ Research 公司PTC—150型PCR仪)。Taq Plus II DNA聚合酶购于Sangon公司。

    1.2 PCR产物的克隆及酶谱分析

    用Klenow片段(Promega公司)补平PCR产物,对载体质粒pBS用SmaI酶切消化,将 补平的P CR产物以及经SmaI消化的pBS(pBluescript II KS) 共同在10g/L低熔点琼脂糖凝胶 上电泳回收,平端连接目的基因和载体,转化大肠杆菌XL-1-Blue,蓝白斑筛选阳性克隆p BS-tuftelin。碱裂解法提取重组质粒DNA。用EcoRI单酶切和XhoI,BamHI双 酶切以及PC R鉴定筛选到的阳性克隆。
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    1.3 核苷酸序列分析

    用M13-20 Primer 为引物对克隆的tuftelin基因进行测序(Pharmacia T7 Sequence Kit )。

    2 结果

    2.1 PCR产物以及pBS-tuftelin重组质粒鉴定结果(图1)

    图1:PCR产物tuftelin以及pBS-tuftelin重组质粒鉴定结果

    1:Marker (λDNA经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切)

    2:载体质粒pBS(2.9kb)

    3:目的产物tuftelin(1.2kb)
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    4:重组质粒pBS-tuftelin(4.1kb)

    5:pBS-tuftelin经EcoRⅠ酶切(3.8kb, 0.3kb)

    6:pBS-tuftelin经XholⅠ,BamHⅠ双酶切(2.9kb, 1.2kb)

    7:以pBS-tuftelin为模板的tuftelin PCR 产物(1.2kb)

    8:阴性对照(未加pBS-tuftelin模板)

    9: Marker (λDNA经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切)

    从小鼠牙胚cDNA文库可扩增出大小约1.2kb的产物(3道),将此DNA片段插入 pBS后所 得重组质粒的大小约4.1kb(4道)。重组质粒经EcoRI单酶切后为两条带:3.8kb和0.3k b( 5道);经XhoI和BamHI双酶切后为两条带(6道):2.9kb(与pBS电泳条带2道平齐 )和1.2kb(与PCR产物电泳条带3、7道平齐)。以重组质粒为模板也可扩增出大小为1.2k b的特异产物(7道)。以上结果与预期的完全一致。
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    2.2 pBS-tuftelin重组质粒的序列分析

    釉丛蛋白成熟肽编码区基因克隆重组质粒pBS-tuftelin部分核苷酸序列测定,可读出的 200多个碱基序列与报道的结果完全一致。

    GAGCGGCGAC ACCAGTCAGA CCGTGTGGCC TTTGAGGTCA

    CACTCAGCCG TTATCAGCGA GAAGCAGAAC AGAGTAATGT

    GGCCCTTCAG AGAGAGGAGG ACAGAGTGGA GCAGAAAGCG

    GCAGAAATCG AGGAGCTACA GAGGCGCTTG CTGGGGATGG

    AGGCGGAGCA TCAGGCCTTA CTGGTGAAAG TCAGGGAAGG
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    3 讨论

    发育阶段的釉质富含基质蛋白,大致可分为富含脯氨酸的釉原蛋白和酸性的釉蛋白。目前已 知的釉蛋白主要有成釉蛋白和釉丛蛋白,前者在釉质矿化中起支架作用,后者起成核作用。 釉原蛋白的基因位于性染色体上,可能与性连锁的遗传性釉质发育不全(占遗传性釉质发育 不全的10%)有关。近来的研究指出,釉丛蛋白的基因位于1号常染色体q21-23位点,推测与 占 遗传性釉质发育不全的90% 的常染色体连锁的釉质发育不全有关[1,2]。研究釉丛 蛋白的基因结构和功能,对探明此类疾病的发病机理有重要意义。

    目前已克隆了牛、鼠釉丛蛋白基因的cDNA序列,人和猪的部分序列。牛釉丛蛋白基因的序列 分析表明:由于mRNA转录过程中的选择性剪切,该基因有4种不同的转录本,最长的转录本 为2674bp,含13个外显子,另外3种转录本分别缺少第2、第5、第6外显子[4]。小 鼠 釉丛蛋白cDNA序列含2572bp,5'非翻译区含22bp,23~1192为成熟蛋白编码区。本实 验根据 已报道的小鼠釉丛蛋白cDNA序列设计引物,从小鼠牙胚cDNA文库中扩增出了1.2kb大小的特 异片段,经过克隆、酶切、PCR鉴定及序列分析,证明已得到小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDN A片段,为该基因的表达、蛋白质功能的研究奠定了基础。
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    (本实验得到中科院蔡国强、张菊、刘昭平、赵中孝、马秦、徐蓬等老师和同学 的帮助,特此致谢。)

    国家自然科学基金资助课题(39700160,33744409),中国博士后科研资助计划项目 和中科院上海细胞生物学研究所开放实验室资助项目

    顾淑萍(第四军医大学口腔医学院, 陕西 西安 710032)

    郝建军(第四军医大学口腔医学院, 陕西 西安 710032)

    【参考文献】

    [1] Sasaki S, Shimakawa H. The amelogenin gene. Int J Dev Biol, 199 5,39:127

    [2] Deutsch D, Palman A, Dafni L. The enamelin(tuftelin)gene. Int J Dev Biol,1995,39:135
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    [3] MacDougall M, Simmons D, Dodds A, et al. Cloning, characteri zatio n,and tissue expression pattern of mouse tuftelin cDNA. J Dent Res, 1998,77:1970

    [4] Bashir M, Abrams W, Rosenbloom J. Molecular cloning and character ization of the bovine tuftelin gene. Archs Oral Biol, 1997,42:489

    收稿日期:1999-09-18;修回日期:1999-12-06, http://www.100md.com