微囊化大鼠嗜铬细胞瘤细胞移植后帕金森大鼠旋转行为变化研究
作者：吕胜青 张可成 刘海鹏 何家全 吴明
单位：
关键词：微囊技术；PC12细胞；移植；帕金森病；旋转行为
中国行为医学科学000208【摘要】 目的 观察微囊化嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)移植后帕金森病大鼠旋转行为变化。方法 采用免疫隔离微囊技术将能分泌多巴胺的PC12细胞包裹后，移植到帕金森病大鼠脑内，观察阿扑吗啡诱发病鼠旋转行为变化，酪氨酸羟化酶(TH)抗体免疫组化染色观察移植区阳性细胞表达。结果 帕金森病大鼠旋转行为有明显改善。移植后3月，大鼠脑内微囊完整，仍有TH阳性PC12细胞存活。结论 微囊化PC12细胞移植可明显改善帕金森病大鼠的旋转行为。
Change of the rotational behavior after implantation of microencapsulated PC12 cells in PD rats
, 百拇医药
Lu Shengqing, Zhang Kecheng, Liu Haipeng, et al.
(Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037)
【Abstract】 Objective To observe the rotational behavior of Parkinson's Disease (PD)rats after implantation of microencapsulated PC12 cells. Methods A new method of immunoisolation (microencapsulation) was utilized for encapsulation of dopamine-secreting PC12 cells, and the cells were implanted into the brains of Parkinson’s Disease rats. And then, the change of apomorphine-induced rotational behavior of the PD rats was observed. Tyrosine hydroxylase (TH)antibody immunohistochemistry stains of the cells in the implanted area were also proceeded. Results The rotational behavior of PD rats reduced significantly. The microcapsules in the PD rats’ brains were intact and TH immunopositive PC12 cells could exist for 3 months postimplantation. Conclusion The rotational behavior of PD rats can be promoted by implantation of microencapsulated PC12 cells.
, http://www.100md.com
【Key words】 Microencapsulation PC12 cell Implantation Parkinson’s Disease Rotational behavior
帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种常见的中枢神经系统退行变性疾病，其病理特征主要为中脑黑质纹状体多巴胺(dopamine， DA)能神经元进行性变性坏死，表达的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase， TH)降低，造成纹状体内DA含量减少，出现静止性震颤，运动减少，肌强直等临床症状[1]。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，该细胞能分泌DA和NE(去甲肾上腺素)等神经递质[2]。本研究利用该特性，将其微囊包裹 (microencapsulated) 后移植入脑内，补充DA的不足，以期达到改善临床症状的目的。
材料与方法
, 百拇医药
一、细胞培养
PC12细胞(上海细胞所细胞库)用含10%胎牛血清DMEM(Gibco)培养液，置37℃、5%CO2培养箱内培养。
二、微囊制作
微囊按照Chang PL等[3]提出的方法进行。将生长良好的PC12细胞制成细胞悬液，应用海藻酸钠和左旋多聚赖氨酸(PLL，分子量25000，Sigma)等试剂制成直径约0.8mm的微囊。以同样方法制作未包裹PC12细胞的空微囊足量备用。
三、动物模型及分组
本校动物所的健康Wistar大鼠30只，160～200g，雌雄不拘，PD大鼠模型按周明付等[4]建立的方法进行。将18只成功PD模型随机分组，即：A.空微囊移植组6只；B.未行微囊包裹PC12细胞移植组6只；C. 微囊化PC12细胞移植组6只。
, 百拇医药
四、移植实验
A.空微囊移植组: 立体定向方法按每只10个空微囊(无PC12细胞)移植到PD大鼠纹状体。
B.未行微囊包裹PC12细胞移植组：同样方法按每只20μι PC12细胞悬液移植到PD大鼠纹状体。
C.微囊化PC12细胞移植组：包裹PC12细胞的微囊移植到纹状体(10个/只)。
五、检测指标
A组和C组PD鼠移植后2周、1月、3月分别进行阿扑吗啡诱发旋转行为试验。并将移植3月后大鼠脑解剖，取出数个微囊，内含细胞经培养后用TH抗体 (1:1250, Boehringer Mannheim) 免疫组化染色，LSAB试剂盒(DAKO)。B组于术后1月先进行旋转行为试验，然后解剖大鼠移植区，取标本进行HE染色。
, 百拇医药
六、数据处理
数据采用本校编制的统计程序进行单因素方差分析和t检验，数据均以
±s表示。
结果
一、PD鼠旋转行为测试
移植后2周、1月、3月，C组大鼠旋转次数较空微囊的A组明显的减少(P<0.05)。B组大鼠的旋转行为在移植术后1月也有明显改善(见附表)。
附表 微囊化PC12细胞移植对PD鼠旋转行为的影响(±s圈/分) 分组
, 百拇医药
移植前
移植后
1日
2周
1月
3月
空微囊移植组
11.95±1.75
11.05±2.35
11.15±1.92
11.00±3.30
未微囊化PC12
, 百拇医药 细胞移植组
12.13±1.67
5.80±1.40*
5.25±1.00*
-
微囊化PC12
细胞移植组
11.88±2.04
5.06±2.50*
4.92±1.83*
3.46±1.01*
, 百拇医药
*: 与空微囊移植组比较，P<0.05
二、形态学观察
A组和C组大鼠分别于移植后3月杀死，解剖脑组织时可见完整的微囊，但与移植前形态稍有改变，变成类似椭圆形。C组微囊内含细胞继续培养后进行TH抗体免疫组化染色，培养的细胞均表现为TH阳性。B组大鼠处死后解剖移植区，可见新生物形成，HE染色证实有致死性肿瘤形成。
讨论
帕金森病是一种老年性中枢神经系统退行性病变，其病理基础明确。学者们针对其病理改变，进行了多方面研究，如药物治疗，立体定向毁损丘脑腹外侧核团治疗，以及移植治疗，而后者又包括移植胎脑黑质和肾上腺髓质等。药物治疗和立体定向手术治疗在临床上应用了几十年，其疗效有肯定的一面，但远期疗效仍不尽如人意[5]。而胎脑移植、肾上腺髓质移植均包含这样那样的弊端[6～7]。PC12细胞作为肿瘤细胞系，有分泌功能，其释放的DA可补充黑质纹状体DA的含量。本研究即从其分泌功能出发，用以观察微囊化PC12细胞移植后PD鼠旋转行为变化。本实验根据Chang TMS[8]免疫隔离技术原理，制成了能将PC12细胞与宿主的免疫系统隔离的新型微囊膜。
, 百拇医药
众所周知，同种异体或跨物种组织和细胞移植的最大障碍是免疫排斥反应。晚近研究表明微囊技术作为一种免疫隔离技术，可避免免疫排斥，并且对宿主无毒性反应[9]。微囊膜是目前应用较广的一种免疫隔离技术。该膜能允许营养物质,氧气等低分子物质(分子量<3万道尔顿)自由通过，而大分子物质(分子量>15万)，如免疫球蛋白不能通过，从而避免了排斥反应，并可利用移植物分泌的小分子活性物质发挥生物效应。本研究发现：采用海藻酸钠和左旋多聚赖氨酸制成的微囊膜(APA膜)，性能稳定，有一定的强度，以其包裹的PC12细胞能够在PD鼠脑内存活，获取营养，释放DA。PC12细胞存活时间可达12周，培养后的细胞生长良好，仍能表达TH(免疫组化结果证实)。
从PD鼠的旋转行为来看，它是反映黑质纹状体多巴胺能神经元变性坏死，纹状体失神经支配的重要指标，所以PD大鼠模型制作和鉴定都是围绕其旋转行为而来的。本实验发现：移植含PC12细胞的微囊，对改善其旋转行为效果明显；未行微囊包裹的PC12细胞移植后1月，其旋转圈数亦减少，有统计学意义(P<0.05)。但作者还发现：后者移植有致死性肿瘤形成，这可能与已建株的肿瘤细胞系的不死性有关。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Hughes AJ, Daniel SE, Blankson S, et al. A clinicopathologic study of 100 cases of Parkinson’s disease. Arch Neurol, 1993，50：140～148.
2，Shafer TJ, Atchison WD. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology, 1991，12：473～492.
3，Chang PL, Hortelano G, Tse M, et al. Growth of recombinant fibroblasts in alginate microcapsules. Biotechnology and bioengineering, 1994，43：925～933.
, 百拇医药
4，周明付，张华，吴金良，等.大鼠帕金森氏病模型的建立.河南医科大学学报，1994，29(4)：289～292.
5，Werner HP. Clinical aspects of motor fluctuations in Parkinson’s disease. Neurology , 1994， 44(suppl 6)：6～9.
6，Date I. Parkinson’s disease, trophic factors, and adrenal medullary chromaffin cell grafting: Basic and clinical studies. Brain Res. Bull， 1996，40：1～19.
7，Date I, Ohmoto T. Neural transplantation and trophic factors in Parkinson’s disease: Special reference to chromaffin cell grafting, NGF support from pretransected peripheral nerve and encapsulated dopamine-secreting cell grafting. Exp Neurol， 1996，137：333～344.
8，Chang TMS. Semipermeable microcapsules. Science, 1964，146：524～546.
9，Petruzzo P, Cappai A, Ruiu G, et al. Cell microencapsulation: A new method. Transplantation Proceedings, 1994，26(6)：3507～3508.
(收稿日期：1999—07—12), 百拇医药
单位：
关键词：微囊技术；PC12细胞；移植；帕金森病；旋转行为
中国行为医学科学000208【摘要】 目的 观察微囊化嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)移植后帕金森病大鼠旋转行为变化。方法 采用免疫隔离微囊技术将能分泌多巴胺的PC12细胞包裹后，移植到帕金森病大鼠脑内，观察阿扑吗啡诱发病鼠旋转行为变化，酪氨酸羟化酶(TH)抗体免疫组化染色观察移植区阳性细胞表达。结果 帕金森病大鼠旋转行为有明显改善。移植后3月，大鼠脑内微囊完整，仍有TH阳性PC12细胞存活。结论 微囊化PC12细胞移植可明显改善帕金森病大鼠的旋转行为。
Change of the rotational behavior after implantation of microencapsulated PC12 cells in PD rats
, 百拇医药
Lu Shengqing, Zhang Kecheng, Liu Haipeng, et al.
(Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037)
【Abstract】 Objective To observe the rotational behavior of Parkinson's Disease (PD)rats after implantation of microencapsulated PC12 cells. Methods A new method of immunoisolation (microencapsulation) was utilized for encapsulation of dopamine-secreting PC12 cells, and the cells were implanted into the brains of Parkinson’s Disease rats. And then, the change of apomorphine-induced rotational behavior of the PD rats was observed. Tyrosine hydroxylase (TH)antibody immunohistochemistry stains of the cells in the implanted area were also proceeded. Results The rotational behavior of PD rats reduced significantly. The microcapsules in the PD rats’ brains were intact and TH immunopositive PC12 cells could exist for 3 months postimplantation. Conclusion The rotational behavior of PD rats can be promoted by implantation of microencapsulated PC12 cells.
, http://www.100md.com
【Key words】 Microencapsulation PC12 cell Implantation Parkinson’s Disease Rotational behavior
帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种常见的中枢神经系统退行变性疾病，其病理特征主要为中脑黑质纹状体多巴胺(dopamine， DA)能神经元进行性变性坏死，表达的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase， TH)降低，造成纹状体内DA含量减少，出现静止性震颤，运动减少，肌强直等临床症状[1]。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，该细胞能分泌DA和NE(去甲肾上腺素)等神经递质[2]。本研究利用该特性，将其微囊包裹 (microencapsulated) 后移植入脑内，补充DA的不足，以期达到改善临床症状的目的。
材料与方法
, 百拇医药
一、细胞培养
PC12细胞(上海细胞所细胞库)用含10%胎牛血清DMEM(Gibco)培养液，置37℃、5%CO2培养箱内培养。
二、微囊制作
微囊按照Chang PL等[3]提出的方法进行。将生长良好的PC12细胞制成细胞悬液，应用海藻酸钠和左旋多聚赖氨酸(PLL，分子量25000，Sigma)等试剂制成直径约0.8mm的微囊。以同样方法制作未包裹PC12细胞的空微囊足量备用。
三、动物模型及分组
本校动物所的健康Wistar大鼠30只，160～200g，雌雄不拘，PD大鼠模型按周明付等[4]建立的方法进行。将18只成功PD模型随机分组，即：A.空微囊移植组6只；B.未行微囊包裹PC12细胞移植组6只；C. 微囊化PC12细胞移植组6只。
, 百拇医药
四、移植实验
A.空微囊移植组: 立体定向方法按每只10个空微囊(无PC12细胞)移植到PD大鼠纹状体。
B.未行微囊包裹PC12细胞移植组：同样方法按每只20μι PC12细胞悬液移植到PD大鼠纹状体。
C.微囊化PC12细胞移植组：包裹PC12细胞的微囊移植到纹状体(10个/只)。
五、检测指标
A组和C组PD鼠移植后2周、1月、3月分别进行阿扑吗啡诱发旋转行为试验。并将移植3月后大鼠脑解剖，取出数个微囊，内含细胞经培养后用TH抗体 (1:1250, Boehringer Mannheim) 免疫组化染色，LSAB试剂盒(DAKO)。B组于术后1月先进行旋转行为试验，然后解剖大鼠移植区，取标本进行HE染色。
, 百拇医药
六、数据处理
数据采用本校编制的统计程序进行单因素方差分析和t检验，数据均以
±s表示。结果
一、PD鼠旋转行为测试
移植后2周、1月、3月，C组大鼠旋转次数较空微囊的A组明显的减少(P<0.05)。B组大鼠的旋转行为在移植术后1月也有明显改善(见附表)。
附表 微囊化PC12细胞移植对PD鼠旋转行为的影响(
±s圈/分) 分组, 百拇医药
移植前
移植后
1日
2周
1月
3月
空微囊移植组
11.95±1.75
11.05±2.35
11.15±1.92
11.00±3.30
未微囊化PC12
, 百拇医药 细胞移植组
12.13±1.67
5.80±1.40*
5.25±1.00*
-
微囊化PC12
细胞移植组
11.88±2.04
5.06±2.50*
4.92±1.83*
3.46±1.01*
, 百拇医药
*: 与空微囊移植组比较，P<0.05
二、形态学观察
A组和C组大鼠分别于移植后3月杀死，解剖脑组织时可见完整的微囊，但与移植前形态稍有改变，变成类似椭圆形。C组微囊内含细胞继续培养后进行TH抗体免疫组化染色，培养的细胞均表现为TH阳性。B组大鼠处死后解剖移植区，可见新生物形成，HE染色证实有致死性肿瘤形成。
讨论
帕金森病是一种老年性中枢神经系统退行性病变，其病理基础明确。学者们针对其病理改变，进行了多方面研究，如药物治疗，立体定向毁损丘脑腹外侧核团治疗，以及移植治疗，而后者又包括移植胎脑黑质和肾上腺髓质等。药物治疗和立体定向手术治疗在临床上应用了几十年，其疗效有肯定的一面，但远期疗效仍不尽如人意[5]。而胎脑移植、肾上腺髓质移植均包含这样那样的弊端[6～7]。PC12细胞作为肿瘤细胞系，有分泌功能，其释放的DA可补充黑质纹状体DA的含量。本研究即从其分泌功能出发，用以观察微囊化PC12细胞移植后PD鼠旋转行为变化。本实验根据Chang TMS[8]免疫隔离技术原理，制成了能将PC12细胞与宿主的免疫系统隔离的新型微囊膜。
, 百拇医药
众所周知，同种异体或跨物种组织和细胞移植的最大障碍是免疫排斥反应。晚近研究表明微囊技术作为一种免疫隔离技术，可避免免疫排斥，并且对宿主无毒性反应[9]。微囊膜是目前应用较广的一种免疫隔离技术。该膜能允许营养物质,氧气等低分子物质(分子量<3万道尔顿)自由通过，而大分子物质(分子量>15万)，如免疫球蛋白不能通过，从而避免了排斥反应，并可利用移植物分泌的小分子活性物质发挥生物效应。本研究发现：采用海藻酸钠和左旋多聚赖氨酸制成的微囊膜(APA膜)，性能稳定，有一定的强度，以其包裹的PC12细胞能够在PD鼠脑内存活，获取营养，释放DA。PC12细胞存活时间可达12周，培养后的细胞生长良好，仍能表达TH(免疫组化结果证实)。
从PD鼠的旋转行为来看，它是反映黑质纹状体多巴胺能神经元变性坏死，纹状体失神经支配的重要指标，所以PD大鼠模型制作和鉴定都是围绕其旋转行为而来的。本实验发现：移植含PC12细胞的微囊，对改善其旋转行为效果明显；未行微囊包裹的PC12细胞移植后1月，其旋转圈数亦减少，有统计学意义(P<0.05)。但作者还发现：后者移植有致死性肿瘤形成，这可能与已建株的肿瘤细胞系的不死性有关。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Hughes AJ, Daniel SE, Blankson S, et al. A clinicopathologic study of 100 cases of Parkinson’s disease. Arch Neurol, 1993，50：140～148.
2，Shafer TJ, Atchison WD. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology, 1991，12：473～492.
3，Chang PL, Hortelano G, Tse M, et al. Growth of recombinant fibroblasts in alginate microcapsules. Biotechnology and bioengineering, 1994，43：925～933.
, 百拇医药
4，周明付，张华，吴金良，等.大鼠帕金森氏病模型的建立.河南医科大学学报，1994，29(4)：289～292.
5，Werner HP. Clinical aspects of motor fluctuations in Parkinson’s disease. Neurology , 1994， 44(suppl 6)：6～9.
6，Date I. Parkinson’s disease, trophic factors, and adrenal medullary chromaffin cell grafting: Basic and clinical studies. Brain Res. Bull， 1996，40：1～19.
7，Date I, Ohmoto T. Neural transplantation and trophic factors in Parkinson’s disease: Special reference to chromaffin cell grafting, NGF support from pretransected peripheral nerve and encapsulated dopamine-secreting cell grafting. Exp Neurol， 1996，137：333～344.
8，Chang TMS. Semipermeable microcapsules. Science, 1964，146：524～546.
9，Petruzzo P, Cappai A, Ruiu G, et al. Cell microencapsulation: A new method. Transplantation Proceedings, 1994，26(6)：3507～3508.
(收稿日期：1999—07—12), 百拇医药