端粒、端粒酶与肺癌的研究进展
作者：朱冰 温剑虎
单位：朱冰 温剑虎(400016 重庆医科大学附属第一医院胸外科)
关键词：
中国肺癌杂志000226 随着对癌变分子水平研究的深入，端粒(telomere)进行性缩短使细胞逐渐衰老、死亡的形式及端粒、端粒酶(telomerase)与肿瘤关系的研究已受到高度重视。普遍认为端粒酶是一种新的、很有价值的肿瘤标志物，不仅可用于恶性肿瘤的诊断，且对肿瘤的治疗有一定的指导意义。本文就端粒酶与肺癌的关系作一综述。
1 端粒、端粒酶的性质及其与恶性肿瘤的关系
端粒是真核生物线性染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA及蛋白质组成，DNA序列双链中由5′3′指向染色体末端的链比反向链长出12～16 bp的一段基因，呈帽状，保护染色体，防止其断裂、重组或降解，并促进核膜粘着以及减数分裂时对生殖细胞的配对，从而也保证了细胞的正常分化和繁殖[1]。人类端粒DNA的平均长度随年龄的增长和分裂次数的增加而缩短并最终导致细胞的衰老、死亡[2，3]。
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端粒酶是一种核糖核酸蛋白酶，由具有模板功能的RNA组分和催化活性蛋白质组成，含有引物特异识别位点，可识别单链富含G的寡核苷酸引物，以其RNA组分的11碱基为模板与端粒重复序列进行碱基互补配对，具有RNA依赖的DNA多聚酶活性的蛋白质组分在合成、延伸6碱基序列中起催化作用[4]。胎儿时期组织、细胞有较高的端粒酶活性，但出生后不久除干细胞和少数正常增生活跃组织如皮肤生发层、毛囊、小肠粘膜、骨髓等外都无端粒酶活性[5]。
1987年Morin等在宫颈癌细胞中首次发现有活性的端粒酶[4]；1994年Kim等采用端粒重复序列扩增(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)法对人类不同组织类型的具有永生性的肿瘤细胞株100例标本进行检测，98例为端粒酶阳性，而正常组织标本端粒酶全为阴性[5]。此后大量研究报道绝大多数人类肿瘤中均检测到端粒酶活性，提示端粒酶活性与恶性肿瘤密切相关。大多数研究认为端粒酶的激活为肿瘤发生的晚期事件。日本科学家测定的366份原发性胃癌标本中85%有端粒酶活性，且大都为晚期病例[6]。有学者用鼠模型观察肿瘤进程的不同阶段端粒酶的活性，显示早期未测到酶活性而晚期检测到端粒酶活性，这进一步提示端粒酶的活化发生在肿瘤发展的晚期[7]。这就涉及到“端粒假说”[8]，即在细胞有丝分裂过程中端粒序列丢失、缩短到细胞周期核查点时，分裂停顿于M1期；当促癌的遗传突变p53等使细胞越过M1继续分裂直至M2期时，大部分细胞因端粒持续缩短而死亡，但有极少数癌细胞在此阶段激活端粒酶，使缩短的端粒得以修复并维持其功能而逃避了M2期，癌细胞获得永生。
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2 端粒酶与肺癌的研究进展
肺癌是危胁人类健康的主要疾病之一，组织学上可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)及非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)两大类，70%～80%患者确诊时已失去了根治性切除的机会，而所有经手术切除的患者平均5年生存率为25%左右[9]，治疗后复发、转移也是影响疗效的主要因素，如何提高早期诊断及预防复发成为目前肺癌研究的热点。近来一系列研究表明，端粒酶与肺癌的发生、发展有很大关系。
Hiyama等利用TRAP法对136例原发性肺癌组织和68例正常的癌旁组织作了检测，结果显示端粒酶在原发性肺癌中的阳性率为80.1%，而68例正常癌旁组织中仅有3例(4.4%)检测到了端粒酶活性，全部11例SCLC及3例肺腺癌胸腔积液中也检测到端粒酶活性[10]。Yashima等[11]研究了205例新鲜及馆藏NSCLC标本，除典型的类癌瘤及坏死性鳞癌外，所有肿瘤细胞均显示端粒酶阳性，在随后的检测中还发现大量异常支气管上皮细胞的碎屑中存在端粒酶阳性，包括增生(71%)、转化(80%)、发育不良(82%)及原位癌(100%)。这一发现也证实在肺癌发生过程中端粒酶活性的存在及随阶段不同而表达不同，水平有进行性升高的趋势，这揭示端粒酶的活性变化在肺癌的发生、发展中可能起关键作用。但一系列研究也发现，不同类型癌表达端粒酶活性水平也不同。Hiyama等发现125例原发性NSCLC中端粒酶活性从无到高顺序排列，而几乎所有研究中SCLC均表达高水平端粒酶活性。当用含有相同蛋白含量的永生癌细胞系检测时，全部SCLC及NSCLC分化细胞系均显示相似的端粒酶活性[10]，这提示在获得永生性后NSCLC与SCLC细胞端粒酶有相同活性，也表明不同类型癌端粒酶活性的差异可能是由于永生化细胞的构成比不同所致。由端粒酶活性水平可推测肺癌细胞中永生化细胞的比例及预测恶性潜力。
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研究中观察到，NSCLC中腺癌和鳞癌的发生机制可能不同。成人上皮癌是由一系列形态上可识别的癌前病变发展、进化来的。对于NSCLC，特别是鳞癌，形态学步骤可能包括增生、转化、不良发育、原位癌、侵袭性癌和转移性癌。在试验中检测到许多NSCLC发生过程中染色体3p的杂合性丢失发生在增殖期，有研究资料证实，支气管粘膜上皮异常(癌前病变)进而演化为肺鳞癌。大量异常上皮均测到端粒酶活性提示鳞癌早期可能存在端粒酶的异常调节。而近来认为非典型性肺泡增生(atypical alveolar hyperplasias, AAH)可能是周围性腺癌的前体，形态测定的改变如ras基因改变、p53蛋白过量表达更进一步证明AAH为癌前病变，但外周腺癌附近有限数目的AAH中没有检测到端粒酶活性提示腺癌中端粒酶的激活可能为晚期事件[12，13]。值得注意的是少量组织学正常及不正常的支气管上皮标本检测到端粒酶活性[11]，其中大部分取自以前或现今的吸烟者。统计学调查显示90%以上的肺癌患者为吸烟者；且几乎50%的长期吸烟史患者组织学正常的支气管标本隐匿着许多分子异常，因此这些标本中的端粒酶阳性是表现了细胞受损后再生的正常生理学表达还是烟损害的异常表现仍需进一步研究。
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端粒酶活性的调节机制被给予极大关注。Katakura等[14]研究了人肺腺癌细胞系A549及其分化来的亚系A5DC7的端粒酶调节机制，发现用5%小牛血清培养了一段时间后，A549生长良好，而在此浓度显示大量衰亡细胞形态、具有相同生长潜力、保存了接触抑制、无胸腺小鼠体内无致瘤性的A5DC7在浓度提至10%时，再次显示增殖活力及端粒酶活性，而正常细胞无此现象，提示在肺癌细胞不同亚系中存在着双向端粒酶调节机制。当几乎全部A5DC7细胞在血清浓度提高且危机期无死亡特征时，由端粒酶激活引起的恶性转换不同于危机期端粒酶激活引起的极少数细胞永生化，揭示A5DC7细胞端粒酶调节不同于伴随细胞分化和衰亡的严格端粒酶抑制，为临床化疗提供了理论依据。而Albanell等[15]观测到化疗后手术切除的6例NSCLC ⅢA期患者仅有3例检测到端粒酶活性，且3例端粒酶阴性的肿瘤对化疗产生了病理上的对应，提示临床上不同亚型的肺癌化疗效果不同的因素，且可利用改变肿瘤生存的内环境来抑制癌细胞永生化并将端粒酶活性水平作为化疗的指征。
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3 端粒酶与肿瘤治疗
由目前已检测到的癌组织标本的统计结果分析，恶性肿瘤组织中的端粒酶检出率高达84%～95%，而良性肿瘤及正常组织仅为4%左右。端粒酶与肿瘤间高度相关性使之成为目前肿瘤治疗研究的新热点。
由于晚期及复发性肿瘤是由具有端粒酶活性的永生细胞构成，且多数肿瘤细胞端粒有相同水平的丢失，使得端粒酶拮抗剂如反义核苷酸、核酸及细胞分化诱导剂等都可在一定程度上抑制具有端粒酶活性而继续繁殖生存的永生性肿瘤细胞，但仍有可能存在端粒酶与其它非端粒酶依赖性端粒维持途径的相互协同以保持肿瘤细胞的增殖。且人类正常生殖细胞、造血干细胞、表皮细胞、肠粘膜基底干细胞等具有再生能力的细胞中均可检测到不同水平的端粒酶活性表达，端粒酶抑制剂可能会对这些组织细胞产生毒副作用使其只能应用于酶表达阳性肿瘤这一有限范围。还应看到，虽然大多数肿瘤细胞的端粒较短，合成受抑制后细胞可较快死亡，但仍有少数端粒较长的肿瘤细胞存在使得端粒酶抑制剂的疗效受到一定影响。端粒酶抑制剂能否成为晚期及转移性肿瘤的特异治疗方法，以及检测端粒酶活性在肿瘤早期诊断及预后的临床意义，均有待于进一步研究。
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参 考 文 献
1，Blackburn EH. Structure and function of telomeres. Nature,1991,350(6319)∶569-573.
2，Harley CB, Futcher AB, Greider CW, et al. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature,1990,345(6274)∶458-460.
3，Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(21)∶10114-10118.
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4，Morin GB. The human telomere terminal transferase is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell,1999,59(3)∶521-529.
5，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science,1994,266(5193)∶2011-2015.
6，Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res,1995,55(15)∶3258-3262.
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7，Blasco MA, Rizen M, Greidere CW, et al. Differential regulation of telomerase activity and telomerase RNA during multistage tumorigenesis. Nat Genet,1996,12(2)∶200-206.
8，de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(8)∶2882-2885.
9，候普克，W-W, 吕利西，H. 肺癌：切除术，形态学与预后.武忠粥主译.第1版.北京：人民卫生出版社，1991.5-6.
10 Hiyama K, Hiyama E, Ishiokas et al. Telomerase activity in small-cell and non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst,1995,87(12)∶8895-8901.
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11 Yashima K, Litzky LA, Kaiser L, et al. Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas. Cancer Res,1997,57(12)∶2373-2377.
12 Miller RR. Bronchioloalveolar cell adenomas. Am J Surg Pathol,1990,14(11)∶904-912.
13 Westra W, Baas IO, Hruban RH, et al. K-ras oncogene activation in atypical alveolar hyperplasias of the human lung. Cancer Res,1996,56(19)∶2224-2228.
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14 Katakura Y, Yamatoto K, Miyake O, et al. Regulation of telomerase activity in a subline derived from human lung adenocarcinoma. Biol Res Com,1997,237(2)∶313-317.
15 Albanell J, Lonardo F, Rusch V, et al. High telomerase activity in primary lung cancers: association with increased cell proliferation rates and advanced pathologic stage. J Natl Cancer Inst,1997,89(21)∶1609-1615.
(收稿：1998-11-02 修回：1999-01-11), 百拇医药
单位：朱冰 温剑虎(400016 重庆医科大学附属第一医院胸外科)
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中国肺癌杂志000226 随着对癌变分子水平研究的深入，端粒(telomere)进行性缩短使细胞逐渐衰老、死亡的形式及端粒、端粒酶(telomerase)与肿瘤关系的研究已受到高度重视。普遍认为端粒酶是一种新的、很有价值的肿瘤标志物，不仅可用于恶性肿瘤的诊断，且对肿瘤的治疗有一定的指导意义。本文就端粒酶与肺癌的关系作一综述。
1 端粒、端粒酶的性质及其与恶性肿瘤的关系
端粒是真核生物线性染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA及蛋白质组成，DNA序列双链中由5′3′指向染色体末端的链比反向链长出12～16 bp的一段基因，呈帽状，保护染色体，防止其断裂、重组或降解，并促进核膜粘着以及减数分裂时对生殖细胞的配对，从而也保证了细胞的正常分化和繁殖[1]。人类端粒DNA的平均长度随年龄的增长和分裂次数的增加而缩短并最终导致细胞的衰老、死亡[2，3]。
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端粒酶是一种核糖核酸蛋白酶，由具有模板功能的RNA组分和催化活性蛋白质组成，含有引物特异识别位点，可识别单链富含G的寡核苷酸引物，以其RNA组分的11碱基为模板与端粒重复序列进行碱基互补配对，具有RNA依赖的DNA多聚酶活性的蛋白质组分在合成、延伸6碱基序列中起催化作用[4]。胎儿时期组织、细胞有较高的端粒酶活性，但出生后不久除干细胞和少数正常增生活跃组织如皮肤生发层、毛囊、小肠粘膜、骨髓等外都无端粒酶活性[5]。
1987年Morin等在宫颈癌细胞中首次发现有活性的端粒酶[4]；1994年Kim等采用端粒重复序列扩增(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)法对人类不同组织类型的具有永生性的肿瘤细胞株100例标本进行检测，98例为端粒酶阳性，而正常组织标本端粒酶全为阴性[5]。此后大量研究报道绝大多数人类肿瘤中均检测到端粒酶活性，提示端粒酶活性与恶性肿瘤密切相关。大多数研究认为端粒酶的激活为肿瘤发生的晚期事件。日本科学家测定的366份原发性胃癌标本中85%有端粒酶活性，且大都为晚期病例[6]。有学者用鼠模型观察肿瘤进程的不同阶段端粒酶的活性，显示早期未测到酶活性而晚期检测到端粒酶活性，这进一步提示端粒酶的活化发生在肿瘤发展的晚期[7]。这就涉及到“端粒假说”[8]，即在细胞有丝分裂过程中端粒序列丢失、缩短到细胞周期核查点时，分裂停顿于M1期；当促癌的遗传突变p53等使细胞越过M1继续分裂直至M2期时，大部分细胞因端粒持续缩短而死亡，但有极少数癌细胞在此阶段激活端粒酶，使缩短的端粒得以修复并维持其功能而逃避了M2期，癌细胞获得永生。
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2 端粒酶与肺癌的研究进展
肺癌是危胁人类健康的主要疾病之一，组织学上可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)及非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)两大类，70%～80%患者确诊时已失去了根治性切除的机会，而所有经手术切除的患者平均5年生存率为25%左右[9]，治疗后复发、转移也是影响疗效的主要因素，如何提高早期诊断及预防复发成为目前肺癌研究的热点。近来一系列研究表明，端粒酶与肺癌的发生、发展有很大关系。
Hiyama等利用TRAP法对136例原发性肺癌组织和68例正常的癌旁组织作了检测，结果显示端粒酶在原发性肺癌中的阳性率为80.1%，而68例正常癌旁组织中仅有3例(4.4%)检测到了端粒酶活性，全部11例SCLC及3例肺腺癌胸腔积液中也检测到端粒酶活性[10]。Yashima等[11]研究了205例新鲜及馆藏NSCLC标本，除典型的类癌瘤及坏死性鳞癌外，所有肿瘤细胞均显示端粒酶阳性，在随后的检测中还发现大量异常支气管上皮细胞的碎屑中存在端粒酶阳性，包括增生(71%)、转化(80%)、发育不良(82%)及原位癌(100%)。这一发现也证实在肺癌发生过程中端粒酶活性的存在及随阶段不同而表达不同，水平有进行性升高的趋势，这揭示端粒酶的活性变化在肺癌的发生、发展中可能起关键作用。但一系列研究也发现，不同类型癌表达端粒酶活性水平也不同。Hiyama等发现125例原发性NSCLC中端粒酶活性从无到高顺序排列，而几乎所有研究中SCLC均表达高水平端粒酶活性。当用含有相同蛋白含量的永生癌细胞系检测时，全部SCLC及NSCLC分化细胞系均显示相似的端粒酶活性[10]，这提示在获得永生性后NSCLC与SCLC细胞端粒酶有相同活性，也表明不同类型癌端粒酶活性的差异可能是由于永生化细胞的构成比不同所致。由端粒酶活性水平可推测肺癌细胞中永生化细胞的比例及预测恶性潜力。
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研究中观察到，NSCLC中腺癌和鳞癌的发生机制可能不同。成人上皮癌是由一系列形态上可识别的癌前病变发展、进化来的。对于NSCLC，特别是鳞癌，形态学步骤可能包括增生、转化、不良发育、原位癌、侵袭性癌和转移性癌。在试验中检测到许多NSCLC发生过程中染色体3p的杂合性丢失发生在增殖期，有研究资料证实，支气管粘膜上皮异常(癌前病变)进而演化为肺鳞癌。大量异常上皮均测到端粒酶活性提示鳞癌早期可能存在端粒酶的异常调节。而近来认为非典型性肺泡增生(atypical alveolar hyperplasias, AAH)可能是周围性腺癌的前体，形态测定的改变如ras基因改变、p53蛋白过量表达更进一步证明AAH为癌前病变，但外周腺癌附近有限数目的AAH中没有检测到端粒酶活性提示腺癌中端粒酶的激活可能为晚期事件[12，13]。值得注意的是少量组织学正常及不正常的支气管上皮标本检测到端粒酶活性[11]，其中大部分取自以前或现今的吸烟者。统计学调查显示90%以上的肺癌患者为吸烟者；且几乎50%的长期吸烟史患者组织学正常的支气管标本隐匿着许多分子异常，因此这些标本中的端粒酶阳性是表现了细胞受损后再生的正常生理学表达还是烟损害的异常表现仍需进一步研究。
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端粒酶活性的调节机制被给予极大关注。Katakura等[14]研究了人肺腺癌细胞系A549及其分化来的亚系A5DC7的端粒酶调节机制，发现用5%小牛血清培养了一段时间后，A549生长良好，而在此浓度显示大量衰亡细胞形态、具有相同生长潜力、保存了接触抑制、无胸腺小鼠体内无致瘤性的A5DC7在浓度提至10%时，再次显示增殖活力及端粒酶活性，而正常细胞无此现象，提示在肺癌细胞不同亚系中存在着双向端粒酶调节机制。当几乎全部A5DC7细胞在血清浓度提高且危机期无死亡特征时，由端粒酶激活引起的恶性转换不同于危机期端粒酶激活引起的极少数细胞永生化，揭示A5DC7细胞端粒酶调节不同于伴随细胞分化和衰亡的严格端粒酶抑制，为临床化疗提供了理论依据。而Albanell等[15]观测到化疗后手术切除的6例NSCLC ⅢA期患者仅有3例检测到端粒酶活性，且3例端粒酶阴性的肿瘤对化疗产生了病理上的对应，提示临床上不同亚型的肺癌化疗效果不同的因素，且可利用改变肿瘤生存的内环境来抑制癌细胞永生化并将端粒酶活性水平作为化疗的指征。
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3 端粒酶与肿瘤治疗
由目前已检测到的癌组织标本的统计结果分析，恶性肿瘤组织中的端粒酶检出率高达84%～95%，而良性肿瘤及正常组织仅为4%左右。端粒酶与肿瘤间高度相关性使之成为目前肿瘤治疗研究的新热点。
由于晚期及复发性肿瘤是由具有端粒酶活性的永生细胞构成，且多数肿瘤细胞端粒有相同水平的丢失，使得端粒酶拮抗剂如反义核苷酸、核酸及细胞分化诱导剂等都可在一定程度上抑制具有端粒酶活性而继续繁殖生存的永生性肿瘤细胞，但仍有可能存在端粒酶与其它非端粒酶依赖性端粒维持途径的相互协同以保持肿瘤细胞的增殖。且人类正常生殖细胞、造血干细胞、表皮细胞、肠粘膜基底干细胞等具有再生能力的细胞中均可检测到不同水平的端粒酶活性表达，端粒酶抑制剂可能会对这些组织细胞产生毒副作用使其只能应用于酶表达阳性肿瘤这一有限范围。还应看到，虽然大多数肿瘤细胞的端粒较短，合成受抑制后细胞可较快死亡，但仍有少数端粒较长的肿瘤细胞存在使得端粒酶抑制剂的疗效受到一定影响。端粒酶抑制剂能否成为晚期及转移性肿瘤的特异治疗方法，以及检测端粒酶活性在肿瘤早期诊断及预后的临床意义，均有待于进一步研究。
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1，Blackburn EH. Structure and function of telomeres. Nature,1991,350(6319)∶569-573.
2，Harley CB, Futcher AB, Greider CW, et al. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature,1990,345(6274)∶458-460.
3，Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(21)∶10114-10118.
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5，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science,1994,266(5193)∶2011-2015.
6，Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res,1995,55(15)∶3258-3262.
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7，Blasco MA, Rizen M, Greidere CW, et al. Differential regulation of telomerase activity and telomerase RNA during multistage tumorigenesis. Nat Genet,1996,12(2)∶200-206.
8，de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(8)∶2882-2885.
9，候普克，W-W, 吕利西，H. 肺癌：切除术，形态学与预后.武忠粥主译.第1版.北京：人民卫生出版社，1991.5-6.
10 Hiyama K, Hiyama E, Ishiokas et al. Telomerase activity in small-cell and non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst,1995,87(12)∶8895-8901.
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11 Yashima K, Litzky LA, Kaiser L, et al. Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas. Cancer Res,1997,57(12)∶2373-2377.
12 Miller RR. Bronchioloalveolar cell adenomas. Am J Surg Pathol,1990,14(11)∶904-912.
13 Westra W, Baas IO, Hruban RH, et al. K-ras oncogene activation in atypical alveolar hyperplasias of the human lung. Cancer Res,1996,56(19)∶2224-2228.
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14 Katakura Y, Yamatoto K, Miyake O, et al. Regulation of telomerase activity in a subline derived from human lung adenocarcinoma. Biol Res Com,1997,237(2)∶313-317.
15 Albanell J, Lonardo F, Rusch V, et al. High telomerase activity in primary lung cancers: association with increased cell proliferation rates and advanced pathologic stage. J Natl Cancer Inst,1997,89(21)∶1609-1615.
(收稿：1998-11-02 修回：1999-01-11), 百拇医药