消痰散结方对裸鼠MKN-45胃腺癌组织中PCNA表达的影响
作者：郭晓冬 魏品康 许玲
单位：第二军医大学长征医院，上海 200003
关键词：@消痰散结方；药理学；胃肿瘤；中药疗法；燥湿化痰；@增殖细胞核抗原
广州中医药大学学报000218摘要：目的：立足于痰浊凝结为癌瘤形成与转移的重要病理因素之一，设计观察了消痰散结方(半夏、胆南星、茯苓、枳实、陈皮、炙甘草等组成)对裸鼠胃腺癌体内生长的抑制作用及其对胃癌组织中增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法：建立裸鼠MKN-45胃腺癌模型，采用免疫组化ABC法检测胃癌组织中PCNA的阳性表达率，同时观察了不同用药组瘤组织重量和病理学变化。结果：在裸鼠体内实验观察中，消痰散结方组抑瘤率大于30%，其瘤重明显低于空白对照组(P<0.05)；与化疗组比较，无统计学差异(P>0.05)。中药组裸鼠胃癌组织PCNA表达水平明显低于空白对照组(P<0.05)，表明细胞增殖活性降低。结论：消痰散结方可抑制裸鼠胃癌的生长，降低胃癌细胞的增殖活性。
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中图分类号：R735.2 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)02-0152-03
癌细胞是由正常细胞转化而来，是细胞的增殖与分化调控的失调。肿瘤细胞的持续无限制的增殖，又可进一步导致肿瘤的浸润与转移。增殖细胞核抗原(PCNA)，是近年发现的一种与细胞增殖周期密切相关的核蛋白。我们通过建立裸鼠胃腺癌模型，观察了消痰散结方对裸鼠胃腺癌体内生长的抑制作用，并检测胃癌组织中PCNA的表达水平，初步探讨了消痰散结方对胃癌细胞增殖的影响作用，现报告如下。
1 材料
1.1 消痰散结方水煎液的制备 半夏15g、胆南星15g、茯苓15g、枳实10g、陈皮10g、炙甘草6g等以常规方法煎煮，并浓缩至含生药0.461kg/L备用。
1.2 主要试剂 鼠抗人PCNA单抗，购自美国DAKO公司，稀释度1∶100，代号M0879；ABC试剂盒，购自福建迈新公司，Kit9720。
, 百拇医药
1.3 实验动物 BABL/C裸鼠，雄性，共24只，体重20～22g，8～10周龄，由中国科学院肿瘤生物技术研究所提供，医学实验动物合格证明书，编号：0742；裸鼠动物合格证书：医动字第02-49-2号。
2 方法
2.1 裸鼠MKN-45胃腺癌模型建立 裸鼠MKN-45人胃腺癌由中科院肿瘤生物技术研究所提供。裸小鼠皮下移植传代，取传代后14d左右的裸小鼠，无菌操作，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，切成1mm×1mm×1mm小块，置于生理盐水中备用。将切好的瘤块置于18号套管针针口，碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下，局部接种。
2.2 动物分组及用药 将接种后的BABL/C裸鼠，随机分为3组：消痰散结方组、化疗组及空白荷瘤对照组，每组8只，SPF条件下分笼饲养于层流架内。
, http://www.100md.com 消痰散结方组于接种后次日开始每日每只灌服消痰散结方浓缩煎剂0.3mL/次(含
9.2g/kg)，持续灌胃28d。
化疗组，5-FU(5氟尿密啶)应用时间及剂量依照常规化疗方案，并参照陈氏[1]方法，将5-FU生理盐水稀释成7.5g/L，按60mg/kg腹腔注射，1次/周，持续用药3周。
空白荷瘤对照组，接种后次日开始灌服生理盐水0.3mL/次，连续灌胃28d。
2.3 瘤重的测定 第28天拉颈处死裸鼠，从腋部皮下完整剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，于电子天平上称取瘤重。计算抑瘤率，公式为：p抑瘤=(m1×m2)/(m1)×100%(m1为对照组治疗后平均瘤重；m2为用药组治疗后平均瘤重)
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2.4 PCNA的测定 HE染色石蜡切片脱蜡及水，微波修复抗原，每张切片滴加鼠抗人PCNA单抗1滴，在4℃水箱中过夜，用PBS液冲洗3次，滴加生物素化二抗，即每张切片上加1滴链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，DAB显色10min，二甲苯透明、中性树胶封闭。
2.5 阳性判定方法 染色阳性物质呈棕黄色、颗粒状位于胃癌细胞核内[2]。在×100油镜下，随机计数200以上的细胞作为分析基数，计数标记PCNA指数，即被标记细胞在一细胞群中所占的百分率。
IPCNA指数=N阳性细胞数/N细胞分析基数.100%
计算2次，取平均值，如两次相差10%以上，须重新计算。
2.6 统计学处理 采用多个样本均数间两两比较的F检验与不配对资料的t检验，所有数据均经SPMR统计软件处理。
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3 结果
3.1 消痰散结方对裸鼠MKN-45胃腺癌生长的影响
空白荷瘤对照组在将MKN-45人胃腺癌接种于裸鼠皮下后10d左右，开始触及肿瘤，以后逐渐增大，20d后肿瘤生长迅速；中药组亦在10d左右触及肿瘤，但肿瘤生长慢于空白对照组；化疗组约在接种后14d触及肿瘤，且肿瘤生长较为缓慢，但裸鼠消瘦明显，生长状况比中药组差。于28d拉颈处死裸鼠后，取瘤，电子天平上称重，观察抑瘤率，结果如表1。
表1显示，化疗组抑瘤率最高可达65.71%，其瘤重与空白对照组比较存在明显差异(P<0.01)。消痰散结方组为52.72%，与空白对照组比较，P<0.05；但与化疗组比较，两者差异无显著性(P>0.05)。
3.2 瘤组织的病理观察
空白对照组瘤组织中瘤细胞大，呈椭圆形，胞浆红染，细胞核大而色深，核浆比例明显失调，而在化疗组与消痰散结方组中，瘤细胞相对较小，核浆比例也相对接近正常，胞浆中有空泡，核结构模糊(见图1、图2)。
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3.3 消痰散结方对MKN-45人胃腺癌细胞核中PCNA表达的影响
PCNA是细胞增殖标记物，许多研究证实，在生长快速的肿瘤组织中，增殖细胞均呈PCNA阳性反应[3]。表2显示，消痰散结方组PCNA的阳性表达率低于空白对照组(P<0.05)。化疗组PCNA阳性表达率亦明显低于空白对照组(P<0.01)。提示中药组及化疗组细胞增殖程度均不如空白对照组活跃，表明消痰散结方确可抑制肿瘤细胞的增殖。
表1 药物对MKN-45人胃腺癌裸鼠
皮下移植瘤生长的抑制作用 组 别
N/只
m瘤重/(
±s)mg
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p抑瘤/%
空白对照组
8
949.3±271.2
0.00
消痰散结方组
8
448.8±189.6*
52.72
5-FU化疗组
8
324.7±106.8**
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65.71
*与空白对照组比较P<0.05，**P<0.01 表2 消痰散结方对人胃腺癌细胞
中PCNA表达的影响 组 别
N/只
p阳性/(±s)%
t
P
空白对照组
8
57.59±18.70
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消痰散结方组
8
20.45±10.64
4.88
<0.05
5-FU化疗组
8
9.72±2.51
7.18
<0.01
4 讨论
肿瘤细胞的无限增殖在一定程序上反映了肿瘤细胞的代谢和DNA合成状态。PCNA为存在于细胞核内的一种酸性蛋白，为DNA聚合酶的辅酶，参与DNA的合成并在细胞周期中起重要的调控作用[4]。其含量在DNA合成的G1期开始增加，S期达到高峰，G2/M期迅速降低，这种周期性变化恰与细胞的增殖过程相关。因此，目前已将其视为S期细胞标志物，用于细胞增殖动力学研究。我们在动物体内实验中发现，消痰散结方对裸鼠MKN-45胃癌的抑瘤率高于30%，其瘤重与空白对照组比较差异显著。说明消痰散结方确可达到抑制裸鼠MKN-45胃腺癌生长的作用。而在对细胞增殖活性影响的观察中发现，消痰散结方组细胞核中PCNA的阳性表达率明显低于空白对照组，细胞增殖活性降低。
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图1 空白对照组瘤组织病理(HE染色)
核染色较深，核浆比例失调
图2 消痰散结方组瘤组织病理(HE染色)
核着色浅，细胞空泡较多，核浆比例接近正常
祖国医学认为痰为“癌瘤”形成的重要的病理因素之一。中医理论中的痰既是一种脏腑功能失调的病理产物，同时又是一种致病因素，它形成后阻于脏腑经络中，一方面可致气滞血瘀，结而成块，另一方面又可随气机升降流行附着于其他部位形成新的病灶。这一特点与肿瘤的生物学特性相类似，因此，痰浊凝结与癌瘤形成与转移关系密切。依据《素问》中“坚者削之，客者除之……结者散之”的理论，采用消痰散结的方法来祛除这一病理产物，阻断肿瘤的形成与转移。基于以上观点，我们拟定了消痰散结方用于临床治疗胃癌术后患者，取得了较好的疗效，进一步从实验研究角度探讨其对细胞增殖的影响，结果亦表明消痰散结方确可抑制胃腺癌细胞的增殖，从而在一定程度上证实了痰与癌瘤关系的密切。但其抑制细胞增殖的作用环节尚须进一步深入探索。
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作者简介：第一作者，郭晓冬 女，1972年出生，住院医师，硕士生药
参考文献：
[1]陈陵际，张素胤，张周，等.九种抗癌药物对人胃腺癌裸鼠移植瘤MKN-28的治疗作用[J].中国药理学报，1990，11(3)：278
[2]叶挺军，陈咏莲.大肠癌旁粘膜细胞的PCNA和Agnors表达观察[J].第二军医大学学报，1995，16(3)：257
[3]Show W,Gregory JH,David B,et al.The P21 inhibitor of cyclindependent kinase control DNA replication by interaction with PCNA [J].Nature,1994,369:547
[4]曹世龙主编.肿瘤学新理论与新技术[M].上海：上海科技教育出版社，1997.753
收稿日期：1999-09-20, 百拇医药
单位：第二军医大学长征医院，上海 200003
关键词：@消痰散结方；药理学；胃肿瘤；中药疗法；燥湿化痰；@增殖细胞核抗原
广州中医药大学学报000218摘要：目的：立足于痰浊凝结为癌瘤形成与转移的重要病理因素之一，设计观察了消痰散结方(半夏、胆南星、茯苓、枳实、陈皮、炙甘草等组成)对裸鼠胃腺癌体内生长的抑制作用及其对胃癌组织中增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法：建立裸鼠MKN-45胃腺癌模型，采用免疫组化ABC法检测胃癌组织中PCNA的阳性表达率，同时观察了不同用药组瘤组织重量和病理学变化。结果：在裸鼠体内实验观察中，消痰散结方组抑瘤率大于30%，其瘤重明显低于空白对照组(P<0.05)；与化疗组比较，无统计学差异(P>0.05)。中药组裸鼠胃癌组织PCNA表达水平明显低于空白对照组(P<0.05)，表明细胞增殖活性降低。结论：消痰散结方可抑制裸鼠胃癌的生长，降低胃癌细胞的增殖活性。
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中图分类号：R735.2 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)02-0152-03
癌细胞是由正常细胞转化而来，是细胞的增殖与分化调控的失调。肿瘤细胞的持续无限制的增殖，又可进一步导致肿瘤的浸润与转移。增殖细胞核抗原(PCNA)，是近年发现的一种与细胞增殖周期密切相关的核蛋白。我们通过建立裸鼠胃腺癌模型，观察了消痰散结方对裸鼠胃腺癌体内生长的抑制作用，并检测胃癌组织中PCNA的表达水平，初步探讨了消痰散结方对胃癌细胞增殖的影响作用，现报告如下。
1 材料
1.1 消痰散结方水煎液的制备 半夏15g、胆南星15g、茯苓15g、枳实10g、陈皮10g、炙甘草6g等以常规方法煎煮，并浓缩至含生药0.461kg/L备用。
1.2 主要试剂 鼠抗人PCNA单抗，购自美国DAKO公司，稀释度1∶100，代号M0879；ABC试剂盒，购自福建迈新公司，Kit9720。
, 百拇医药
1.3 实验动物 BABL/C裸鼠，雄性，共24只，体重20～22g，8～10周龄，由中国科学院肿瘤生物技术研究所提供，医学实验动物合格证明书，编号：0742；裸鼠动物合格证书：医动字第02-49-2号。
2 方法
2.1 裸鼠MKN-45胃腺癌模型建立 裸鼠MKN-45人胃腺癌由中科院肿瘤生物技术研究所提供。裸小鼠皮下移植传代，取传代后14d左右的裸小鼠，无菌操作，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，切成1mm×1mm×1mm小块，置于生理盐水中备用。将切好的瘤块置于18号套管针针口，碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下，局部接种。
2.2 动物分组及用药 将接种后的BABL/C裸鼠，随机分为3组：消痰散结方组、化疗组及空白荷瘤对照组，每组8只，SPF条件下分笼饲养于层流架内。
, http://www.100md.com 消痰散结方组于接种后次日开始每日每只灌服消痰散结方浓缩煎剂0.3mL/次(含
9.2g/kg)，持续灌胃28d。
化疗组，5-FU(5氟尿密啶)应用时间及剂量依照常规化疗方案，并参照陈氏[1]方法，将5-FU生理盐水稀释成7.5g/L，按60mg/kg腹腔注射，1次/周，持续用药3周。
空白荷瘤对照组，接种后次日开始灌服生理盐水0.3mL/次，连续灌胃28d。
2.3 瘤重的测定 第28天拉颈处死裸鼠，从腋部皮下完整剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，于电子天平上称取瘤重。计算抑瘤率，公式为：p抑瘤=(m1×m2)/(m1)×100%(m1为对照组治疗后平均瘤重；m2为用药组治疗后平均瘤重)
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2.4 PCNA的测定 HE染色石蜡切片脱蜡及水，微波修复抗原，每张切片滴加鼠抗人PCNA单抗1滴，在4℃水箱中过夜，用PBS液冲洗3次，滴加生物素化二抗，即每张切片上加1滴链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，DAB显色10min，二甲苯透明、中性树胶封闭。
2.5 阳性判定方法 染色阳性物质呈棕黄色、颗粒状位于胃癌细胞核内[2]。在×100油镜下，随机计数200以上的细胞作为分析基数，计数标记PCNA指数，即被标记细胞在一细胞群中所占的百分率。
IPCNA指数=N阳性细胞数/N细胞分析基数.100%
计算2次，取平均值，如两次相差10%以上，须重新计算。
2.6 统计学处理 采用多个样本均数间两两比较的F检验与不配对资料的t检验，所有数据均经SPMR统计软件处理。
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3 结果
3.1 消痰散结方对裸鼠MKN-45胃腺癌生长的影响
空白荷瘤对照组在将MKN-45人胃腺癌接种于裸鼠皮下后10d左右，开始触及肿瘤，以后逐渐增大，20d后肿瘤生长迅速；中药组亦在10d左右触及肿瘤，但肿瘤生长慢于空白对照组；化疗组约在接种后14d触及肿瘤，且肿瘤生长较为缓慢，但裸鼠消瘦明显，生长状况比中药组差。于28d拉颈处死裸鼠后，取瘤，电子天平上称重，观察抑瘤率，结果如表1。
表1显示，化疗组抑瘤率最高可达65.71%，其瘤重与空白对照组比较存在明显差异(P<0.01)。消痰散结方组为52.72%，与空白对照组比较，P<0.05；但与化疗组比较，两者差异无显著性(P>0.05)。
3.2 瘤组织的病理观察
空白对照组瘤组织中瘤细胞大，呈椭圆形，胞浆红染，细胞核大而色深，核浆比例明显失调，而在化疗组与消痰散结方组中，瘤细胞相对较小，核浆比例也相对接近正常，胞浆中有空泡，核结构模糊(见图1、图2)。
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3.3 消痰散结方对MKN-45人胃腺癌细胞核中PCNA表达的影响
PCNA是细胞增殖标记物，许多研究证实，在生长快速的肿瘤组织中，增殖细胞均呈PCNA阳性反应[3]。表2显示，消痰散结方组PCNA的阳性表达率低于空白对照组(P<0.05)。化疗组PCNA阳性表达率亦明显低于空白对照组(P<0.01)。提示中药组及化疗组细胞增殖程度均不如空白对照组活跃，表明消痰散结方确可抑制肿瘤细胞的增殖。
表1 药物对MKN-45人胃腺癌裸鼠
皮下移植瘤生长的抑制作用 组 别
N/只
m瘤重/(
±s)mg, http://www.100md.com
p抑瘤/%
空白对照组
8
949.3±271.2
0.00
消痰散结方组
8
448.8±189.6*
52.72
5-FU化疗组
8
324.7±106.8**
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65.71
*与空白对照组比较P<0.05，**P<0.01 表2 消痰散结方对人胃腺癌细胞
中PCNA表达的影响 组 别
N/只
p阳性/(
±s)%t
P
空白对照组
8
57.59±18.70
, http://www.100md.com
消痰散结方组
8
20.45±10.64
4.88
<0.05
5-FU化疗组
8
9.72±2.51
7.18
<0.01
4 讨论
肿瘤细胞的无限增殖在一定程序上反映了肿瘤细胞的代谢和DNA合成状态。PCNA为存在于细胞核内的一种酸性蛋白，为DNA聚合酶的辅酶，参与DNA的合成并在细胞周期中起重要的调控作用[4]。其含量在DNA合成的G1期开始增加，S期达到高峰，G2/M期迅速降低，这种周期性变化恰与细胞的增殖过程相关。因此，目前已将其视为S期细胞标志物，用于细胞增殖动力学研究。我们在动物体内实验中发现，消痰散结方对裸鼠MKN-45胃癌的抑瘤率高于30%，其瘤重与空白对照组比较差异显著。说明消痰散结方确可达到抑制裸鼠MKN-45胃腺癌生长的作用。而在对细胞增殖活性影响的观察中发现，消痰散结方组细胞核中PCNA的阳性表达率明显低于空白对照组，细胞增殖活性降低。
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图1 空白对照组瘤组织病理(HE染色)
核染色较深，核浆比例失调
图2 消痰散结方组瘤组织病理(HE染色)
核着色浅，细胞空泡较多，核浆比例接近正常
祖国医学认为痰为“癌瘤”形成的重要的病理因素之一。中医理论中的痰既是一种脏腑功能失调的病理产物，同时又是一种致病因素，它形成后阻于脏腑经络中，一方面可致气滞血瘀，结而成块，另一方面又可随气机升降流行附着于其他部位形成新的病灶。这一特点与肿瘤的生物学特性相类似，因此，痰浊凝结与癌瘤形成与转移关系密切。依据《素问》中“坚者削之，客者除之……结者散之”的理论，采用消痰散结的方法来祛除这一病理产物，阻断肿瘤的形成与转移。基于以上观点，我们拟定了消痰散结方用于临床治疗胃癌术后患者，取得了较好的疗效，进一步从实验研究角度探讨其对细胞增殖的影响，结果亦表明消痰散结方确可抑制胃腺癌细胞的增殖，从而在一定程度上证实了痰与癌瘤关系的密切。但其抑制细胞增殖的作用环节尚须进一步深入探索。
, 百拇医药
作者简介：第一作者，郭晓冬 女，1972年出生，住院医师，硕士生药
参考文献：
[1]陈陵际，张素胤，张周，等.九种抗癌药物对人胃腺癌裸鼠移植瘤MKN-28的治疗作用[J].中国药理学报，1990，11(3)：278
[2]叶挺军，陈咏莲.大肠癌旁粘膜细胞的PCNA和Agnors表达观察[J].第二军医大学学报，1995，16(3)：257
[3]Show W,Gregory JH,David B,et al.The P21 inhibitor of cyclindependent kinase control DNA replication by interaction with PCNA [J].Nature,1994,369:547
[4]曹世龙主编.肿瘤学新理论与新技术[M].上海：上海科技教育出版社，1997.753
收稿日期：1999-09-20, 百拇医药