带肌瓣复合骨形态发生蛋白形成骨桥修复骨缺损△
作者：裴国献 杨润功 魏宽海 金丹
单位：第一军医大学南方医院创伤骨科，广州 510515
关键词：带血供肌瓣；骨形态发生蛋白(BMP)；骨缺损；修复
中国矫形外科杂志000218摘 要：目的：探讨带血供肌瓣作为骨形态发生蛋白(BMP)载体修复骨缺损的可行性。方法：将新西兰大白兔前肢指深屈肌转位至桡骨下段12mm骨缺损区，分带血供肌瓣复合BMP组和单纯BMP组进行观察检测。结果：以带血供肌瓣复合BMP修复骨缺损，3周时肌瓣内可触及串珠状团块，有大量软骨细胞生成，沿肌间隙分布。6周时骨桥已与宿主骨紧密结合，软骨溶解区有大量编织骨形成，已出现骨髓腔并与宿主骨髓腔再通，肌纤维被增殖的间充质细胞、软骨细胞及结缔组织所分割。新生骨湿重较单纯BMP组明显增高。结论：带血供肌瓣可作为BMP的良好载体。
分类号：R322.71 文献标识码：A
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文章编号：1005-8478(2000)02-0156-04
Experimental Study on Vascular Muscle Flap as a Carrier of BMP to Repair Long Bone Defect
PEI Guo-xian,YANG Run-gong,WEI Kuan-hai,et al.
(Department of Orthopedics and Traumatology,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Abstract：Objective:To investigate the effect of vascular muscle flap as a carrier of bone morphogenetic protein (BMP) to repair long bone defect.Methods:20 forelimbs of 10 New Zealand white rabbits were divided into 2 groups randomly.12mm radius bone defect was made.Vascular muscle flap with BMP was implanted in one group and BMP alone was implanted in the other as control.Gross and histological observation,x-ray examination and wet bone weight measurement were carried out at 3 weeks and 6 weeks postoperatively.Results:In the group of vascular muscle flap combined with BMP,the bone defect was filled up with new bone tissue formed in the muscle flap at 3 weeks.The new bone tissue bridged the bone defect at 6 weeks.Histological examination showed that a large amount of cartilage was formed in the gaps of muscles at 3 weeks.The cartilage was absorbed and replaced by normal bone containing hematopoietic bone marrow at 6 weeks with obvious muscle cell atrophy.The wet bone weight of the new bone was 253.52±20.63 mg,which is significantly larger than that of the control group 172.22±13.95mg.Conclusion:Vascular muscle flap can be used as an effective carrier to keep BMP stable in the bone defect and provide target cells for bone formation as well.Muscle fibers can direct of new bone formation that was induced by BMP.Based on good blood supply and a large amount of target cells,the vascular muscle flap which was combined with BMP or other growth factors would play an important role in the therapy of bone defect.This study provide a new idea in the clinical repair of long bone defect.
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Key words：Vascular muscle flap Bone morphogenetic protein(BMP) Bone defect Repair▲
骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)是广泛存在于骨胶原纤维、骨膜、骨髓基质中的一种酸性糖蛋白，无种族特异性。BMP扩散力强，易于被组织酶类降解，直接将其植入体内，易被血液冲涮掉，并迅速弥散、转运、降解而不能充分发挥其生物学活性[1]，因此如果直接用来修复骨缺损或骨不连，则因为没有载体而不易放置。以往文献已报道过多种载体，钙磷陶瓷类虽有一定作用，但生物活性差、吸收降解缓慢且不完全，长期滞留不仅妨碍骨小梁的通过，而且妨碍骨组织的二期改建和完全修复；石膏、煅石膏虽吸收较快，但其中的钙和杂质对人体可能有害；胶原、纤维蛋白粘合剂等生物性载体缺乏支架功能；人工合成载体如聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)则存在着吸收降解时间长影响骨重建，以及局部血循环差时只能形成纤维连接而不能诱导骨连接的缺点，同时受骨折内固定的影响也较大；同种或异种脱钙骨基质、烧结骨(TBC)制备过程相对复杂，且供源有限。因此优选、优化载体是BMP进一步应用亟待解决的问题。已往研究表明肌肉中的间充质细胞是骨骼外对BMP反应最为敏感的组织细胞[2]，本研究旨在探讨以骨骼肌为材料而制成的带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损的可行性。
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1 材料和方法
1.1 动物的选择和分组
纯种健康成年新西兰大白兔10只，体重1.5～2.5kg，雌雄不限，每只兔双前肢造成12mm桡骨-骨膜缺损，自体左右对比，分别植入带血供肌瓣与BMP的复合物(肌瓣组)和单纯BMP(单纯BMP组)，BMP植入量根据有关的资料参考，定为5mg/缺损[2]。重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)由军事医学科学院基础医学研究所生物化学研究室提供。
1.2 手术方法
在前肢的前内侧行“S”形切口，长约2.5cm。分离筋膜、肌肉等软组织，暴露桡骨中下段，用牙科台钻螺旋头切除12mm桡骨及其骨膜，造成骨缺损，盐水冲洗局部，清除骨屑。而后以正中动脉的指深屈肌肌支为蒂切取岛状的指深屈肌瓣，形状及大小与缺损相当，并切断进入该肌的神经支。切取后通过隧道转移至桡骨中下段缺损处(肌肉注意严密止血)，并将肌肉的两端用丝线固定在桡骨两断端骨膜或软组织上，然后将5mg rhBMP2分远、中、近三点均匀地植入肌瓣中，注意不要破坏肌瓣的血供(图1)。植入后肌瓣与骨折面作适当的缝合，注意勿损伤或压迫血管蒂，并使蒂部保持适当的松紧度防止扭转。缝合深筋膜，关闭皮肤切口。适当作外固定，防止岛状肌瓣转移后引起蒂部血管痉挛造成肌瓣的缺血与坏死。1周后可去除外固定，7～10d拆除缝线。同一个体的对侧骨-骨膜缺损处则直接植入5mg rhBMP-2后关闭切口，作为对照。所有实验兔术后均使用抗生素3d。
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图1 以正中动脉的分支为血管蒂切取的屈指深肌瓣(植入后)。
1.3 检测方法
1.3.1 一般情况 手术后兔于笼中用全价标准兔饲料喂养，观察伤口、食欲、肢体的功能恢复和全身反应情况。
1.3.2 大体标本观察及X线片观察 手术后分别于3周和6周各处死5只动物，行X线摄片及大体观察，截取包括部分宿主骨的缺损区组织1.5cm称湿重。观察标本颜色、质地、血管形成、成骨情况，新生骨组织与宿主骨连接情况。
1.3.3 组织学观察 取材后标本于10%中性福尔马林液中固定48h，置复合脱钙液脱钙24h(视情况可适当延长，至可顺利用针刺入为止)，75%酒精固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，作5um切片，HE染色后光镜观察。
2 结 果
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2.1 一般情况
动物术后顺利成活，麻醉清醒后恢复正常食欲。由于外固定，前肢活动稍受限，1周时解除外固定后活动恢复正常，切口均未发生感染、化脓、骨髓炎现象。
2.2 大体标本观察
肌瓣组术后3周时骨缺损区移植肌肉形态改变，肌瓣内可触及串珠状团块，稍硬，淡黄色，与肌肉组织界限不清，串珠状团块已将骨缺损两端连接，两断端骨膜增生。6周时新生组织呈条索状桥接两断端，与宿主骨界限模糊，比较稳固。新生组织有红骨髓，在尺骨侧有部分和尺骨融合在一起(图2)。单纯BMP组，3周时在缺损区偏尺侧有不规则的新生组织，量少，未能连接骨缺损。6周时在尺骨侧出现凹状新生骨组织，其中两例已桥接骨缺损，但无论在数量上还是在质量上、外形上均差于肌瓣组(图3)。湿重比较结果为肌瓣组为253.52mg±20.36mg，单纯BMP组为172.22mg±13.95mg，两者有显著的差异(t=3.637,P<0.01)。
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图2 6周时带血供肌瓣复合BMP已桥接骨缺损(下为尺骨，上为桡骨)。
图3 6周时骨缺损区单纯植入BMP新生骨呈凹状(下为尺骨，上为桡骨)。
2.3 X线检查
肌瓣组3周时在骨缺损区出现与缺损长轴一致的条索状云雾阴影，并与两缺损端相接触，骨断端有骨膜反应；6周时缺损区已连接，新生组织填塞于缺损区内，密度低于正常骨，新生骨已与宿主骨融合，并有骨髓腔形成、再通(图4)。单纯BMP组3周时在偏尺侧出现不规则的低密度云雾状阴影，骨缺损断端较清晰，6周时在偏尺骨侧出现凹状的新生骨，个别标本出现狭窄的骨髓腔。以上两组骨缺损的修复不是由两端骨痂向中心会师，而是由缺损区分三点向两侧生长，最后将两端连接(图5)。
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图4 6周时X线观察带血供肌瓣复合BMP组可见大量的新生骨形成，骨髓腔再通。
图5 单纯BMP组6周时X线显示凹状新生骨形成，形状不规则。
2.4 组织学检查
肌瓣组3周时植入之rhBMP-2吸收消失，可见大量间充质细胞聚集、增生，软骨岛形成，并沿肌间隙排列。肌纤维被分割成条索状，结构退变，细胞皱缩，细胞核位于肌纤维周边区，染色质沿核膜凝缩，出现边集现象。肌瓣的横断面上“孔海姆(Cohnheim)”区消失，周围可见巨噬细胞，但无炎性细胞浸润，新生组织与宿主骨在个别视野出现纤维连接(图6)。6周时软骨细胞团出现不规则的溶解区，大量编织骨形成，基质呈嗜碱性。可见不规则的骨小梁结构，骨细胞分布无规律，体积较大，形状不规则，新生组织和宿主骨连为一体。骨髓腔可见红骨髓。肌纤维基本消失，剩下的细胞核数量增多(图7)。单纯BMP组新生组织内也可见大量的间充质细胞聚集、增生，软骨细胞形成，未见肌肉组织或退变的肌肉组织，6周时可见有部分骨小梁、少量编织骨形成，数量及成熟程度差于肌瓣组。
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图6 3周时肌瓣BMP组新生组织可见有大量软骨细胞生成。(HE染色×200)。
图7 6周时肌瓣BMP组大量编织骨形成，肌间有大量结缔组织增生，肌纤维退变。(HE染色×100)。
3 讨 论
3.1 肌瓣的载体功能
3.1.1 带血供肌瓣内的间充质细胞可为BMP提供靶细胞来源 诱导成骨需要三个条件：诱导因子、靶细胞和良好的血液供应[3]，在转移的带血供肌瓣中植入BMP同时满足了上述三个条件，所以本实验中用带血供肌瓣复合BMP来桥接骨缺损获得良好的成骨效果。
3.1.2 带血供肌瓣对BMP起到缓慢释放作用 将BMP植入作为载体的肌瓣中，其扩散过程中首先作用于肌瓣内的靶细胞，减少了BMP的浪费和无意义的扩散。手术中肌瓣周围经过严密止血，且两端直接和骨缺损两端相接，减少了BMP被血液冲涮掉的机率，从而减缓了BMP的释放。
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3.1.3 肌纤维为BMP成骨提供了方向性 肌纤维有一定的形状并沿一定的方向排列，为BMP提供了良好的诱导支架。一般来说有支架功能的载体需要预先赋形，所以很难有正好合适、可满足临床实际需要的不规则形状。而带血供肌瓣则可克服这一缺点，既具有支架功能，又能很好地和实际缺损区相嵌合。实验结果也表明骨缺损区单纯植入BMP因缺乏支架引导，间充质细胞无法倚托，分化的细胞易受周围组织压迫被挤压向缺损区一侧，较难在整个缺损区内诱导成骨，生长形状不规则，影响了修复质量与效果。
3.1.4 肌瓣本身的一系列形态结构变化和内源性BMP共同作用促进了缺损修复 Tamai[4]行吻合血管神经的狗股直肌原位移植及自体移位移植，发现带血供肌瓣转移移植，要经历一个退变、再生和功能恢复的过程。本实验中肌瓣去除了神经支配，肌肉退变程度要更甚，发生失用性萎缩和失神经性萎缩。但正因为这样，肌纤维在发挥引导间充质细胞分化的作用之后迅速地发生退变，减少了对再生骨的阻遏和占位。这一系列变化实际上更有利于BMP诱导作用的发挥，使得同样量的BMP诱导肌瓣成骨要多于诱导原位肌肉的成骨量。另外缺损两端骨组织受到刺激或由于碎骨基质吸收而释放出的内源性BMP等生长因子可诱导断端附近的未分化间充质细胞分化为具有成骨能力的细胞[5]；用PCR及原位杂交技术测得骨组织损伤部位的肌肉也有BMP的mRNA的表达[6]，这都对肌瓣的诱导成骨产生积极影响。
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3.1.5 临床现象为肌瓣作为BMP载体提供了佐证 以往有学者认为骨折愈合的细胞来源于肌肉细胞，并有肌肉组织直接覆盖于骨折端促进骨愈合的设想[7]；临床上可见肢体创伤及骨科手术后异位骨化现象；骨良性肿瘤、慢性骨髓炎刮除术后缺损区常采用肌瓣填塞，经过一段时间钙化达到愈合目的，这些现象也为带血供肌瓣作为BMP载体能够修复骨缺损提供了有力的佐证。
3.1.6 带血供肌瓣取材方便、无排斥反应之虑 带血供肌瓣在实验上、临床上有着广泛的应用，可用来修复软组织缺损、填塞慢性骨髓炎和骨囊肿等术后死腔，行功能重建。也可利用肌肉良好的基底膜管制成肌瓣桥来桥接神经缺损。它取材方便，来源广泛，系自身组织，不用考虑免疫排斥及生物相容性问题。基于这些优点，使得带血供肌瓣作为BMP的良好载体来修复骨缺损获得满意的成骨效果，以上种种优点也是其它载体所不可比拟的。
3.2 肌瓣载体中肌细胞转归的组织学观察
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肌组织要维持其正常的形态结构，必须同时具备三个因素(1)充足的血供；(2)完整的神经支配；(3)生理状态下的机械性张力。以带血供肌瓣作为BMP载体移植到骨缺损区，肌组织失去了维持其正常形态所必需的后两项因素，必然发生失用性萎缩和失神经性萎缩。另外再生软骨、骨组织的逐渐增多，使肌细胞失去了生存的空间。从本实验组织学观察到3周时所有肌纤维变得细小，周边凹陷而成具有梭角的断面，肌细胞皱缩，胞膜完整，染色质沿核膜凝缩，出现核边集，周围可见巨噬细胞，未见炎症反应及炎症细胞等，6周时新生组织中肌肉纤维基本消失，为纤维结缔组织细胞、成骨细胞和骨细胞所替代。据此可以认为肌细胞发生了“凋亡(apotosis)”现象[8]，但是用特异的方法检测及具体的凋亡过程，还需要进一步研究。
3.3 应用前景
以带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损动物实验初步获得成功，预示着肌肉组织在修复肌肉、神经缺损的基础上又具有骨修复的能力，所不同的是需要给予一定的外在条件。对于骨缺损伴有皮肤缺损或皮肤瘢痕形成，可采用肌皮瓣移植，在肌瓣修复骨缺损的同时利用其表面的皮瓣一期修复皮肤缺损，从而大大缩短病程，提高手术疗效。此方法扩大了肌瓣的应用范围，给传统的肌瓣移植术赋予了新的内涵，同时也丰富了显微外科的内容，是骨缺损治疗观念上的更新。
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(本文附图见插页4)■
基金项目：△本课题为国家自然科学基金资助项目(基金编号 39870881)
作者简介：裴国献(1954-)，男，河南籍，主任医师，医学博士。研究方向：严重肢体创伤的修复重建、骨组织工程.
电话：(020)85141741(办)85141751(宅) 传真：(020)85141741
参考文献：
[1]Prolo DJ,Rodrigo JJ.Contemporary bone graft physiology and surgey[J].Clin Orthop,1985,200:322.
[2]赵明，王会信，周延冲.重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性[J].生物化学杂志，1994，10：319.
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[3]Chalmers D.Observation on the inducton bone in soft tissues [J]. J Bone Joint Surg (Br),1975,57(10):3645.
[4]Tamai S.Free muscle transplants in dogs,with microsurgical neurovascular anastomoses[J].Plast Reconstr Surg,1970,46:219.
[5]Simmons DJ.Fracture healing prespectives.Clin Orthop,1985,200:100.
[6]Nakase T,Nomura S,Yoshikawa H,et al.Transient and localized expression of bone morphogenetic protien 4 messenger RNA during fracture healing [J].J Bone Miner Res,1994,9:651.
[7]朱建民，金宗达.骨折愈合的分子生物学进展[J].中华骨科杂志，1993，6：456.
[8]Koseki C,Herzlingr D,Al-Awqati Q.Apoptosis in metan-
ephricc deveplopment[J],J Cell Biol,1992,119:1327.
收稿日期：1999-09-20
修回日期：1999-10-20, http://www.100md.com
单位：第一军医大学南方医院创伤骨科，广州 510515
关键词：带血供肌瓣；骨形态发生蛋白(BMP)；骨缺损；修复
中国矫形外科杂志000218摘 要：目的：探讨带血供肌瓣作为骨形态发生蛋白(BMP)载体修复骨缺损的可行性。方法：将新西兰大白兔前肢指深屈肌转位至桡骨下段12mm骨缺损区，分带血供肌瓣复合BMP组和单纯BMP组进行观察检测。结果：以带血供肌瓣复合BMP修复骨缺损，3周时肌瓣内可触及串珠状团块，有大量软骨细胞生成，沿肌间隙分布。6周时骨桥已与宿主骨紧密结合，软骨溶解区有大量编织骨形成，已出现骨髓腔并与宿主骨髓腔再通，肌纤维被增殖的间充质细胞、软骨细胞及结缔组织所分割。新生骨湿重较单纯BMP组明显增高。结论：带血供肌瓣可作为BMP的良好载体。
分类号：R322.71 文献标识码：A
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文章编号：1005-8478(2000)02-0156-04
Experimental Study on Vascular Muscle Flap as a Carrier of BMP to Repair Long Bone Defect
PEI Guo-xian,YANG Run-gong,WEI Kuan-hai,et al.
(Department of Orthopedics and Traumatology,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Abstract：Objective:To investigate the effect of vascular muscle flap as a carrier of bone morphogenetic protein (BMP) to repair long bone defect.Methods:20 forelimbs of 10 New Zealand white rabbits were divided into 2 groups randomly.12mm radius bone defect was made.Vascular muscle flap with BMP was implanted in one group and BMP alone was implanted in the other as control.Gross and histological observation,x-ray examination and wet bone weight measurement were carried out at 3 weeks and 6 weeks postoperatively.Results:In the group of vascular muscle flap combined with BMP,the bone defect was filled up with new bone tissue formed in the muscle flap at 3 weeks.The new bone tissue bridged the bone defect at 6 weeks.Histological examination showed that a large amount of cartilage was formed in the gaps of muscles at 3 weeks.The cartilage was absorbed and replaced by normal bone containing hematopoietic bone marrow at 6 weeks with obvious muscle cell atrophy.The wet bone weight of the new bone was 253.52±20.63 mg,which is significantly larger than that of the control group 172.22±13.95mg.Conclusion:Vascular muscle flap can be used as an effective carrier to keep BMP stable in the bone defect and provide target cells for bone formation as well.Muscle fibers can direct of new bone formation that was induced by BMP.Based on good blood supply and a large amount of target cells,the vascular muscle flap which was combined with BMP or other growth factors would play an important role in the therapy of bone defect.This study provide a new idea in the clinical repair of long bone defect.
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Key words：Vascular muscle flap Bone morphogenetic protein(BMP) Bone defect Repair▲
骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)是广泛存在于骨胶原纤维、骨膜、骨髓基质中的一种酸性糖蛋白，无种族特异性。BMP扩散力强，易于被组织酶类降解，直接将其植入体内，易被血液冲涮掉，并迅速弥散、转运、降解而不能充分发挥其生物学活性[1]，因此如果直接用来修复骨缺损或骨不连，则因为没有载体而不易放置。以往文献已报道过多种载体，钙磷陶瓷类虽有一定作用，但生物活性差、吸收降解缓慢且不完全，长期滞留不仅妨碍骨小梁的通过，而且妨碍骨组织的二期改建和完全修复；石膏、煅石膏虽吸收较快，但其中的钙和杂质对人体可能有害；胶原、纤维蛋白粘合剂等生物性载体缺乏支架功能；人工合成载体如聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)则存在着吸收降解时间长影响骨重建，以及局部血循环差时只能形成纤维连接而不能诱导骨连接的缺点，同时受骨折内固定的影响也较大；同种或异种脱钙骨基质、烧结骨(TBC)制备过程相对复杂，且供源有限。因此优选、优化载体是BMP进一步应用亟待解决的问题。已往研究表明肌肉中的间充质细胞是骨骼外对BMP反应最为敏感的组织细胞[2]，本研究旨在探讨以骨骼肌为材料而制成的带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损的可行性。
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1 材料和方法
1.1 动物的选择和分组
纯种健康成年新西兰大白兔10只，体重1.5～2.5kg，雌雄不限，每只兔双前肢造成12mm桡骨-骨膜缺损，自体左右对比，分别植入带血供肌瓣与BMP的复合物(肌瓣组)和单纯BMP(单纯BMP组)，BMP植入量根据有关的资料参考，定为5mg/缺损[2]。重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)由军事医学科学院基础医学研究所生物化学研究室提供。
1.2 手术方法
在前肢的前内侧行“S”形切口，长约2.5cm。分离筋膜、肌肉等软组织，暴露桡骨中下段，用牙科台钻螺旋头切除12mm桡骨及其骨膜，造成骨缺损，盐水冲洗局部，清除骨屑。而后以正中动脉的指深屈肌肌支为蒂切取岛状的指深屈肌瓣，形状及大小与缺损相当，并切断进入该肌的神经支。切取后通过隧道转移至桡骨中下段缺损处(肌肉注意严密止血)，并将肌肉的两端用丝线固定在桡骨两断端骨膜或软组织上，然后将5mg rhBMP2分远、中、近三点均匀地植入肌瓣中，注意不要破坏肌瓣的血供(图1)。植入后肌瓣与骨折面作适当的缝合，注意勿损伤或压迫血管蒂，并使蒂部保持适当的松紧度防止扭转。缝合深筋膜，关闭皮肤切口。适当作外固定，防止岛状肌瓣转移后引起蒂部血管痉挛造成肌瓣的缺血与坏死。1周后可去除外固定，7～10d拆除缝线。同一个体的对侧骨-骨膜缺损处则直接植入5mg rhBMP-2后关闭切口，作为对照。所有实验兔术后均使用抗生素3d。
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图1 以正中动脉的分支为血管蒂切取的屈指深肌瓣(植入后)。
1.3 检测方法
1.3.1 一般情况 手术后兔于笼中用全价标准兔饲料喂养，观察伤口、食欲、肢体的功能恢复和全身反应情况。
1.3.2 大体标本观察及X线片观察 手术后分别于3周和6周各处死5只动物，行X线摄片及大体观察，截取包括部分宿主骨的缺损区组织1.5cm称湿重。观察标本颜色、质地、血管形成、成骨情况，新生骨组织与宿主骨连接情况。
1.3.3 组织学观察 取材后标本于10%中性福尔马林液中固定48h，置复合脱钙液脱钙24h(视情况可适当延长，至可顺利用针刺入为止)，75%酒精固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，作5um切片，HE染色后光镜观察。
2 结 果
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2.1 一般情况
动物术后顺利成活，麻醉清醒后恢复正常食欲。由于外固定，前肢活动稍受限，1周时解除外固定后活动恢复正常，切口均未发生感染、化脓、骨髓炎现象。
2.2 大体标本观察
肌瓣组术后3周时骨缺损区移植肌肉形态改变，肌瓣内可触及串珠状团块，稍硬，淡黄色，与肌肉组织界限不清，串珠状团块已将骨缺损两端连接，两断端骨膜增生。6周时新生组织呈条索状桥接两断端，与宿主骨界限模糊，比较稳固。新生组织有红骨髓，在尺骨侧有部分和尺骨融合在一起(图2)。单纯BMP组，3周时在缺损区偏尺侧有不规则的新生组织，量少，未能连接骨缺损。6周时在尺骨侧出现凹状新生骨组织，其中两例已桥接骨缺损，但无论在数量上还是在质量上、外形上均差于肌瓣组(图3)。湿重比较结果为肌瓣组为253.52mg±20.36mg，单纯BMP组为172.22mg±13.95mg，两者有显著的差异(t=3.637,P<0.01)。
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图2 6周时带血供肌瓣复合BMP已桥接骨缺损(下为尺骨，上为桡骨)。
图3 6周时骨缺损区单纯植入BMP新生骨呈凹状(下为尺骨，上为桡骨)。
2.3 X线检查
肌瓣组3周时在骨缺损区出现与缺损长轴一致的条索状云雾阴影，并与两缺损端相接触，骨断端有骨膜反应；6周时缺损区已连接，新生组织填塞于缺损区内，密度低于正常骨，新生骨已与宿主骨融合，并有骨髓腔形成、再通(图4)。单纯BMP组3周时在偏尺侧出现不规则的低密度云雾状阴影，骨缺损断端较清晰，6周时在偏尺骨侧出现凹状的新生骨，个别标本出现狭窄的骨髓腔。以上两组骨缺损的修复不是由两端骨痂向中心会师，而是由缺损区分三点向两侧生长，最后将两端连接(图5)。
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图4 6周时X线观察带血供肌瓣复合BMP组可见大量的新生骨形成，骨髓腔再通。
图5 单纯BMP组6周时X线显示凹状新生骨形成，形状不规则。
2.4 组织学检查
肌瓣组3周时植入之rhBMP-2吸收消失，可见大量间充质细胞聚集、增生，软骨岛形成，并沿肌间隙排列。肌纤维被分割成条索状，结构退变，细胞皱缩，细胞核位于肌纤维周边区，染色质沿核膜凝缩，出现边集现象。肌瓣的横断面上“孔海姆(Cohnheim)”区消失，周围可见巨噬细胞，但无炎性细胞浸润，新生组织与宿主骨在个别视野出现纤维连接(图6)。6周时软骨细胞团出现不规则的溶解区，大量编织骨形成，基质呈嗜碱性。可见不规则的骨小梁结构，骨细胞分布无规律，体积较大，形状不规则，新生组织和宿主骨连为一体。骨髓腔可见红骨髓。肌纤维基本消失，剩下的细胞核数量增多(图7)。单纯BMP组新生组织内也可见大量的间充质细胞聚集、增生，软骨细胞形成，未见肌肉组织或退变的肌肉组织，6周时可见有部分骨小梁、少量编织骨形成，数量及成熟程度差于肌瓣组。
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图6 3周时肌瓣BMP组新生组织可见有大量软骨细胞生成。(HE染色×200)。
图7 6周时肌瓣BMP组大量编织骨形成，肌间有大量结缔组织增生，肌纤维退变。(HE染色×100)。
3 讨 论
3.1 肌瓣的载体功能
3.1.1 带血供肌瓣内的间充质细胞可为BMP提供靶细胞来源 诱导成骨需要三个条件：诱导因子、靶细胞和良好的血液供应[3]，在转移的带血供肌瓣中植入BMP同时满足了上述三个条件，所以本实验中用带血供肌瓣复合BMP来桥接骨缺损获得良好的成骨效果。
3.1.2 带血供肌瓣对BMP起到缓慢释放作用 将BMP植入作为载体的肌瓣中，其扩散过程中首先作用于肌瓣内的靶细胞，减少了BMP的浪费和无意义的扩散。手术中肌瓣周围经过严密止血，且两端直接和骨缺损两端相接，减少了BMP被血液冲涮掉的机率，从而减缓了BMP的释放。
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3.1.3 肌纤维为BMP成骨提供了方向性 肌纤维有一定的形状并沿一定的方向排列，为BMP提供了良好的诱导支架。一般来说有支架功能的载体需要预先赋形，所以很难有正好合适、可满足临床实际需要的不规则形状。而带血供肌瓣则可克服这一缺点，既具有支架功能，又能很好地和实际缺损区相嵌合。实验结果也表明骨缺损区单纯植入BMP因缺乏支架引导，间充质细胞无法倚托，分化的细胞易受周围组织压迫被挤压向缺损区一侧，较难在整个缺损区内诱导成骨，生长形状不规则，影响了修复质量与效果。
3.1.4 肌瓣本身的一系列形态结构变化和内源性BMP共同作用促进了缺损修复 Tamai[4]行吻合血管神经的狗股直肌原位移植及自体移位移植，发现带血供肌瓣转移移植，要经历一个退变、再生和功能恢复的过程。本实验中肌瓣去除了神经支配，肌肉退变程度要更甚，发生失用性萎缩和失神经性萎缩。但正因为这样，肌纤维在发挥引导间充质细胞分化的作用之后迅速地发生退变，减少了对再生骨的阻遏和占位。这一系列变化实际上更有利于BMP诱导作用的发挥，使得同样量的BMP诱导肌瓣成骨要多于诱导原位肌肉的成骨量。另外缺损两端骨组织受到刺激或由于碎骨基质吸收而释放出的内源性BMP等生长因子可诱导断端附近的未分化间充质细胞分化为具有成骨能力的细胞[5]；用PCR及原位杂交技术测得骨组织损伤部位的肌肉也有BMP的mRNA的表达[6]，这都对肌瓣的诱导成骨产生积极影响。
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3.1.5 临床现象为肌瓣作为BMP载体提供了佐证 以往有学者认为骨折愈合的细胞来源于肌肉细胞，并有肌肉组织直接覆盖于骨折端促进骨愈合的设想[7]；临床上可见肢体创伤及骨科手术后异位骨化现象；骨良性肿瘤、慢性骨髓炎刮除术后缺损区常采用肌瓣填塞，经过一段时间钙化达到愈合目的，这些现象也为带血供肌瓣作为BMP载体能够修复骨缺损提供了有力的佐证。
3.1.6 带血供肌瓣取材方便、无排斥反应之虑 带血供肌瓣在实验上、临床上有着广泛的应用，可用来修复软组织缺损、填塞慢性骨髓炎和骨囊肿等术后死腔，行功能重建。也可利用肌肉良好的基底膜管制成肌瓣桥来桥接神经缺损。它取材方便，来源广泛，系自身组织，不用考虑免疫排斥及生物相容性问题。基于这些优点，使得带血供肌瓣作为BMP的良好载体来修复骨缺损获得满意的成骨效果，以上种种优点也是其它载体所不可比拟的。
3.2 肌瓣载体中肌细胞转归的组织学观察
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肌组织要维持其正常的形态结构，必须同时具备三个因素(1)充足的血供；(2)完整的神经支配；(3)生理状态下的机械性张力。以带血供肌瓣作为BMP载体移植到骨缺损区，肌组织失去了维持其正常形态所必需的后两项因素，必然发生失用性萎缩和失神经性萎缩。另外再生软骨、骨组织的逐渐增多，使肌细胞失去了生存的空间。从本实验组织学观察到3周时所有肌纤维变得细小，周边凹陷而成具有梭角的断面，肌细胞皱缩，胞膜完整，染色质沿核膜凝缩，出现核边集，周围可见巨噬细胞，未见炎症反应及炎症细胞等，6周时新生组织中肌肉纤维基本消失，为纤维结缔组织细胞、成骨细胞和骨细胞所替代。据此可以认为肌细胞发生了“凋亡(apotosis)”现象[8]，但是用特异的方法检测及具体的凋亡过程，还需要进一步研究。
3.3 应用前景
以带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损动物实验初步获得成功，预示着肌肉组织在修复肌肉、神经缺损的基础上又具有骨修复的能力，所不同的是需要给予一定的外在条件。对于骨缺损伴有皮肤缺损或皮肤瘢痕形成，可采用肌皮瓣移植，在肌瓣修复骨缺损的同时利用其表面的皮瓣一期修复皮肤缺损，从而大大缩短病程，提高手术疗效。此方法扩大了肌瓣的应用范围，给传统的肌瓣移植术赋予了新的内涵，同时也丰富了显微外科的内容，是骨缺损治疗观念上的更新。
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(本文附图见插页4)■
基金项目：△本课题为国家自然科学基金资助项目(基金编号 39870881)
作者简介：裴国献(1954-)，男，河南籍，主任医师，医学博士。研究方向：严重肢体创伤的修复重建、骨组织工程.
电话：(020)85141741(办)85141751(宅) 传真：(020)85141741
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收稿日期：1999-09-20
修回日期：1999-10-20, http://www.100md.com