非协调性异种肝移植后再灌注障碍及超微结构变化的观察
作者：芮晓晖 蔡端 张群华 孙鹏 张延龄
单位：芮晓晖 蔡端 张群华 孙鹏 张延龄(上海医科大学附属华山医院外科教研室,200040)
关键词：异种肝移植；超急性排斥反应；超微结构
肝胆胰外科杂志000217 摘 要 目的: 探讨非协调性异种肝移植供肝再灌注障碍与超急性排斥反应的可能关系。方法:应用改良缝合法建立豚鼠至大鼠的肝移植动物模型，观察供肝再灌注60分钟内门脉灌注和肝脏组织超微结构的变化。结果:移植后60分钟供肝门脉灌注明显减少；肝细胞的线粒体明显肿胀，线 粒体嵴破坏、结构紊乱，内质网扩张、脱粒，肝细胞狄氏间隙消失，肝血窦内可见到血小板 和粒细胞粘附、聚集和血栓形成，部分内皮细胞消失。受体心肌细胞肿胀，肌原纤维排列紊 乱、疏松化和断裂，线粒体呈多形性，大小不等。结论:豚鼠至大鼠非协调性异种肝移植60分钟时有超急性排斥反应的发生， 从而导致供肝的灌注障碍，同时心肌的受损可以进一步加重供肝的微循环障碍。
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【中图分类号】 R364.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1007-1954(2000)02-0090-03
The ultrastructural changes and reperfusi on disturbance of the xenograft following discordant liver xenotransplantation
RUI Xiao-hui,CAI Duan,ZHANG Qun-hua,et al.
(Department of Surgery,Hua shan Hospital of Shanghai Medical University,Shanghai,200040)
Abstract Objective： To determine the possible relationship between the ultrastructural changes and reperfusion d isturbance of the xenograft following discordant liver xenotransplantation.Methods： In the Guinea pig to rat liver transplantation model, the p ortal blood flow(PBF) and the ultrastructural changes of xenografts at 0,30 and 60 minutes were observed after transplantation.Results： The re perfusion state of the xenograft was poor after transplantation. Liver ultrastru ctural findings showed swollen mitochondrias, loss of space of Disse, enlarged e ndoplasmic reticulum and leukocytes infiltration.Conclusion： Hy peracute rejection occurred after xenogeneic liver transplatation ,which leads to the hyporeperfusion of the xenografts.
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Key words liver xenograft; reperfusion ; ultrastructure
在同种肝移植中，由于肝脏的耐受原性，许多移植模型都可在不使用免疫抑制剂的情况下存活。但在异种肝移植中，仍不能避免排斥反应的发生。豚鼠与大鼠之间的器官移植属于非协调性异种移植，豚鼠至大鼠的心脏移植已成为成熟的动物模型，而豚鼠至大鼠的肝脏移植的报道尚少，而且报道该模型产生即刻再灌注障碍的程度与受体存活时间相关。为观察非协调性异种肝移植的超急性排斥反应，我们采用改良缝合法进行了豚鼠至大鼠的肝脏移植，对肝脏再灌注情况和肝脏组织学及超微结构变化作了观察，并与大鼠同种肝移植作了比较。
1 材料和方法
1.1 实验动物 供体分别为雄性豚鼠和雄性SD大鼠，体重200～250g，受体动物为雄性SD大鼠，体重250～300g。受体动物术前8小时禁食但不禁水，供体术前不禁食水。
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1.2 异种肝移植 对王轩[1]等人进行同种肝移植方法的基础改进，进行原位肝移植，共10例。
1.3 同种肝移植 采用王轩[1] 改进缝合法进行SD大鼠同种肝移植，共做10例作对照。
1.4 观察指标 在供肝再灌注后观察供肝血流灌注情况，测定仪器、方法及指标为：以Imexlab 9100多普勒超声诊断仪的8mHz探头(产品号X1-9008)正对血流方向，与血管成30～45°夹角，测定移植肝的门脉血流(PBF)， 听取多普勒声音变化，记录测得波形和波幅。测定时采用单向血流方式，避免静脉回流的干扰，同时开启滤波功能，减少杂波影响。分别测定门脉接通后0，30，60分钟时的PBF。移植60分钟后取肝脏尾状叶作组织学及透射电镜观察，取心肌组织作透射电镜观察。
1.5 数据处理 所得数据以χ±s表示，用t检验进行分 析。
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2 结果
2.1 异种肝移植超急性排斥反应与时限的关系 PV开放后，同种肝移植供肝立刻均匀充血而呈红色，而异种肝移植表现为由肝脏中央开始的逐步充血，并有区域性斑片状灌注，脾脏和小肠均未见到明显淤血现象，门静脉充盈良好。移植1小时后组织学观察发现：异种肝移植可见到肝中央静脉内有血小板和粒细胞聚集，血栓形成，肝细胞变性，肝细胞结构尚存在(见图1)。而同种肝移植无明显血小板、粒细胞聚集和血栓形成。
图1 异种移植组广泛血栓形成及肝细胞变性 ×400
2.2 移植肝门脉血流灌注与超急性排斥反应的关系(附表) 附表 门静脉接通后不同时限波幅的频率变化(
±s，kHz)
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0′
30′
60′
同种移植组
0.422±0.014
0.420±0.018
0.421±0.011
异种移植组
0.401±0.016
0.261±0.014**
0.140±0.014**
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与同种移植相比：** P<0.01
2.3 肝脏和心肌超微结构观察 异种肝移植肝脏组织经透视电镜检查可以发现肝细胞的线粒体明显肿胀，线粒体嵴破坏、结构紊乱，内质网扩张、脱粒，肝细胞狄氏间隙消失，肝细胞窦状隙内可见到血小板和粒细胞粘附、聚集，血栓形成，部分内皮细胞消失(见图2、3)。在电镜下可见到心肌细胞肿胀，肌原纤维排列紊乱、疏松化和断裂，线粒体呈多形性、大小不等。同种肝移植肝细胞线粒体轻度肿胀，窦状隙无血小板和粒细胞粘附，心肌纤维排列整齐。
3 讨论
众多资料表明肝移植术后排斥反应的发生率及程度比其他器官移植较低，从而人们也将肝脏视作一个免疫特惠器官。但是豚鼠至大鼠的原位肝移植属于非协调性异种移植，可发生超急性排斥反应。导致非协调性异种移植超急性排斥反应的主要因素为受体内天然抗体的作用、补体的参与、供体内皮细胞 的活化以及受体凝血系统的作用等。为数不多的文献报道均表明豚鼠至大鼠原位肝移植后发生严重的再灌注障碍，而且与受体的存活期相关 [2,3]。Delriviere[2]等 认为豚鼠和大鼠存在解剖和生理上的差异可导致再灌注障碍的发生，他们在豚鼠至大鼠肝移 植再灌注30分钟时观察到灌注障碍，但组织学检查未提示有明显超急性排斥反应的发生。而 Linke[4,5]等用大鼠血灌注离体豚鼠肝脏的体外试验发现，用选择素抑制剂后可以减轻豚鼠肝脏的再灌注障碍，减少血小板和粒细胞的聚集和粘附，而选择素被认为与异种排斥反应时血管内皮细胞的激活有关，所以可以认为豚鼠至大鼠异种肝移植后由于超急性排斥反应的发生，导致了供肝的灌注障碍。Hammer[6]等发现在异种血灌注肝脏12分钟后，仅有65%的肝窦内有血流，少于失血性休克时的灌注，这种灌注障碍始于门脉周围区域，也就是血液进入异种微循环以及粒细胞最先接触异种内皮的地方，可见粒细胞和血栓在异种肝移植微循环障碍中起一定作用。
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图2 异种移植组肝细胞内质网扩张，线粒体肿胀 ×4000
图3 肝窦状隙内血小板及中性粒细胞 ×6000
本研究观察到豚鼠至大鼠肝移植再灌注60分钟后移植肝出现血流灌注障碍，肝脏组织经 透视电镜检查可以发现肝细胞的线粒体明显肿胀，线粒体嵴破坏、结构紊乱，内质网扩张、 脱粒，肝细胞狄氏间隙消失，窦状隙内可见到血小板和粒细胞粘附、聚集，血栓形成，肝血 窦部分内皮细胞消失，这些表现与超急性排斥反应的病理表现符合。本研究用多普勒超声对 异种肝移植后移植肝的门脉血液灌注检测发现移植后门脉灌注随时间减少，至移植后60分钟 已明显少于移植初期，而同种移植中移植肝的门脉灌注则无明显差异。因此，可以认为由于 超急性排斥反应的发生，使移植肝微血管内出现大量血栓，堵塞管腔，导致血流灌注障碍， 从而使移植物失活。
, 百拇医药 此外，我们还注意到受体大鼠心肌细胞受损的超微结构变化，考虑其原因可能为超急性排斥反应发生后多器官功能障碍的表现，而心功能障碍可以进一步影响大鼠全身血液动力学，加重供肝的微循环障碍。因此，改善移植后供肝灌注障碍，可以减轻非协调性异种肝移植超急性排斥反应的程度，从而延长移植肝的存活期。
基金项目：上海市科委基金资助项目(98XD14002)
作者简介：芮晓晖(1969-)，男，江苏常州人，上海医科大学附属华山医院主治 医师，博士生。
参考文献
[1] 王轩, 杨甲梅, 严以群等. 大鼠原位肝移植不同术式的探讨[J]. 中华 器官移植杂志, 1998, 4: 76-78.
[2] Delriviere LD, Havaux X, Gibbs P, et al. Basic anatomical and phys iological differences between species should be considered when choosing combina tions for use in models of hepatic xenotransplantation: an investigaton of the g uinea pig -to-rat combination [J].Transplantation, 1998, 66(1):112-115.
, http://www.100md.com
[3] Settaf A, Meriggi F, Van de Stadt J, et al. Delayed rejection of liver xenografts compared to heart xenografts in the rat [J].Transplant Pro c, 1987,19:1155-1156.
[4] Linke R, Wagner F,Terajima H, et al. Prevention of initial perfusi on failure during xenogeneic ex vivo liver perfusion by selectin inhibition [J ].Transplantation, 1998, 66(10): 1265-1267.
[5] Linke R, Wngner F, Hammer C. Analysis of the microcircula tion during xenogeneic liver perfusion in the guinea pig -rat model. The contrib ution of leukocytes to the rejection process [J].Transpl Int, 1998,11 Suppl 1: S457-460.
[6] Hammer C, Linke R, Seehofer D, et al. Xenogenei c rejection mechanisms shown by intravital microscopy [J].Transplant Proc. 199 8, 30(8):4166-4167.
收稿日期：2000-02-21, http://www.100md.com
单位：芮晓晖 蔡端 张群华 孙鹏 张延龄(上海医科大学附属华山医院外科教研室,200040)
关键词：异种肝移植；超急性排斥反应；超微结构
肝胆胰外科杂志000217 摘 要 目的: 探讨非协调性异种肝移植供肝再灌注障碍与超急性排斥反应的可能关系。方法:应用改良缝合法建立豚鼠至大鼠的肝移植动物模型，观察供肝再灌注60分钟内门脉灌注和肝脏组织超微结构的变化。结果:移植后60分钟供肝门脉灌注明显减少；肝细胞的线粒体明显肿胀，线 粒体嵴破坏、结构紊乱，内质网扩张、脱粒，肝细胞狄氏间隙消失，肝血窦内可见到血小板 和粒细胞粘附、聚集和血栓形成，部分内皮细胞消失。受体心肌细胞肿胀，肌原纤维排列紊 乱、疏松化和断裂，线粒体呈多形性，大小不等。结论:豚鼠至大鼠非协调性异种肝移植60分钟时有超急性排斥反应的发生， 从而导致供肝的灌注障碍，同时心肌的受损可以进一步加重供肝的微循环障碍。
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【中图分类号】 R364.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1007-1954(2000)02-0090-03
The ultrastructural changes and reperfusi on disturbance of the xenograft following discordant liver xenotransplantation
RUI Xiao-hui,CAI Duan,ZHANG Qun-hua,et al.
(Department of Surgery,Hua shan Hospital of Shanghai Medical University,Shanghai,200040)
Abstract Objective： To determine the possible relationship between the ultrastructural changes and reperfusion d isturbance of the xenograft following discordant liver xenotransplantation.Methods： In the Guinea pig to rat liver transplantation model, the p ortal blood flow(PBF) and the ultrastructural changes of xenografts at 0,30 and 60 minutes were observed after transplantation.Results： The re perfusion state of the xenograft was poor after transplantation. Liver ultrastru ctural findings showed swollen mitochondrias, loss of space of Disse, enlarged e ndoplasmic reticulum and leukocytes infiltration.Conclusion： Hy peracute rejection occurred after xenogeneic liver transplatation ,which leads to the hyporeperfusion of the xenografts.
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Key words liver xenograft; reperfusion ; ultrastructure
在同种肝移植中，由于肝脏的耐受原性，许多移植模型都可在不使用免疫抑制剂的情况下存活。但在异种肝移植中，仍不能避免排斥反应的发生。豚鼠与大鼠之间的器官移植属于非协调性异种移植，豚鼠至大鼠的心脏移植已成为成熟的动物模型，而豚鼠至大鼠的肝脏移植的报道尚少，而且报道该模型产生即刻再灌注障碍的程度与受体存活时间相关。为观察非协调性异种肝移植的超急性排斥反应，我们采用改良缝合法进行了豚鼠至大鼠的肝脏移植，对肝脏再灌注情况和肝脏组织学及超微结构变化作了观察，并与大鼠同种肝移植作了比较。
1 材料和方法
1.1 实验动物 供体分别为雄性豚鼠和雄性SD大鼠，体重200～250g，受体动物为雄性SD大鼠，体重250～300g。受体动物术前8小时禁食但不禁水，供体术前不禁食水。
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1.2 异种肝移植 对王轩[1]等人进行同种肝移植方法的基础改进，进行原位肝移植，共10例。
1.3 同种肝移植 采用王轩[1] 改进缝合法进行SD大鼠同种肝移植，共做10例作对照。
1.4 观察指标 在供肝再灌注后观察供肝血流灌注情况，测定仪器、方法及指标为：以Imexlab 9100多普勒超声诊断仪的8mHz探头(产品号X1-9008)正对血流方向，与血管成30～45°夹角，测定移植肝的门脉血流(PBF)， 听取多普勒声音变化，记录测得波形和波幅。测定时采用单向血流方式，避免静脉回流的干扰，同时开启滤波功能，减少杂波影响。分别测定门脉接通后0，30，60分钟时的PBF。移植60分钟后取肝脏尾状叶作组织学及透射电镜观察，取心肌组织作透射电镜观察。
1.5 数据处理 所得数据以χ±s表示，用t检验进行分 析。
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2 结果
2.1 异种肝移植超急性排斥反应与时限的关系 PV开放后，同种肝移植供肝立刻均匀充血而呈红色，而异种肝移植表现为由肝脏中央开始的逐步充血，并有区域性斑片状灌注，脾脏和小肠均未见到明显淤血现象，门静脉充盈良好。移植1小时后组织学观察发现：异种肝移植可见到肝中央静脉内有血小板和粒细胞聚集，血栓形成，肝细胞变性，肝细胞结构尚存在(见图1)。而同种肝移植无明显血小板、粒细胞聚集和血栓形成。
图1 异种移植组广泛血栓形成及肝细胞变性 ×400
2.2 移植肝门脉血流灌注与超急性排斥反应的关系(附表) 附表 门静脉接通后不同时限波幅的频率变化(
±s，kHz), http://www.100md.com
0′
30′
60′
同种移植组
0.422±0.014
0.420±0.018
0.421±0.011
异种移植组
0.401±0.016
0.261±0.014**
0.140±0.014**
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与同种移植相比：** P<0.01
2.3 肝脏和心肌超微结构观察 异种肝移植肝脏组织经透视电镜检查可以发现肝细胞的线粒体明显肿胀，线粒体嵴破坏、结构紊乱，内质网扩张、脱粒，肝细胞狄氏间隙消失，肝细胞窦状隙内可见到血小板和粒细胞粘附、聚集，血栓形成，部分内皮细胞消失(见图2、3)。在电镜下可见到心肌细胞肿胀，肌原纤维排列紊乱、疏松化和断裂，线粒体呈多形性、大小不等。同种肝移植肝细胞线粒体轻度肿胀，窦状隙无血小板和粒细胞粘附，心肌纤维排列整齐。
3 讨论
众多资料表明肝移植术后排斥反应的发生率及程度比其他器官移植较低，从而人们也将肝脏视作一个免疫特惠器官。但是豚鼠至大鼠的原位肝移植属于非协调性异种移植，可发生超急性排斥反应。导致非协调性异种移植超急性排斥反应的主要因素为受体内天然抗体的作用、补体的参与、供体内皮细胞 的活化以及受体凝血系统的作用等。为数不多的文献报道均表明豚鼠至大鼠原位肝移植后发生严重的再灌注障碍，而且与受体的存活期相关 [2,3]。Delriviere[2]等 认为豚鼠和大鼠存在解剖和生理上的差异可导致再灌注障碍的发生，他们在豚鼠至大鼠肝移 植再灌注30分钟时观察到灌注障碍，但组织学检查未提示有明显超急性排斥反应的发生。而 Linke[4,5]等用大鼠血灌注离体豚鼠肝脏的体外试验发现，用选择素抑制剂后可以减轻豚鼠肝脏的再灌注障碍，减少血小板和粒细胞的聚集和粘附，而选择素被认为与异种排斥反应时血管内皮细胞的激活有关，所以可以认为豚鼠至大鼠异种肝移植后由于超急性排斥反应的发生，导致了供肝的灌注障碍。Hammer[6]等发现在异种血灌注肝脏12分钟后，仅有65%的肝窦内有血流，少于失血性休克时的灌注，这种灌注障碍始于门脉周围区域，也就是血液进入异种微循环以及粒细胞最先接触异种内皮的地方，可见粒细胞和血栓在异种肝移植微循环障碍中起一定作用。
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图2 异种移植组肝细胞内质网扩张，线粒体肿胀 ×4000
图3 肝窦状隙内血小板及中性粒细胞 ×6000
本研究观察到豚鼠至大鼠肝移植再灌注60分钟后移植肝出现血流灌注障碍，肝脏组织经 透视电镜检查可以发现肝细胞的线粒体明显肿胀，线粒体嵴破坏、结构紊乱，内质网扩张、 脱粒，肝细胞狄氏间隙消失，窦状隙内可见到血小板和粒细胞粘附、聚集，血栓形成，肝血 窦部分内皮细胞消失，这些表现与超急性排斥反应的病理表现符合。本研究用多普勒超声对 异种肝移植后移植肝的门脉血液灌注检测发现移植后门脉灌注随时间减少，至移植后60分钟 已明显少于移植初期，而同种移植中移植肝的门脉灌注则无明显差异。因此，可以认为由于 超急性排斥反应的发生，使移植肝微血管内出现大量血栓，堵塞管腔，导致血流灌注障碍， 从而使移植物失活。
, 百拇医药 此外，我们还注意到受体大鼠心肌细胞受损的超微结构变化，考虑其原因可能为超急性排斥反应发生后多器官功能障碍的表现，而心功能障碍可以进一步影响大鼠全身血液动力学，加重供肝的微循环障碍。因此，改善移植后供肝灌注障碍，可以减轻非协调性异种肝移植超急性排斥反应的程度，从而延长移植肝的存活期。
基金项目：上海市科委基金资助项目(98XD14002)
作者简介：芮晓晖(1969-)，男，江苏常州人，上海医科大学附属华山医院主治 医师，博士生。
参考文献
[1] 王轩, 杨甲梅, 严以群等. 大鼠原位肝移植不同术式的探讨[J]. 中华 器官移植杂志, 1998, 4: 76-78.
[2] Delriviere LD, Havaux X, Gibbs P, et al. Basic anatomical and phys iological differences between species should be considered when choosing combina tions for use in models of hepatic xenotransplantation: an investigaton of the g uinea pig -to-rat combination [J].Transplantation, 1998, 66(1):112-115.
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[3] Settaf A, Meriggi F, Van de Stadt J, et al. Delayed rejection of liver xenografts compared to heart xenografts in the rat [J].Transplant Pro c, 1987,19:1155-1156.
[4] Linke R, Wagner F,Terajima H, et al. Prevention of initial perfusi on failure during xenogeneic ex vivo liver perfusion by selectin inhibition [J ].Transplantation, 1998, 66(10): 1265-1267.
[5] Linke R, Wngner F, Hammer C. Analysis of the microcircula tion during xenogeneic liver perfusion in the guinea pig -rat model. The contrib ution of leukocytes to the rejection process [J].Transpl Int, 1998,11 Suppl 1: S457-460.
[6] Hammer C, Linke R, Seehofer D, et al. Xenogenei c rejection mechanisms shown by intravital microscopy [J].Transplant Proc. 199 8, 30(8):4166-4167.
收稿日期：2000-02-21, http://www.100md.com