低密度脂蛋白受体相关蛋白基因、丁基胆碱酯酶基因与Alzheimer病的相关性研究
作者：毕 胜 张 昱 吴 江 王德生 盛雨辰 王守春
单位：毕 胜 王德生 盛雨辰(150001哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科)；张 昱 吴 江 王守春(白求恩医科大学第一临床医学院神经内科)
关键词：Alzheimer病；低密度脂蛋白受体相关蛋白基因；丁基胆碱酯酶基因
临床神经病学杂志000205 【摘要】 目的 探讨中国汉族人低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)基因、丁基胆碱酯酶(BCHE)基因多态性与Alzheimer病(AD)的相关情况。方法 应用PCR-RFLP方法，在38例AD患者和40名正常人中观察LRP和BCHE基因多态性的分布，进行关联分析。结果 AD患者LRP基因C/C纯合子基因型频率及等位基因C频率均高于对照组(P<0.05)，AD患者BCHE基因各基因型频率及等位基因频率与对照组比较均无显著性差异。结论 中国人群中，LRP基因多态性与AD呈正相关；BCHE基因多态性与AD发病无关。
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Study on the relationship between LRP gene,BCHE gene and Alzheimer disease
Bi Sheng, Zhang Yu,Wu Jiang
Department of Neurology,the First Clinical College of Harbin Medical University,Harbin 150001
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between LRP gene,BCHE gene polymorphism and Alzheimer disease(AD) in Chinese.Methods The gene polymorphism distribution of LRP and BCHE was observed in 38 AD patients and 40 controls with PCR-RFLP methods,and was analysed relatedly as well.Results The frequencies of LRP gene C/C homozygote genotype and C allele in AD patients were higher than in the controls (P<0.05),There was no remarkable difference between each genotype frepuency of BCHE gene,the frepuency of allele in AD patients and the controls.Conclusions In Chinese LRP gene polymorphism was positive correlation to AD.There was no association between BCHE gene polymorphism and AD.
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【Key words】 Alzheimer disease LRP gene BCHE gene
Alzheimer病(AD)具有遗传异质性。在脑组织中，低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)作为载脂蛋白E(apoE)的主要受体，参与神经修复过程中脂类的修复作用。近年发现，在AD患者脑内老年斑、神经原纤维缠结和淀粉样血管病变中发现有丁基胆碱酯酶(BCHE)活性的改变[1，2]。因此，作为AD的两种病理伴随性物质，LRP基因、BCHE基因与AD的相互关系受到了普遍关注。我国尚未见这方面的报道。本研究应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术，观察AD患者LRP基因和BCHE基因多态性的分布，并对它们与AD的相互关系及在AD患者中的相互影响进行探讨。
1 对象与方法
1.1 对象 AD组38例，男21例，女17例，年龄60～79岁，平均70.2±6.7岁；均为1997年10月～1999年2月在哈医大一院和白求恩医大一院神经科门诊和住院治疗的AD患者，根据美国精神病学会诊断和统计手册第4版痴呆诊断标准(DSM-IV)作出痴呆的诊断，再根据美国国立神经病语言障碍卒中研究所和AD及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)[3]标准作出AD的诊断。对照组40名，男24名，女16名，年龄60～81岁，平均68.1±4.3岁。均为健康老年人，两组研究对象均为随机选择，无血缘关系。
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1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 按常规方法提取外周血白细胞基因组DNA。
1.2.2 LRP基因型检测[4] 引物为5'-GGGGTCCAGGACTGCATGTA-3'和5'-AAGT-CCGTACCTCGGCAGTG-3'。PCR反应体积为25 μl，内含50 ng基因组DNA，1.25 U Taq DNA聚合酶，200 μmol/L dNTPs，引物各0.25 μmol/L，反应程序为94℃3分钟，32周期(94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒)，72℃3 分钟。取PCR产物(59 bp) 5 μl，加5 U RsaI内切酶，37℃酶切过夜后，12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物，产生两种不同长度的片段，只有51 bp片段的可视为纯合基因型T/T，只有32 bp片段的可视为纯合基因型C/C，有51 bp和32 bp两个片段的可视为杂合基因型C/T(图1)。
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图1 LRP基因型检测结果
1 纯合基因型T/T； 2 纯合基因型C/C; 3 杂合基因型C/T;
4 PCR产物(分子量大小为59 bp)；M 核苷酸分子量标准为pBR322DNA/HaeⅢ
1.2.3 BCHE基因型检测[5] 引物为5'-ATATTTTACAGGAAATATTGATGTA-3'和5'-ATTAGAGACCCACACAACTT-3'。PCR反应体积为25 μl，内含50 ng基因组 DNA，1.5U Taq DNA聚合酶，200 μmol/L dNTPs，引物各0.25 μmol/L，反应程序为94℃1 分钟，35周期(94℃20秒,53℃20秒，72℃20秒)。取PCR产物(137 bp) 5 μl，加5U MaeⅢ内切酶，37℃酶切过夜后，2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，产生两种不同长度的片段，只有137 bp片段的(无酶切位点)可视为纯合基因型 W/W，只有115 bp片段的可视为纯合基因型 K/K，有115 bp和137 bp两个片段的可视为杂合基因型 K/W(图2)。
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图2 BCHE基因型检测结果
1 纯合基因型W/W; 2、3 纯合基因型K/K;
4 杂合基因型K/W；M 核苷酸分子量标准pBR322DNA/MspⅠ
1.2.4 统计学处理 计算各等位基因和基因型频率的分布；吻合度检验确定是否符合Hardy-Weinberg平衡；计算相对危险率(RR)；对AD与LRP基因或BCHE基因多态性进行关联分析。
2 结 果
2.1 AD患者与正常人LRP各等位基因和基因型频率分布 见表1。结果表明：AD与等位基因C正关联(RR=2.648，P<0.05)；与基因型C/C正关联(RR=2.952，P<0.05)。
表1 各组低密度脂蛋白受体相关
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蛋白(LRP)基因型和等位基因频率分布 组别
例数
基因型
等位基因
C/C
C/T
T/T
C
T
AD组
38
0.816*
0.158
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0.026
0.895*
0.105
对照组
40
0.600
0.325
0.075
0.763
0.237
与对照组比较*P<0.05
2.2 AD患者与正常人BCHE各等位基因和基因型频率分布 见表2。结果表明：AD与BCHE各等位基因、基因型均无关联(均P>0.05)。
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表2 各组丁基胆碱酯酶(BCHE)基因型和等位基因频率分布 组别
例数
基因型
等位基因
W/W
W/K
K/K
W
K
AD组
38
0.632
0.342
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0.026
0.803
0.197
对照组
40
0.625
0.325
0.050
0.788
0.212
2.3 BCHE基因多态性在LRP基因各基因型中的分布 见表3。结果表明：在3种LRP基因型中，BCHE基因多态性均与AD无关联。
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表3 3种BCHE基因型在LRP基因各基因型中的分布(例) 基因型
LRP C/C
LRP C/T+T/T
AD组
对照组
AD组
对照组
W/W
19
16
5
9
, http://www.100md.com W/K
11
7
2
6
K/K
1
1
0
1
3 讨 论
在中枢神经系统中，LRP是apoE的主要受体。LRP基因位于第12号染色体上，全长92 Kb，由89个外显子组成。LRP基因外显子3的多态性位点位于LRP cDNA的第766核苷酸，由硷基C或T构成，相应地产生3种LRP基因型：C/C、C/T和T/T。这种多态性变化不改变氨基酸的序列，不产生或破坏限制酶切位点[6]。本研究在中国汉族人群中检测了LRP基因多态性与AD的相互关系，并对AD患者中两者间的相互影响进行了探讨，发现LRP等位基因C、基因型 C/C与AD正关联，此与文献[6,7]报道一致；表明中国人LRP基因多态性与AD关联是由LRP基因C/C型所致，C/C型在AD患者中过度表达，导致AD组与对照组比较产生显著性差异(P<0.05)。
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BCHE基因位于第 3号染色体上，至少存在7种以上的遗传变异。BCHE基因的多态性位点位于BCHE cDNA的第1615核苷酸，由硷基G或A构成，相应地产生3种BCHE基因型：W/W、K/W和K/K。当该位点发生由G到A的替代时，会发生Ala 539 Thr氨基酸替代，同时使得BCHE的活性降低。Lehmann等[8]报道携带有较高频率的BCHE-K的患者易患AD，而本研究发现BCHE-K多态与AD无关联；表明在中国人群中，BCHE基因多态性并不构成AD的危险因子。这与文献[9，10]报道相符，可能由于BCHE基因多态受很多因素，如种族、地理环境等的影响，值得进一步探讨。 另外，在AD患者中，BCHE基因多态性与LRP基因多态性之间无明显的相互影响。
目前的实验结果证实 LRP基因多态性是AD发病的一个危险因子，初步显示BCHE基因与AD遗传易感性无关。我们拟在有关研究基础上，进一步深入探索AD的病因及与诊断或预测有关的分子生物学指标。
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参 考 文 献
1.Geula C,Mesulam MM.Cholinesterases and the pathology of Alzheimer's disease.Alzheimer Dis Assoc Disord,1995,9:23
2.Gomez-Ramos P, Bouras C, Moran MA. Ultrastructural localization of butyrylcholinesterase on neurofibrillary degeneration sites in the brains of aged and Alzheimer's disease patients.Brain Res,1994,640:17
3.McKhann G,Drachman D,Folstein M,et al.Clinical diagnosis of Alzheimer's disease:report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the Auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease.Neurology ,1984,34:939
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4.Hollenbach E, Ackermann S, Hyman BT, et al. Confirmation of an association between a polymorphism in exon 3 of the low- density lipoprotein receptor-related protein gene and Alzheimer's disease .Neurology,1998,50:1905
5.Jensen FS, Nielsen LR, Schwartz M. Detection of the plasma cholinesterase K variant by PCR using an amplification-created restriction site.Hum Hered,1996,46:26
6.Kang DE,Saitoh T,Chen X,et al.Genetic association of the low-density lipoprotein receptor-related protein gene(LRP) , an apolipoprotein E receptor,with late-onset Alzheimer's disease.Neurology,1997,49:56
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7.Lambert JC,Wavrant-de Vrieze F,Amouyel P, et al. Association at LRP locus with sporadic late-onset Alzheimer's disease.Lancet,1998,351:1787
8.Lehmann DJ, Johnston C, Smith AD. Synergy between the genes for butyrylcholinesterase K variant and apolipoprotein E4 in late onset confirmed Alzheimer disease.Hum Mol Genet,1997,6:1933
9.Singleton AB,Smith G,Gibson AM,et al. No association between the K variant of the butyrylcholinesterase gene and pathologically confirmed Alzheimer's disease.Hum Mol Genet,1998,7:937
10.Brindle N, Song E, Rogaeva S, et al. Analysis of the butyrylcholinesterase gene and nearby chromosome 3 markers in Alzheimer disease.Hum Mol Genet,1998,7:933
(收稿1999-04-05 修回1999-09-02), http://www.100md.com
单位：毕 胜 王德生 盛雨辰(150001哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科)；张 昱 吴 江 王守春(白求恩医科大学第一临床医学院神经内科)
关键词：Alzheimer病；低密度脂蛋白受体相关蛋白基因；丁基胆碱酯酶基因
临床神经病学杂志000205 【摘要】 目的 探讨中国汉族人低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)基因、丁基胆碱酯酶(BCHE)基因多态性与Alzheimer病(AD)的相关情况。方法 应用PCR-RFLP方法，在38例AD患者和40名正常人中观察LRP和BCHE基因多态性的分布，进行关联分析。结果 AD患者LRP基因C/C纯合子基因型频率及等位基因C频率均高于对照组(P<0.05)，AD患者BCHE基因各基因型频率及等位基因频率与对照组比较均无显著性差异。结论 中国人群中，LRP基因多态性与AD呈正相关；BCHE基因多态性与AD发病无关。
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Study on the relationship between LRP gene,BCHE gene and Alzheimer disease
Bi Sheng, Zhang Yu,Wu Jiang
Department of Neurology,the First Clinical College of Harbin Medical University,Harbin 150001
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between LRP gene,BCHE gene polymorphism and Alzheimer disease(AD) in Chinese.Methods The gene polymorphism distribution of LRP and BCHE was observed in 38 AD patients and 40 controls with PCR-RFLP methods,and was analysed relatedly as well.Results The frequencies of LRP gene C/C homozygote genotype and C allele in AD patients were higher than in the controls (P<0.05),There was no remarkable difference between each genotype frepuency of BCHE gene,the frepuency of allele in AD patients and the controls.Conclusions In Chinese LRP gene polymorphism was positive correlation to AD.There was no association between BCHE gene polymorphism and AD.
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【Key words】 Alzheimer disease LRP gene BCHE gene
Alzheimer病(AD)具有遗传异质性。在脑组织中，低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)作为载脂蛋白E(apoE)的主要受体，参与神经修复过程中脂类的修复作用。近年发现，在AD患者脑内老年斑、神经原纤维缠结和淀粉样血管病变中发现有丁基胆碱酯酶(BCHE)活性的改变[1，2]。因此，作为AD的两种病理伴随性物质，LRP基因、BCHE基因与AD的相互关系受到了普遍关注。我国尚未见这方面的报道。本研究应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术，观察AD患者LRP基因和BCHE基因多态性的分布，并对它们与AD的相互关系及在AD患者中的相互影响进行探讨。
1 对象与方法
1.1 对象 AD组38例，男21例，女17例，年龄60～79岁，平均70.2±6.7岁；均为1997年10月～1999年2月在哈医大一院和白求恩医大一院神经科门诊和住院治疗的AD患者，根据美国精神病学会诊断和统计手册第4版痴呆诊断标准(DSM-IV)作出痴呆的诊断，再根据美国国立神经病语言障碍卒中研究所和AD及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)[3]标准作出AD的诊断。对照组40名，男24名，女16名，年龄60～81岁，平均68.1±4.3岁。均为健康老年人，两组研究对象均为随机选择，无血缘关系。
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1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 按常规方法提取外周血白细胞基因组DNA。
1.2.2 LRP基因型检测[4] 引物为5'-GGGGTCCAGGACTGCATGTA-3'和5'-AAGT-CCGTACCTCGGCAGTG-3'。PCR反应体积为25 μl，内含50 ng基因组DNA，1.25 U Taq DNA聚合酶，200 μmol/L dNTPs，引物各0.25 μmol/L，反应程序为94℃3分钟，32周期(94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒)，72℃3 分钟。取PCR产物(59 bp) 5 μl，加5 U RsaI内切酶，37℃酶切过夜后，12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物，产生两种不同长度的片段，只有51 bp片段的可视为纯合基因型T/T，只有32 bp片段的可视为纯合基因型C/C，有51 bp和32 bp两个片段的可视为杂合基因型C/T(图1)。
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图1 LRP基因型检测结果
1 纯合基因型T/T； 2 纯合基因型C/C; 3 杂合基因型C/T;
4 PCR产物(分子量大小为59 bp)；M 核苷酸分子量标准为pBR322DNA/HaeⅢ
1.2.3 BCHE基因型检测[5] 引物为5'-ATATTTTACAGGAAATATTGATGTA-3'和5'-ATTAGAGACCCACACAACTT-3'。PCR反应体积为25 μl，内含50 ng基因组 DNA，1.5U Taq DNA聚合酶，200 μmol/L dNTPs，引物各0.25 μmol/L，反应程序为94℃1 分钟，35周期(94℃20秒,53℃20秒，72℃20秒)。取PCR产物(137 bp) 5 μl，加5U MaeⅢ内切酶，37℃酶切过夜后，2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，产生两种不同长度的片段，只有137 bp片段的(无酶切位点)可视为纯合基因型 W/W，只有115 bp片段的可视为纯合基因型 K/K，有115 bp和137 bp两个片段的可视为杂合基因型 K/W(图2)。
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图2 BCHE基因型检测结果
1 纯合基因型W/W; 2、3 纯合基因型K/K;
4 杂合基因型K/W；M 核苷酸分子量标准pBR322DNA/MspⅠ
1.2.4 统计学处理 计算各等位基因和基因型频率的分布；吻合度检验确定是否符合Hardy-Weinberg平衡；计算相对危险率(RR)；对AD与LRP基因或BCHE基因多态性进行关联分析。
2 结 果
2.1 AD患者与正常人LRP各等位基因和基因型频率分布 见表1。结果表明：AD与等位基因C正关联(RR=2.648，P<0.05)；与基因型C/C正关联(RR=2.952，P<0.05)。
表1 各组低密度脂蛋白受体相关
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蛋白(LRP)基因型和等位基因频率分布 组别
例数
基因型
等位基因
C/C
C/T
T/T
C
T
AD组
38
0.816*
0.158
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0.026
0.895*
0.105
对照组
40
0.600
0.325
0.075
0.763
0.237
与对照组比较*P<0.05
2.2 AD患者与正常人BCHE各等位基因和基因型频率分布 见表2。结果表明：AD与BCHE各等位基因、基因型均无关联(均P>0.05)。
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表2 各组丁基胆碱酯酶(BCHE)基因型和等位基因频率分布 组别
例数
基因型
等位基因
W/W
W/K
K/K
W
K
AD组
38
0.632
0.342
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0.026
0.803
0.197
对照组
40
0.625
0.325
0.050
0.788
0.212
2.3 BCHE基因多态性在LRP基因各基因型中的分布 见表3。结果表明：在3种LRP基因型中，BCHE基因多态性均与AD无关联。
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表3 3种BCHE基因型在LRP基因各基因型中的分布(例) 基因型
LRP C/C
LRP C/T+T/T
AD组
对照组
AD组
对照组
W/W
19
16
5
9
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11
7
2
6
K/K
1
1
0
1
3 讨 论
在中枢神经系统中，LRP是apoE的主要受体。LRP基因位于第12号染色体上，全长92 Kb，由89个外显子组成。LRP基因外显子3的多态性位点位于LRP cDNA的第766核苷酸，由硷基C或T构成，相应地产生3种LRP基因型：C/C、C/T和T/T。这种多态性变化不改变氨基酸的序列，不产生或破坏限制酶切位点[6]。本研究在中国汉族人群中检测了LRP基因多态性与AD的相互关系，并对AD患者中两者间的相互影响进行了探讨，发现LRP等位基因C、基因型 C/C与AD正关联，此与文献[6,7]报道一致；表明中国人LRP基因多态性与AD关联是由LRP基因C/C型所致，C/C型在AD患者中过度表达，导致AD组与对照组比较产生显著性差异(P<0.05)。
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BCHE基因位于第 3号染色体上，至少存在7种以上的遗传变异。BCHE基因的多态性位点位于BCHE cDNA的第1615核苷酸，由硷基G或A构成，相应地产生3种BCHE基因型：W/W、K/W和K/K。当该位点发生由G到A的替代时，会发生Ala 539 Thr氨基酸替代，同时使得BCHE的活性降低。Lehmann等[8]报道携带有较高频率的BCHE-K的患者易患AD，而本研究发现BCHE-K多态与AD无关联；表明在中国人群中，BCHE基因多态性并不构成AD的危险因子。这与文献[9，10]报道相符，可能由于BCHE基因多态受很多因素，如种族、地理环境等的影响，值得进一步探讨。 另外，在AD患者中，BCHE基因多态性与LRP基因多态性之间无明显的相互影响。
目前的实验结果证实 LRP基因多态性是AD发病的一个危险因子，初步显示BCHE基因与AD遗传易感性无关。我们拟在有关研究基础上，进一步深入探索AD的病因及与诊断或预测有关的分子生物学指标。
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参 考 文 献
1.Geula C,Mesulam MM.Cholinesterases and the pathology of Alzheimer's disease.Alzheimer Dis Assoc Disord,1995,9:23
2.Gomez-Ramos P, Bouras C, Moran MA. Ultrastructural localization of butyrylcholinesterase on neurofibrillary degeneration sites in the brains of aged and Alzheimer's disease patients.Brain Res,1994,640:17
3.McKhann G,Drachman D,Folstein M,et al.Clinical diagnosis of Alzheimer's disease:report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the Auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease.Neurology ,1984,34:939
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5.Jensen FS, Nielsen LR, Schwartz M. Detection of the plasma cholinesterase K variant by PCR using an amplification-created restriction site.Hum Hered,1996,46:26
6.Kang DE,Saitoh T,Chen X,et al.Genetic association of the low-density lipoprotein receptor-related protein gene(LRP) , an apolipoprotein E receptor,with late-onset Alzheimer's disease.Neurology,1997,49:56
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7.Lambert JC,Wavrant-de Vrieze F,Amouyel P, et al. Association at LRP locus with sporadic late-onset Alzheimer's disease.Lancet,1998,351:1787
8.Lehmann DJ, Johnston C, Smith AD. Synergy between the genes for butyrylcholinesterase K variant and apolipoprotein E4 in late onset confirmed Alzheimer disease.Hum Mol Genet,1997,6:1933
9.Singleton AB,Smith G,Gibson AM,et al. No association between the K variant of the butyrylcholinesterase gene and pathologically confirmed Alzheimer's disease.Hum Mol Genet,1998,7:937
10.Brindle N, Song E, Rogaeva S, et al. Analysis of the butyrylcholinesterase gene and nearby chromosome 3 markers in Alzheimer disease.Hum Mol Genet,1998,7:933
(收稿1999-04-05 修回1999-09-02), http://www.100md.com